一種從菲律賓蛤仔黏附細(xì)菌Halomonas sp.GHF11 中提取的多糖絮凝劑的表征其在脫色中的應(yīng)用

穆 軍，蔣廣寧，陳 蔭

（浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

絮凝劑廣泛用于工業(yè)廢水處理、飲用水處理、脫色、重金屬去除、采礦業(yè)和紡織業(yè)等[1]。絮凝劑可以使液體中的膠體顆粒形成較大的顆粒以沉降，因此可用于去除污染廢水的濁度和懸浮固體等。然而無(wú)機(jī)絮凝劑和合成類(lèi)絮凝劑的大量使用，對(duì)環(huán)境產(chǎn)生了二次污染，微生物絮凝劑應(yīng)運(yùn)而生。與傳統(tǒng)絮凝劑相比，微生物絮凝劑有安全，無(wú)毒，環(huán)保且用量少等優(yōu)點(diǎn)[2-3]。生物絮凝劑的組分主要包括蛋白質(zhì)、多糖、核酸和纖維素，其中多糖是主要組分[4]。由于多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性，人們對(duì)胞外多糖的微生物活性進(jìn)行了許多研究[3-5]。胞外多糖是由細(xì)菌和其他微生物分泌的細(xì)胞外聚合物，并且在許多方面表現(xiàn)出良好的活性，例如絮凝和脫色。然而，獲得純多糖產(chǎn)品成本高，產(chǎn)率低，發(fā)酵過(guò)程長(zhǎng)，限制了其廣泛應(yīng)用。因此探究其中的作用機(jī)制，將有利于通過(guò)人工合成、生態(tài)仿生等途徑來(lái)降低絮凝劑的生產(chǎn)成本，促進(jìn)微生物絮凝劑的發(fā)展。

菲律賓蛤仔對(duì)海水有著特殊的絮凝效果，推測(cè)絮凝效果與蛤仔黏附污泥中的微生物有關(guān)。實(shí)驗(yàn)室前期從黏附污泥中篩選出14 株絮凝活性菌株，選取菌株Halomonassp.GHF11，從其發(fā)酵液中提取細(xì)胞外多糖，并通過(guò)柱層析純化多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。該多糖有約70%的絮凝率外，對(duì)染料孔雀石綠的脫色率可達(dá)90%。研究表明，多糖是發(fā)揮絮凝作用的主要活性物質(zhì)。通過(guò)分析多糖的單糖組成、糖苷鍵連接方式來(lái)探究化學(xué)結(jié)構(gòu)與優(yōu)異性能之間的相關(guān)性，有助于理解絮凝機(jī)理并充分發(fā)揮其潛在的應(yīng)用價(jià)值[6]。

本文從絮凝活性菌株的發(fā)酵液中提取微生物多糖，通過(guò)柱層析純化獲得多糖純物質(zhì)，并通過(guò)一系列分析對(duì)純化的多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，包括單糖組成、紅外光譜分析、分子量測(cè)定、甲基化分析，對(duì)其結(jié)構(gòu)的研究有利于對(duì)海洋微生物資源利用，并為新型微生物多糖的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株Halomonassp.GHF11 是從菲律賓蛤仔黏附污泥中篩選獲得，具有較高的絮凝活性。

主要試劑：乙醇、硫酸、苯酚、氯仿、正丁醇、三氟乙酸（TFA）、二甲基亞砜（DMSO）、CH3COOH、吡啶為國(guó)產(chǎn)分析純，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）和乙腈（HPLC 級(jí)），12 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品：D-鼠李糖、D-核糖、D-甘露糖、D -葡萄糖、D-氨基半乳糖、L-巖藻糖、D-葡萄糖醛酸、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-半乳糖、D-氨基葡萄糖、D-半乳糖醛酸。

菌株GHF11 用以下培養(yǎng)基（g·L-1）培養(yǎng)：K2HPO4，5；KH2PO4，2；CO（NH2）2，0.5；（NH4）2SO4，0.2；酵母提取物，0.5；葡萄糖，20；溶于1 L 人工海水（ASW）中，初始pH 為7.5。

人工海水組分（g·L-1）：MgCl2·6H2O，9.68；KCl，0.61；Na2SO4，3.47；NaCl，30.0；Na2HPO4，0.014；NaHCO3，0.17；CaCl2·2H2O，1.36；KBr，0.10；SrCl2·6H2O，0.04 和H3BO3，0.03。

1.2 菌株的發(fā)酵及多糖的提取

將GHF11 接種到500 mL 的燒瓶中，每瓶150 mL，于115 ℃高壓滅菌30 min，并在28 ℃，180 r·min-1培養(yǎng)4 天。使用乙醇沉淀法從發(fā)酵液中提取胞外多糖粗品[7]，將培養(yǎng)液（6 L）高速離心除去菌體及代謝物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮上清液至初始體積的1/10。濃縮液透析后，三倍體積的無(wú)水乙醇緩慢加入其中，充分混合后于4 ℃下放置過(guò)夜，離心收集產(chǎn)生的粗多糖沉淀物。將多糖重新溶解在去離子水中，等體積的Sevag 試劑（其為氯仿和正丁醇（4：1,V：V）的混合溶液）加入到粗多糖溶液中，充分混合，放置30 min，離心以除去其中蛋白質(zhì)。將上層水相濃縮并凍干，得到脫蛋白粗多糖。

1.3 胞外多糖的純化

粗多糖的純化采用JIANG Changxing,et al[8]的方法并稍作修改。將粗多糖重新溶解于5.0 mL 去離子水中，上樣到DEAE-52 纖維素柱（2.5×30 cm），用0、0.1、0.3、0.5 mol·L-1的氯化鈉溶液以1.0 mL·min-1的流速梯度洗脫。用自動(dòng)收集器以5 mL/管收集洗脫液。通過(guò)苯酚-硫酸法測(cè)定多糖，并繪制洗脫曲線[9]。合并相同組分，透析并濃縮。隨后，使用Sephadex G-100 凝膠滲透色譜柱（1.5×50 cm），用去離子水以0.2 mL·min-1的流速洗脫，進(jìn)一步純化濃縮的組分，收集同一洗脫峰下的級(jí)分，濃縮凍干后得到多糖純品。

1.4 絮凝活性的測(cè)定

使用高嶺土懸濁液測(cè)定絮凝活性[10]。在250 mL 燒杯中依次加入93 mL 高嶺土懸濁液液（4 g·L-1），5 mL CaCl2（10 g·L-1）和2 mL 多糖溶液，調(diào)節(jié)pH 至7.5，將混合液在180 r·min-1下劇烈攪拌1.0 min，60 r·min-1下緩慢攪拌2.0 min，最后靜置10 min，用分光光度計(jì)測(cè)量上清液在550 nm 處的吸光度，使用2 mL 去離子水作為空白對(duì)照，所有操作平行3 次，絮凝率通過(guò)以下公式計(jì)算：

FR 代表絮凝率；A 和B 分別是對(duì)照和樣品的吸光度值。

1.5 脫色活性的測(cè)定

脫色活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[11]，脫色率表示為DC。對(duì)3 種染料進(jìn)行脫色實(shí)驗(yàn)，包括亞甲基藍(lán)，結(jié)晶紫和孔雀石綠。移取1 mL 的原液（400，400，1 000 mg·L-1），稀釋至100 mL，調(diào)節(jié)體系pH 7.5～8.0，加入1 mL樣品溶液，然后將混合物緩慢攪拌1 min 并靜置1 h，以9 000g 離心10 min，分別測(cè)量3 種稀釋溶液在660、580 和620 nm 處的吸光度，用去離子水作為參比。脫色活性計(jì)算公式如下：

其中DC 代表脫色率；A0和A 分別是對(duì)照和樣品的吸光度值。

1.6 單糖組成分析

利用HPLC 分析多糖的單糖組成，參考文獻(xiàn)[12]。將200 μL 多糖溶液（2g·L-1）和200 μL 三氟乙酸（2 mol·L-1）在安瓿瓶中混合于110 ℃水解4 h。安瓿瓶冷卻至室溫后，加入500 μL 甲醇并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)至干，重復(fù)加入3 次以除去殘留的三氟乙酸。然后將干燥的水解樣品溶解在200 μL 氫氧化鈉（0.3 mol·L-1）中，與200 μL PMP 甲醇溶液（0.5 mol·L-1）充分混合，在70 ℃下反應(yīng)100 min。冷卻至室溫后，加入200 μL 鹽酸（0.3 mol·L-1）中和。隨后，加入二氯甲烷（1.0 mL）萃取數(shù)次以除去PMP。用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，用于HPLC 分析。同時(shí)，混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化過(guò)程在相同條件下進(jìn)行。PMP 單糖衍生糖的分析在配備有光電二極管陣列檢測(cè)器（Agilent HP 1100，Agilent Technologies，USA）的HPLC 系統(tǒng)上操作。

色譜條件：色譜柱，Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6×250 mm，5 μm，Agilent Technologies，USA）；柱溫，30 ℃；流動(dòng)相，磷酸鹽緩沖鹽（0.1 mol·L-1，pH 6.7），比例為17.8%（V/V%）乙腈；流速，1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量，20 μL；檢測(cè)器波長(zhǎng)，254 nm。

1.7 紅外光譜分析和分子量測(cè)定

將純多糖（1 mg）與KBr（100 mg）充分混合并用紅外線干燥，然后用紅外光譜掃描儀BIO-RAD FTS3000在4 000cm-1～400 cm-1的范圍內(nèi)掃描，掃描速率為1 cm-1。

通過(guò)凝膠滲透色譜柱HPSEC Shodex OH-park SB-805 測(cè)定多糖的分子量。色譜條件如下：柱溫，30 ℃；注射量：20 μL；流速：0.8 mL·min-1；通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖分子量。

1.8 甲基化分析

使用HAKOMORI[13]的方法并稍做修改，對(duì)多糖進(jìn)行甲基化分析。將多糖（1.0 mg）與1.0 mL DMSO 溶解在燒瓶中，快速加入100 mg 無(wú)水氫化鈉，并在室溫下磁力攪拌0.5 h。然后緩慢加入0.5 mL 碘甲烷，在室溫下磁力攪拌反應(yīng)1.5 h，此過(guò)程在氮?dú)獗Ｗo(hù)下避光反應(yīng)。最后，加入1 mL 水終止反應(yīng)，用二氯甲烷從溶液中萃取甲基化多糖3 次。合并萃取液后，用水洗滌二氯甲烷層3 次，減壓干燥二氯甲烷層，得到甲基化多糖。將甲基化多糖溶于0.5 mL 三氟乙酸（2 mol·L-1）中，并在安瓿瓶中于110 ℃密封水解4 h。待安瓿瓶冷卻后，開(kāi)口加入甲醇（1 mL），蒸發(fā)至干，重復(fù)多次除去三氟乙酸，將水解的樣品并溶解在1 mL NaOH 溶液（0.05 mol·L-1）中，加入10 mg NaBH4，并在室溫下反應(yīng)4 h，然后加入2 滴冰醋酸中和直至無(wú)氣泡產(chǎn)生，加入甲醇并蒸發(fā)至干多次以除去硼酸。將樣品干燥并轉(zhuǎn)移到EP 管中，加入0.5 mL 吡啶，將混合物在90 ℃水浴中密封0.5 h。冷卻后，加入0.5 mL 乙酸酐，將混合物在100 ℃水浴中密封1 h。最后，將乙?；瘶悠吩谛D(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)至干，并溶于二氯甲烷（0.5 mL）中，并用水洗滌以除去不溶性鹽和吡啶。將溶液通過(guò)0.45 μm 鋁膜過(guò)濾，用于GC-MS 分析。

氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀條件：離子源溫度，260 ℃；進(jìn)樣口溫度，240 ℃；初始溫度，60 ℃；程序升溫，3 ℃·min-1，240 ℃保溫10 min；色譜柱，DB-WAX（30 m×0.250 mm，0.50 μm，Agilent Technologies，USA）；檢測(cè)器溫度：250 ℃；氦氣流速，1.5 mL·min-1；進(jìn)樣量，1.0 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖的提取純化

使用sevag 試劑進(jìn)行脫蛋白操作，從200～400 nm 的掃描結(jié)果如圖1A，在260 和280 nm 處沒(méi)有特征吸收，表明沒(méi)有蛋白質(zhì)和核酸[14]。使用離子交換柱在水洗條件下洗脫出一個(gè)主要組分（圖1B），通過(guò)SephadexG-100 凝膠滲透色譜進(jìn)一步純化顯示其為單一組分（圖1C）。純化的多糖用于進(jìn)一步的活性分析和結(jié)構(gòu)表征。

圖1 去蛋白后的F11 粗多糖紫外掃描曲線（200～400 nm）（A），F(xiàn)11 菌株胞外粗多糖經(jīng)過(guò)DEAE-52 柱層析所得的洗脫曲線（B）；F11 菌株多糖過(guò)Sephadex G100 層析柱純化的洗脫曲線（C）Fig.1 Ultraviolet scanning of F11 polysaccharide at the wavelength of 200 to 400 nm（A）;elution curve of crude polysaccharide on DEAE-52 column（B）,and elution curves of polysaccharide fraction（C）on Sephadex G-100 column.

2.2 多糖活性測(cè)定

圖2A 顯示了多糖純品在去離子水系統(tǒng)中濃度從0.1 mg·L-1到1.0 mg·L-1的絮凝活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在劑量為0.5 mg·L-1時(shí)，最大絮凝率達(dá)到71.2%，在較少或較高劑量下絮凝活性逐漸降低。圖2B 顯示了多糖劑量范圍為0.5～3.0 mg·L-1時(shí)，對(duì)于孔雀石綠的脫色效果變化曲線，在反應(yīng)劑量1.8 mg·L-1時(shí)，達(dá)到最佳脫色效果92.4%。當(dāng)劑量小于0.5 mg·L-1或超過(guò)3.0 mg·L-1時(shí)，脫色率顯著下降。

圖2 多糖劑量對(duì)絮凝率及脫色活性的影響Fig.2 The effect of F11 polysaccharide dosage on flocculation rate and decolorization activity

2.3 紅外光譜分析

純多糖的組成包括葡萄糖，甘露糖，葡糖胺，核糖和半乳糖。葡萄糖和甘露糖占主要比例，這意味著葡萄糖可能是微生物絮凝劑的基本骨架。核糖，葡糖胺和半乳糖可以是多糖的分支結(jié)構(gòu)。

多糖的分子量確定為約31 kDa。如圖3 所示，在400 和4 000 cm-1之間掃描純化的多糖以分析FT-IR光譜。在3 432 cm-1處的強(qiáng)吸收峰證實(shí)了羥基的存在。1 393 cm-1和1 641 cm-1處的吸收峰是羧酸鹽基團(tuán)的C=O 不對(duì)稱(chēng)和對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)的特征[15]。在1 111cm-1處觀察到的強(qiáng)峰表明糖環(huán)的C-O-C 伸縮振動(dòng)，也是糖衍生物的典型特征[16]。生物絮凝劑中羥基，羧基和羰基的存在可以改善生物絮凝劑中的結(jié)合能力。

圖3 F11 菌株胞外多糖的紅外光譜圖Fig.3 The infrared spectrogram of F11 polysaccharide

2.4 多糖的單糖組成及分子量

反相HPLC 的結(jié)果（圖4）表明多糖是一種雜多糖，其質(zhì)量比由Man，GlcN，Rib，Gal 和Glc 組成，如表1所示。很明顯葡萄糖是含量最多的單糖，甘露糖的比例小于葡萄糖，其余組分如GlcN，Rib，Gal 可忽略不計(jì)。在所有單糖組成中，中性糖（包括D-甘露糖，D-葡萄糖D-核糖和D-半乳糖）占多糖的總質(zhì)量比例為97.8%，而氨基糖（GlcN）僅占2.2%，糖醛酸含量可以忽略不計(jì)。

表1 多糖的各單糖組成比例Tab.1 Monosaccharide composition of polysaccharide

圖4 各單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖（A），F(xiàn)11 菌株胞外多糖PMP 衍生物液相色譜圖（B）Fig.4 HPLC chromatograms of PMP derivatives of standard monosaccharides（A）;hydrolyzed monosaccharides derivatives from F11polysaccharide（B）

2.5 甲基化分析

由于復(fù)雜的組成和特定的分子量，該多糖絮凝劑有著特殊的結(jié)構(gòu)[17-18]。多糖是微生物分泌的胞外物質(zhì)的主要成分，胞外多糖的研究有著重要的意義，然而，關(guān)于微生物胞外多糖絮凝劑分子結(jié)構(gòu)研究很少，揭示絮凝機(jī)制與多糖分子結(jié)構(gòu)的聯(lián)系，仍然需要進(jìn)一步的研究。

通過(guò)GC-MS 分析，獲得質(zhì)譜（圖5）。與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜相比，連接方式由葡萄糖1→2→3→4 連接，甘露糖1→2→3→4→6 連接組成。取代的羥基越多，分支越多。結(jié)合紅外掃描，可以發(fā)現(xiàn)圖4 中顯示的羥基吸收峰較弱，C-O-C 成環(huán)骨架的吸收峰較強(qiáng)，與甲基化分析中的連接方式相吻合。

圖5 F11 胞外多糖衍生物質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectrum of derivative extracellular polysaccharideof F11

2.6 多糖的絮凝機(jī)制

馬尼拉貝黏附污泥可用作絮凝資源，從微生物中提取胞外多糖的研究很多[1,4,17,19-21]。胞外多糖是由微生物分泌的，因此絮凝活性的產(chǎn)生與粘性泥漿中的微生物群落有關(guān)。

廣泛接受的絮凝機(jī)制主要包括壓縮雙電層、電性中和、架橋和網(wǎng)捕卷掃等假設(shè)[22-23]。然而，絮凝機(jī)制不僅是一種機(jī)制的功能，而是多種機(jī)制相互協(xié)同作用的結(jié)果。通過(guò)GC-MS 分析，糖苷鍵連接方式由葡萄糖1→2→3→4 連接，甘露糖1→2→3→4→6 連接組成。結(jié)合紅外光譜中的較弱羥基峰，多糖具有多支鏈網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，多糖的多支鏈結(jié)構(gòu)可促進(jìn)其與懸浮顆粒的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)沉降效果，這與網(wǎng)捕卷掃機(jī)制類(lèi)似。

3 結(jié)論

在該研究中，從菌株F11 的發(fā)酵液中純化出一種新型胞外多糖，可用作微生物絮凝劑，并通過(guò)GCMS，F(xiàn)T-IR，HPLC 分析方法表征胞外多糖。結(jié)果表明，微生物胞外多糖由72.6%葡萄糖和17.6%甘露糖組成。其分子量為31 kDa。高度支化的結(jié)構(gòu)表明對(duì)絮凝和脫色有顯著影響。在去離子水系統(tǒng)中，對(duì)高嶺土的絮凝率達(dá)到71.3%，對(duì)孔雀石綠的脫色率為92.4%。較高的脫色率使其在未來(lái)水處理中有巨大的應(yīng)用前景。絮凝過(guò)程有著復(fù)雜的機(jī)制，為了掌握分子結(jié)構(gòu)和多糖性質(zhì)之間的關(guān)系，需要進(jìn)一步的深入研究。