疫苗的發(fā)展與創(chuàng)新：從天花疫苗到新型冠狀病毒疫苗

許麗麗，陳艷，陳征宇，葛衛(wèi)紅，江程，張險峰

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院藥學(xué)部，南京 210008；2.中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，南京 210009；3.國際藥學(xué)聯(lián)合會，荷蘭海牙 999025；4.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 210009；5.湖北省疾病預(yù)防控制中心，武漢 430070)

疫苗一詞是“疫苗之父”巴斯德(Louis Pasteur)為紀(jì)念先驅(qū)者琴納(Edward Jenner)發(fā)明牛痘苗(vaccine)而創(chuàng)造，指由減毒或滅活微生物制成、能夠針對疾病產(chǎn)生免疫力的生物制品。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，疫苗的概念被不斷拓展。世界衛(wèi)生組織(WHO)將疫苗定義為“含有免疫原性物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性、主動性和保護(hù)性宿主免疫，能夠預(yù)防感染性疾病的一類異源性藥學(xué)產(chǎn)品，包括預(yù)防和治療性疫苗”[1]。

回顧人類歷史，疫苗作為人類與疾病斗爭的有力武器，消滅或控制了許多傳染病。接種疫苗是當(dāng)前人類預(yù)防傳染病最有效、最經(jīng)濟(jì)的措施之一。通過大范圍接種疫苗，1979年WHO宣布全球范圍內(nèi)消滅了天花。脊髓灰質(zhì)炎、鼠疫、麻疹、狂犬病、百日咳、破傷風(fēng)、乙型病毒性肝炎(乙肝)等發(fā)病率也通過接種疫苗大幅降低。

1 疫苗發(fā)展簡史

將異物引入人體以防止病原體入侵的做法始于我國11世紀(jì)，當(dāng)時人們將天花痊愈者皮膚痘痂研磨成粉，吹入健康兒童鼻腔以預(yù)防天花[2]。該技術(shù)傳到歐洲后，英國醫(yī)生琴納于18世紀(jì)末對其進(jìn)行了改進(jìn)，用毒性明顯減小的牛痘代替人痘。疫苗的研發(fā)也以此為開端，進(jìn)入了漫長的的發(fā)展歷程。

疫苗從誕生至今，其技術(shù)發(fā)展經(jīng)歷了3次革命[3]。第一次始于19世紀(jì)末，巴斯德研制成功雞霍亂疫苗、羊炭疽疫苗和狂犬疫苗，并利用生物傳代和物理化學(xué)方法處理病原體，得到減毒和滅活疫苗；第二次發(fā)生在20世紀(jì)80年代，其標(biāo)志是以酵母制造乙肝疫苗。這一階段，以重組DNA技術(shù)為代表的分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使疫苗的研究從整體病原體水平進(jìn)階到分子水平；第三次是20世紀(jì)90年代研制成功核酸疫苗，該技術(shù)最早由美國的沃夫(Wolff)等發(fā)明。

截至2017年底，全球共有預(yù)防性疫苗77種，可預(yù)防疾病41種[4]。人類疫苗發(fā)展概況見表1[5]。

表1 人類疫苗發(fā)展概況Tab.1 Outline of the development of human vaccines

2 疫苗的種類

疫苗種類繁多，根據(jù)研制技術(shù)、疫苗性質(zhì)、國家規(guī)劃、預(yù)防種類、使用方法及用途等分類，見表2。筆者在本文簡要介紹按研制技術(shù)分類的主要疫苗。

表2 疫苗分類Tab.2 Classification of vaccines

2.1傳統(tǒng)疫苗

2.1.1減毒活疫苗 減毒活疫苗是將細(xì)菌、病毒等病原體及其代謝物，通過培養(yǎng)繁殖或接種于培養(yǎng)物(如動物宿主、雞胚、組織、細(xì)胞等)生長繁殖等處理后，使其毒性減弱，接種到人體，引發(fā)免疫反應(yīng)的疫苗[6]。減毒活疫苗是傳統(tǒng)疫苗，尤其是病毒性疫苗的主要研制方向，其研發(fā)關(guān)鍵是選擇和培育毒性適合、致敏性低、遺傳性質(zhì)穩(wěn)定的菌種或毒種。常用的減毒方法有體內(nèi)/外傳代減毒法、低溫培養(yǎng)篩選法和誘變法[1]。

2.1.2滅活疫苗 滅活疫苗是采用適宜的培養(yǎng)方法繁殖大量病原體后，再用物理(高溫)或者化學(xué)(甲醛水溶液或β-丙內(nèi)酯等)方法滅活，保留其免疫原性而制得的疫苗。一般選用抗原性廣、穩(wěn)定性高的菌種或毒種，因其毒性較強(qiáng)。

為保證遺傳穩(wěn)定性，需要對病原微生物進(jìn)一步純化，如挑選單個菌落或病毒空斑，經(jīng)傳代增殖后與原始病原體比較，確保純化前后重要保護(hù)區(qū)域核苷酸或氨基酸序列不變[7]。接種滅活疫苗后病原體不在體內(nèi)繁殖，只誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生記憶性B淋巴細(xì)胞，不產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞，故免疫作用弱，需要多次接種并加強(qiáng)免疫。且由于滅活制備的疫苗混有培養(yǎng)基或培養(yǎng)液等雜質(zhì)，接種反應(yīng)較重。

2.1.3亞單位疫苗 通過化學(xué)分解或有控制性的蛋白質(zhì)水解方法，提取病原體上的特異性免疫原成分(肽、蛋白質(zhì)或多糖)，篩選出具有免疫活性的片段制成的疫苗稱為亞單位疫苗，也稱組分疫苗[8]。與滅活疫苗相比，其成分簡單，不良反應(yīng)減少，但免疫原性較低，需要加入佐劑來增強(qiáng)免疫原性。例如，無細(xì)胞百日咳疫苗由百日咳桿菌中的保護(hù)性抗原(百日咳毒素、絲狀血凝素等)制得，免疫效果與全細(xì)胞百日咳相似，但安全性大大增強(qiáng)[9]。目前廣泛使用的傷寒Vi多糖疫苗、23價肺炎球菌多糖疫苗和腦膜炎球菌多糖疫苗等采用細(xì)菌莢膜中的長鏈或短鏈糖分子制備，這種多糖是T細(xì)胞非依賴型抗原，接種后T細(xì)胞不被活化，并且不形成免疫記憶，只會刺激B細(xì)胞反應(yīng)，主要產(chǎn)生IgM抗體，因此多糖疫苗對不滿2歲的嬰幼兒、老年人及一些免疫缺陷的患者缺乏有效免疫效應(yīng)[10]。

為解決上述問題，有研究發(fā)現(xiàn)通過將多糖和蛋白質(zhì)耦聯(lián)后的多糖結(jié)合疫苗能夠啟動T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生高親和力的多糖特異性IgG 抗體及免疫記憶，令免疫效果變得持久[11]。此外，部分多糖結(jié)合疫苗也可以作為二聯(lián)疫苗，同時預(yù)防兩種疾病，如b型流感嗜血桿菌-白喉聯(lián)合疫苗。

2.2基因工程疫苗

2.2.1基因工程亞單位疫苗 基因工程亞單位疫苗是利用DNA重組技術(shù)，將編碼病原微生物的保護(hù)性抗原基因克隆并導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)，使之高效表達(dá)后通過純化制得的疫苗，又稱重組亞單位疫苗[9]。目前使用的表達(dá)系統(tǒng)有細(xì)菌、病毒、酵母和哺乳動物細(xì)胞等。

這種疫苗接種后由單一蛋白誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，安全性較高，而且成本低廉，易于生產(chǎn)，但和傳統(tǒng)亞單位疫苗一樣，免疫原性低，往往需要改變抗原構(gòu)象和展示方式或添加合適的佐劑提高免疫原性，如制成病毒樣顆粒(virus-like particles，VLP)疫苗和納米顆粒(nanoparticle，NP)疫苗[12]。第一個成功研發(fā)的基因工程亞單位疫苗是1986年上市的以酵母為表達(dá)系統(tǒng)的重組乙肝疫苗，目前已取代血源乙肝疫苗(傳統(tǒng)亞單位疫苗)，成為乙肝疫苗的主要應(yīng)用類型[7]。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)、戊型肝炎病毒由于難以人工培養(yǎng)，無法采用傳統(tǒng)技術(shù)研制疫苗，而基因工程技術(shù)很好地攻克了這一難題。

2.2.2基因工程活載體疫苗 基因工程活載體疫苗又稱重組活載體疫苗，是指把外源基因重組到用基因工程技術(shù)構(gòu)建的細(xì)菌或病毒載體上，表達(dá)保護(hù)性抗原基因的活疫苗[8]。載體疫苗根據(jù)在人體內(nèi)的繁殖特點，可分為復(fù)制型和復(fù)制缺陷型(即非復(fù)制型)[13]。為保證疫苗的安全性，載體通常使用特定微生物的疫苗株，如痘病毒、腺病毒、皰疹病毒、沙門菌、乳酸菌以及李斯特菌等，脂質(zhì)體、病毒樣顆粒和免疫刺激復(fù)合物亦可用于疫苗傳遞系統(tǒng)[14]。

該類疫苗可誘導(dǎo)多重免疫應(yīng)答，包括體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫，免疫效果接近自然產(chǎn)生，載體自身可以增強(qiáng)免疫原性，不需要添加佐劑?；蚬こ袒钶d體疫苗同時具有活疫苗免疫效果好、成本低廉以及滅活疫苗安全穩(wěn)定的優(yōu)勢，還易于構(gòu)建多價、多聯(lián)疫苗，取得一針預(yù)防多病的作用，并且用量小，免疫作用時間持久，是目前疫苗研究的熱點方向[15]。目前，該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到埃博拉病毒、人類免疫缺陷病毒、流感病毒等的疫苗研發(fā)當(dāng)中[16]。

但是，基因工程活載體疫苗存在較大缺陷，如病毒重組后毒性增加或突變?yōu)槠渌虏《?，威脅人體安全；二次免疫時對載體自身易形成排斥反應(yīng)等，是該類疫苗推廣應(yīng)用的最大問題。

2.2.3基因缺失疫苗 基因缺失疫苗是用分子生物學(xué)技術(shù)將病原體的毒素基因全部或部分去除，獲得定向缺失突變的活疫苗，在保留其免疫原性的同時，防止了疫苗株毒性的恢復(fù)(即返祖現(xiàn)象)，較傳統(tǒng)活疫苗更安全有效[7]。其誘導(dǎo)的是強(qiáng)大而持久的免疫應(yīng)答，包括黏膜免疫，適用于局部接種。如刪除狂犬病病毒的磷酸化蛋白基因 (M基因)，制成重組狂犬病病毒活疫苗，注射后可迅速誘發(fā)人體強(qiáng)大的免疫反應(yīng)[17]。

2.2.4合成肽疫苗 在病原體的抗原決定簇中，對免疫應(yīng)答起關(guān)鍵作用的只有小部分抗原核苷酸序列。利用蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)，將這部分基因序列人工合成出具有免疫活性的保護(hù)性多肽或抗原表位制成的疫苗稱為合成肽疫苗[18]。這類疫苗解決了某些病原微生物不能大量體外培養(yǎng)或生長滴度低的問題，還能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞反應(yīng)，免疫時間長。合成肽疫苗不含核酸成分，因此安全性很高，且成本低，易于生產(chǎn)，是目前研發(fā)感染性疾病和惡性腫瘤新型疫苗的熱門方向之一。但其存在免疫原性低、需要合適的載體或佐劑，篩選和組裝抗原表位的技術(shù)不夠成熟等問題[19]。

2.3核酸疫苗 核酸疫苗是將抗原基因(DNA或RNA)定向?qū)霗C(jī)體細(xì)胞，使其表達(dá)相應(yīng)抗原，從而獲得對該抗原蛋白免疫應(yīng)答的疫苗。其特殊之處在于該類疫苗由基因即核酸本身制成，而不是基因表達(dá)產(chǎn)物、病原微生物或載體。核酸疫苗分為DNA疫苗和RNA疫苗。

DNA疫苗免疫機(jī)體后能誘導(dǎo)MHC I類和II類T細(xì)胞反應(yīng)以及抗體反應(yīng)，免疫應(yīng)答全面而持久，可獲得接近自然感染的免疫效果[20]。盡管DNA疫苗需要特定輔助系統(tǒng)復(fù)制DNA進(jìn)入細(xì)胞核，但不需要載體或佐劑，性質(zhì)穩(wěn)定，制備簡單，易于大規(guī)模生產(chǎn)。與傳統(tǒng)疫苗和基因工程疫苗相比，DNA疫苗還具備下列優(yōu)勢：可根據(jù)需要引入特定DNA序列，調(diào)控性強(qiáng)；不具有致敏性，接種更安全；同一質(zhì)?？蓪?dǎo)入不同抗原基因獲得多價疫苗；兼具免疫治療和預(yù)防功能等[21]。針對一些目前比較主流的烈性傳染病病原體，例如新型冠狀病毒、寨卡病毒、登革熱、埃博拉病毒等，DNA疫苗通常是主要手段，目前多處于Ⅰ期臨床階段。DNA疫苗有潛在致癌風(fēng)險，其安全性未得到未驗證。

mRNA疫苗技術(shù)是最新的第三代疫苗技術(shù)，mRNA疫苗注入機(jī)體后，在細(xì)胞質(zhì)中翻譯，無需進(jìn)入細(xì)胞核，克服了DNA疫苗遞送系統(tǒng)難題，也不存在整合性突變風(fēng)險[22]。該技術(shù)不僅能全面誘導(dǎo)體液免疫與細(xì)胞免疫應(yīng)答，還可激活免疫應(yīng)答佐劑，同時具有研發(fā)快、產(chǎn)量高、成本低和更容易實現(xiàn)多聯(lián)多價設(shè)計優(yōu)點。針對mRNA疫苗易降解問題，一般用高效mRNA投遞方法來解決，樹突狀細(xì)胞、魚精蛋白、高分子載體和脂質(zhì)納米粒是常用投遞載體[23]。另外，通過mRNA修飾可以改善免疫原性、半衰期和表達(dá)穩(wěn)定性。目前，已在臨床試驗階段的mRNA疫苗有流感病毒疫苗、狂犬病毒疫苗、埃博拉病毒疫苗、寨卡病毒疫苗和新型冠狀病毒疫苗。

3 新型冠狀病毒疫苗研究進(jìn)展

2019年暴發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(簡稱新冠肺炎)疫情，給全球公共衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)帶來巨大負(fù)擔(dān)。截至2021年3月17日，全球已累計確診1.2億例，死亡266萬例。新冠肺炎由新型β冠狀病毒株SARS-CoV-2所致，該病毒利用其刺突蛋白與肺泡細(xì)胞表面血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-2(ACE2)特定受體相互作用，從而感染宿主[24]。目前尚未研制出治療新冠肺炎的特效藥，因此通過接種疫苗來應(yīng)對新冠肺炎是最有效、最經(jīng)濟(jì)的手段。我國在該病毒的疫苗研發(fā)中布局了滅活疫苗、基因工程亞單位疫苗、腺病毒載體疫苗、流感病毒載體疫苗以及核酸疫苗5條較為成熟的技術(shù)路線[25]。除上述技術(shù)路線外，國外尚在研制減毒活疫苗。

據(jù)WHO統(tǒng)計，目前全球新冠病毒臨床候選疫苗共82款，中國參與開發(fā)了13款[26](表3)。

表3 臨床候選新型冠狀病毒疫苗開發(fā)狀況Tab.3 Development status of clinical canditate COVID-19 vaccines 款

4 疫苗的發(fā)展前景

傳統(tǒng)疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗均基于巴斯德疫苗學(xué)方法研制，需要依次分離并培養(yǎng)病原微生物、鑒定保護(hù)性抗原、確定疫苗組方與免疫程序、評價疫苗安全性與有效性。實現(xiàn)上述過程必須提供完整的病原體，并且在體外大量培養(yǎng)以獲得足夠抗原。這種方式研發(fā)周期較長，期間微生物可能發(fā)生抗原漂移或轉(zhuǎn)移導(dǎo)致疫苗效果下降。這些問題促使科學(xué)家們開發(fā)出基于病原體全基因組的新型疫苗學(xué)方法，即反向疫苗學(xué)。即以基因組信息為基礎(chǔ)，在病原體全基因組中篩選出關(guān)鍵抗原，然后將這些抗原高通量克隆、表達(dá)、純化出重組蛋白，再對純化后的抗原進(jìn)行體內(nèi)外評價，最終篩選出保護(hù)性抗原[27]。反向疫苗學(xué)使保護(hù)性抗原的篩選周期由5～10年縮短到2～5年，大大加快了疫苗研發(fā)進(jìn)程。B型腦膜炎球菌疫苗的研制是反向疫苗學(xué)取得成功的一大里程碑。隨著越來越多微生物基因組測序的完成，反向疫苗學(xué)的應(yīng)用將更加廣泛。

除了開發(fā)更高效的抗原篩選技術(shù)，未來疫苗將朝著接種方式更便捷、接種效果更顯著、應(yīng)用范圍更廣泛的方向發(fā)展。隨著疫苗種類的增加，推廣聯(lián)合疫苗勢在必行。聯(lián)合疫苗接種次數(shù)少、預(yù)防疾病種類多、接種率高且不良反應(yīng)少。歐洲已經(jīng)在使用含有白喉、破傷風(fēng)、百日咳、b型流感嗜血桿菌、乙肝和脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的六價組合[2]。另外，可通過不同的接種方式擴(kuò)大免疫途徑。如今大多數(shù)疫苗都是通過腸外注射來接種，誘導(dǎo)的是血液中B細(xì)胞和T細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)免疫反應(yīng)。近年來發(fā)現(xiàn)，黏膜免疫是人體抵抗病原體的第一道屏障，黏膜疫苗成為疫苗研究新方向。作為黏膜疫苗的主要形式，口服疫苗主要引起腸黏膜免疫，目前取得進(jìn)展的口服疫苗有減毒活疫苗、DNA疫苗和轉(zhuǎn)基因植物疫苗。鼻噴疫苗誘導(dǎo)的鼻黏膜免疫反應(yīng)具有對上呼吸道定向免疫的效果，是上呼吸道傳染病疫苗的首選，且不引起免疫耐受[28]。目前國內(nèi)已利用減毒流感病毒載體平臺來開發(fā)鼻噴新冠肺炎疫苗。接種疫苗通常被認(rèn)為是一種預(yù)防措施，但近年來，由于新型疾病的不斷出現(xiàn)、微生物持續(xù)感染日益增多以及抗菌藥物耐藥問題日趨嚴(yán)重，治療性疫苗引起廣泛關(guān)注。其中，對腫瘤的治療性疫苗的研究占據(jù)主導(dǎo)地位。目前，已有上百種治療性腫瘤疫苗處于開發(fā)狀態(tài)，但美國食品藥品管理局(FDA)僅批準(zhǔn)了3種上市，治療性腫瘤疫苗仍需進(jìn)一步研究才能得以推廣應(yīng)用[29]。

人類使用疫苗已有200余年歷史，在預(yù)防和治療多種疾病上取得顯著成效?，F(xiàn)今人類平均壽命較19世紀(jì)延長了數(shù)十年，主要得益于對天花和其他傳染病的控制。在面臨突發(fā)重大傳染病如嚴(yán)重急性呼吸綜合征、H7N9禽流感、埃博拉以及新冠肺炎時，人類不再坐以待斃，而是利用現(xiàn)代生物技術(shù)向病原微生物積極應(yīng)戰(zhàn)。