基于SSR分子標記的桃品種鑒別及指紋圖譜構建

王 淋，敖 敦，包文泉，張淑寧，陳俊興，李鳳鳴，孟繁慶，楊鈺瑩，白玉娥

（1.中國林業(yè)科學研究院 經濟林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.內蒙古農業(yè)大學 草原與資源環(huán)境學院草地資源教育部重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010011；3.內蒙古農業(yè)大學 林學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

桃Amygdalus persicaL.Batsch 為薔薇科Rosaceae 李屬Prunus桃亞屬Amygdalus多年生落葉樹種，原產自中國，是世界四大果樹之一[1]。作為桃的原產地，我國具有極其豐富的桃種質資源，其桃產業(yè)、栽植面積和產量均具全球首位[2]。桃的適應性和抗逆性較強，花色美，果實風味獨特，富含維生素、糖類和蛋白質，營養(yǎng)價值較高，可直接鮮食，還可以加工成桃干、桃果醬、桃罐頭及桃果汁等產品，開發(fā)利用價值巨大。目前，我國栽培的桃種質主要以‘黃金蜜1’、‘黃金蜜13’、‘中桃6’、‘中桃9’和‘中桃13’等10 幾個品種為主[3]，但由于其悠久的栽培歷史和混亂的引種馴化，使我國桃種質出現(xiàn)了很多“同名異物”和“同物異名”；并且桃品種間樹形、葉片、花器官、果實等的形態(tài)特征相似，使得傳統(tǒng)的形態(tài)學分類法難以準確鑒定桃主栽品種，這嚴重地影響了跨地區(qū)間桃品種的引種效率，也給桃種質的栽培管理帶來了很多不確定性[4-5]。隨著分子生物學和生物信息技術的發(fā)展，分子標記技術已廣泛應用于物種鑒定、系統(tǒng)進化、種群遺傳學和分子輔助育種等研究領域。其中，SSR（Simple sequence repeat）分子標記，又稱為微衛(wèi)星標記，具有多態(tài)性高、重復性好、通用性強和共顯性遺傳標記等優(yōu)點，在桃屬及其近緣物種的分子研究中應用最為廣泛[6-8]，但目前利用SSR 分子標記對桃主栽品種開展種質鑒定和指紋圖譜構建的相關研究較少。本研究利用多態(tài)性高、穩(wěn)定性強的15 個SSR 分子標記，對國內外26 個桃主栽品種進行毛細管熒光電泳檢測，開展桃主栽品種的遺傳多樣性和親緣關系分析，對其進行品種鑒別和SSR分子指紋圖譜構建，為國內桃品種的鑒別，以及準確引種和精準栽培管理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試研究材料采集于2018年6月，分別采自內蒙古農業(yè)大學職業(yè)技術學院苗圃、內蒙古林業(yè)科學研究院苗圃、中國林業(yè)科學研究院經濟林研究開發(fā)中心桃基因庫和內蒙古良種繁育中心桃種質資源圃，包括國內外主栽的桃品種26 個（表1），其中國內品種15 個，國外品種11 個。隨機選取生長健壯、無病蟲害的單株，采集嫩葉，液氮速凍帶回實驗室，保存于-80℃下的超低溫冰箱，以備提取基因組DNA。

表1 供試桃品種及來源Table 1 Origins and cultivars of peach in the study

1.2 桃品種基因組DNA 的提取

采用高效植物基因組DNA 提取試劑盒（DP350，天根生化科技（北京）有限公司）提取供試26 個桃主栽品種的基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測所提取DNA 的含量及純度，并將其濃度調至50 ng/μL，保存于-80℃下的超低溫冰箱，以備PCR 反應擴增。

1.3 SSR 引物的篩選及PCR 反應

參考近期發(fā)表的相關文獻，初步選取開發(fā)自桃及其近緣種的48 對SSR 引物供篩選，最終篩選出多態(tài)性高、穩(wěn)定性強且重復性好的15 對SSR 引物，詳細信息見表2。

表2 本研究所用的SSR 引物信息Table 2 Information of SSR primers used in the study

SSR 引物的PCR 擴增反應體系為25 μL，內含1 μL 目標物DNA 模板（20 ng/μL），1 μL 帶熒光標記（NET、FAM、VIC 或PET）的SSR 正向引物，1 μL SSR 反向引物，12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，9.5 μL 無菌去離子水（ddH2O）。PCR 擴增反應條件如下：95℃的預變性5 min；94℃的變性30 s，54～55℃退火35 s，72℃延伸45 s，設置30 次循環(huán)，72℃終延伸5 min 后置于4℃保存。PCR 反應產物經DNA 純化試劑盒純化后用ABI 3500XL（Applied Biosystems，USA）遺傳分析儀檢測其條帶峰度，利用Gene-Marker 軟件讀取每個SSR 位點的片段大小。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用GenAlEx 6.501 軟件[12]分析各SSR 位點的等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、期望雜合度（He）和觀察雜合度（Ho）；基于Arlequin v 3.1 軟件[13]計算各SSR 位點的多態(tài)性信息指數(shù)（PIC）。用Excel 軟件構建26 個桃主栽品種的SSR 分子指紋圖譜。桃主栽品種的聚類分析是根據(jù)各品種間的Nei’s 遺傳相似系數(shù)，由NTSYS PC version 2.10e 軟件的UPGMA 法完成[12-14]。

2 結果與分析

2.1 桃主栽品種的遺傳多樣性

根據(jù)48 對SSR 引物在桃主栽品種的毛細管熒光電泳檢測中的初步結果，篩選出多態(tài)性高、重復性強、無雜帶的15 對SSR 引物，用于后續(xù)26 個桃主栽品種的遺傳多樣性分析和指紋圖譜的構建（表3）。

表3 26 個桃主栽品種在15 個SSR 位點的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of 15 SSR markers in 26 cultivars of peach

由表3可知，供試桃主栽品種在所篩選的15個SSR 位點上的多態(tài)性較高，15 對SSR 引物在26 個桃主栽品種中共檢測到259 個等位基因（Na）和213.41 個有效等位基因（Ne），每個SSR 位點的平均Na和Ne分別為17.27 個和14.23 個；其中，位點BPPCT-025 上檢測到的Na和Ne最多，分別為23 個和20.94 個，而位點pchgms-54 和UDP97-402 上的Na（12 和12 個）和Ne（10.31 和10.04 個）最少；15 個SSR 位點的期望雜合度（He）介于0.24～0.63之間，觀察雜合度（Ho）介于0.29～0.79之間，其平均值分別為0.43 和0.54，表明目前桃主栽品種的遺傳多樣性水平適中。15 個SSR 位點的多態(tài)性信息指數(shù)（PIC）在0.75～0.91 間，其值均大于0.50，表明所選SSR 引物多態(tài)性較高，適用于供試桃主栽品種的物種鑒定、種群遺傳學等相關分析。

2.2 桃主栽品種的SSR 指紋圖譜

根據(jù)供試桃主栽品種在15 個SSR 位點上的毛細管熒光電泳檢測條帶大小，構建了26 個桃主栽品種的SSR 指紋圖譜（圖1）。由圖1可知，單獨的一個SSR 引物無法將供試26 個桃主栽品種鑒別開，只能將26 個桃主栽品種區(qū)分為4～11 組。其中，引物pchgms25 的鑒別能力最強，能鑒別‘天仙紅’、‘慶豐’、‘沙紅桃’、‘砂子早生’、‘松森’、‘NJN9’、‘春蕾’、‘早春紅’、‘中油9’和‘加納巖’等10 個桃品種，可將供試26個桃品種分為11 組；而引物UDP98-408 的鑒別能力最低，將供試26個桃品種分為4組，僅能鑒別‘倉方早生’、‘白風’和‘黃金蜜13’三個桃品種；其余引物的鑒別能力適中，如引物BPPCT-017 和UDP96-003 分別能鑒定‘NJN83’、‘NJN9’、‘春蕾’、‘天仙紅’、‘天仙紅’和‘中油13’等6 個桃品種；引物BPPCT-001 能鑒別‘京玉’、‘松森’、‘加納巖’、‘早春紅’和‘北冰洋之藍’5個桃品種。

圖1 基于15 對SSR 引物的26 個桃主栽品種的指紋圖譜Fig.1 Fingerprinting key of 26 peach cultivars using the 15 SSR markers

26 個桃主栽品種在15 個SSR 位點上的目標片段大小在95～416 bp 之間，其中引物pchgms25 單獨鑒別桃品種的能力最強，若將引物pchgms25 分別與引物PceGA25、UDP96-003、UD98-412-50、UDP98-409、UDP98-406、UDP97-402、Pchgms4-54、BPPCT-001 相結合則能夠將供試26 個桃主栽品種全部鑒別開。

2.3 基于SSR 標記的26 個桃主栽品種的聚類分析

根據(jù)26 個桃主栽品種在15 個SSR 位點的等位基因頻率，計算桃品種間的Nei’s 遺傳相似系數(shù)，并利用NYSYSPC2.1 軟件的UPGMA 法對供試桃主栽品種進行遺傳相似系數(shù)的聚類分析（圖2）。由聚類分析結果可知，26 個桃主栽品種間的遺傳相似系數(shù)在0.64～0.94 之間，平均遺傳相似度為0.79；其中，品種‘松森’與‘白風’的遺傳相似度最高，親緣關系最近，遺傳相似度為0.94；而品種‘早春紅’與‘加納巖’的親緣關系最遠，遺傳相似度為0.64。

圖2 基于SSR 標記的26 個桃主栽品種UPGMA 聚類分析Fig.2 Dendrogram of 26 peach cultivars based on UPGMA of SSR polymorphisms

根據(jù)UPGMA 法的聚類分析結果可知，在遺傳相似系數(shù)為0.70 時，可將26 個桃主栽品種分為3 組，其聚類結果與品種來源基本一致。第一組包括12 個桃品種，其中 ‘大久?！?、‘京玉’、‘NJN9’和‘慶豐’等品種與由‘NJN83’選育的‘黃金蜜1’、‘中油9’、‘北冰洋之藍’和‘春蜜’優(yōu)先聚在一起；此外，由‘黃金蜜13’選育出的“中桃6”和‘中油13’再聚在一起，組成第一組群。第二組包括13 個桃品種，由‘朝暉’選育的優(yōu)良品種‘加納巖’、‘砂子早生’、‘霞暉’、‘松森’、‘白風’、‘雨花露’以及‘天仙美’、‘早美’、‘春蕾’、‘布目早生’、‘沙紅桃’和‘倉方早生’等品種組成；第三組僅包括‘早春紅’。

3 討 論

本研究利用毛細管熒光電泳法檢測SSR 位點片段大小，與常用的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測法相比，具有操作簡單、結果準確、通量高等優(yōu)點，是目前研究物種分類、品種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育等領域中最常用的方法[14]。SSR 分子標記具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性高、通用性強等優(yōu)點，可在近緣物種間直接篩選應用，本研究利用開發(fā)自桃及其近緣物種的SSR 分子標記，結果表明所選SSR 分子標記具有較高的多態(tài)性和通用性，這與Sanchez-Perez 等[15]和包文泉等[10]的研究結果一致，桃、櫻桃、扁桃和杏等薔薇科樹種間的SSR 分子標記具有極高的通用性和穩(wěn)定性，后期直接選擇桃、杏、梅、扁桃的基因組序列，開發(fā)SSR 分子標記，用于桃屬、杏屬以及其他近緣物種的相關研究，可節(jié)省從頭開發(fā)SSR 分子標記的經費和人力。

等位基因數(shù)量是衡量SSR 分子標記多態(tài)性高低和應用范圍的重要指標，其高低是SSR 分子標記開發(fā)和篩選的優(yōu)選條件[16-17]。本研究所用的15個SSR 位點平均等位基因（Na）和平均效等位基因（Ne）分別為17.27 個和14.23 個，說明桃主栽品種的遺傳多樣性及水平適中，這一結果高于凌士鵬等[18]利用12 對SSR 引物對53 份桃品種檢測到的7.92 個等位基因，也高于魏姍姍等[19]利用18 對SSR 引物檢測95 個桃品種的結果（平均每位點的Na為5.17），這可能與本研究所用材料有關，因為本研究所用桃品種中既有國內的品種，也有國外的品種，并且國內桃品種來自不同地區(qū)的不同品系，因此供試桃品種本身多樣性可能較高；還可能與本研究前期對SSR 引物進行了嚴格的多態(tài)性篩選有關，進而造成本研究中桃品種的遺傳多樣性較高[10]。

通常分子標記的多態(tài)性信息指數(shù)（PIC）若大于0.50 則說明該標記具有較高的多態(tài)性，可直接用于后期相關分析[12]。本研究所用15 個SSR標記的多態(tài)性信息含量（PIC）值均大于0.75（0.75～0.91），表明所篩選SSR 標記均完全適用于桃種質資源的遺傳多樣性分析。但供試15 個SSR 標記鑒別能力存在較大的差異，并且絕大數(shù)標記的鑒別能力有限，其中僅有pchgms25 標記能夠鑒別出10 個不同桃品種，其余14 個供試SSR 標記的鑒別能力均較低，若想將供試26 個桃主栽品種一一鑒別，至少將利用pchgms25、PceGA25、

UDP96-003、UD98-412-50、UDP98-409、UDP98-406、UDP97-402、Pchgms4-54、BPPCT-001 等9個SSR 標記相結合，說明目前的桃主栽品種間遺傳距離較近，桃主栽品種的遺傳背景較狹窄。這與本研究中聚類分析得出的26 個桃主栽品種間的遺傳相似度較高（0.64～0.94）相一致，也與李建輝等[4]和羅慧等[5]的研究結果一致。這可能與桃種質資源悠久的栽培歷史中頻繁地異地引種和馴化有關[19-20]，也可能與供試品種的選育技術和育種過程有關[21-22]。因此，后期在桃種質的遺傳改良、種質創(chuàng)新及選育良種中應注意選擇親緣關系較遠的資源[23-25]，以期提高桃種質的遺傳多樣性和育種效率，避免后期可能出現(xiàn)的桃品種遺傳退化[26]。

通過聚類分析可將26 個桃主栽品種分為3 組，其中，同品系品種優(yōu)先聚為一組，其分組結果與品種來源基本一致，這與羅慧等[5]及陳傳愛等[7]研究結果一致。說明不同系列品種間基因交流少，此結果可為后期桃種質的遺傳改良、新品種選育、種質創(chuàng)新等研究工作中的育種親本的選擇提供重要依據(jù)，還可為建立桃核心種質庫和資源圃等提供理論依據(jù)。

本研究利用15 個SSR 分子標記對26 個桃主栽品種進行了品種鑒別和指紋圖譜構建，為桃種質資源的栽培管理提供了較為精確、高效的鑒別技術支撐，但除了pchgms25 標記外，其余標記的鑒別能力有限，要將眾多個桃品種鑒別所需要的SSR 標記數(shù)量較多，工作量較大，所需時間較長。因此，后期應該加強利用桃基因組序列數(shù)據(jù)的進一步挖掘，開展分子生物學研究，開發(fā)更高效的分子標記，如從DNA 序列水平上開發(fā)單核苷酸多態(tài)性（SNP）標記，為桃品種鑒定提供更高效的技術和理論支撐。

4 結 論

本研究通過15 個SSR 分子標記對26 個桃主栽品種進行了品種鑒別和指紋圖譜構建研究，研究結果表明目前桃主栽品種的遺傳多樣性水平適中，但桃主栽品種的遺傳背景較狹窄，遺傳相似度較高，不同品系間基因交流較少。本研究結果可為桃種質資源的創(chuàng)新、核心種質資源庫的建立以及桃種質資源的保護與利用提供理論與技術支撐。