一株1-萘酚生產(chǎn)菌的分離、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化

邱程剛，李 康，陶 沙，錢(qián) 穎，張阿磊，陳可泉,2，歐陽(yáng)平凱,2

(1. 南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；2. 國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 211800)

1-萘酚是一種重要的平臺(tái)化學(xué)品，可廣泛用于染料、藥物、殺蟲(chóng)劑、香水和表面活性劑等領(lǐng)域[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年1-萘酚的需求量超過(guò)4萬(wàn)t[3]。目前，1-萘酚主要由化學(xué)氧化催化萘制得(如α-萘磺酸堿熔法、α-萘胺水解法、四氫萘法制萘等)[4]，但化學(xué)法存在副產(chǎn)物多、反應(yīng)條件要求苛刻和環(huán)境污染嚴(yán)重等問(wèn)題。因此，開(kāi)發(fā)高效綠色的1-萘酚生產(chǎn)方法尤為重要。生物法由于反應(yīng)條件溫和、專(zhuān)一性強(qiáng)、特異性強(qiáng)，受到越來(lái)越多的關(guān)注[2,5-9]。

目前，生物法制備1-萘酚主要是以萘為底物，酶法催化合成1-萘酚。例如，在添加外源輔酶NADPH的條件下，Liu等[10]克隆表達(dá)的P450酶催化轉(zhuǎn)化萘制備1-萘酚，產(chǎn)量為1.83 mg/L。在添加外源輔酶H2O2的條件下，Martinez等[11]通過(guò)克隆表達(dá)非特異性單加氧酶(UPO)，催化轉(zhuǎn)化萘可制備48 mg/L的1-萘酚。Garikipati等[12]利用異源表達(dá)的甲苯鄰位單加氧酶(TOM)，以萘為底物制備1-萘酚，產(chǎn)量達(dá)14.4 mg/L；此外，他們還研究了TOM-Green工藝轉(zhuǎn)化萘得到1-萘酚(86.4 mg/L)，在此基礎(chǔ)上利用全細(xì)胞兩相催化，1-萘酚的產(chǎn)量可達(dá)1.43 g/L。

自然界中，微生物種類(lèi)多樣，具有生產(chǎn)各種產(chǎn)品的潛力。萘作為一種常規(guī)環(huán)境污染物，可被自然界中很多微生物氧化為1，2-二羥基萘、龍膽酸及水楊酸等小分子物質(zhì)，進(jìn)而被降解[13-16]。然而，直接轉(zhuǎn)化萘合成1-萘酚的研究較少，Inoue等[7]研究發(fā)現(xiàn)，野生菌發(fā)酵生產(chǎn)1-萘酚，產(chǎn)量為21.23 mg/L。因此，挖掘?qū)⑤赁D(zhuǎn)化為1-萘酚的天然微生物資源在環(huán)境保護(hù)和經(jīng)濟(jì)方面均具有重要意義。

本研究中，筆者從南京某化工廠污水道中富集、馴化、分離并篩選出1株能轉(zhuǎn)化萘生產(chǎn)1-萘酚的菌株，對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、16S rDNA分子序列和生理生化特性的鑒定，并通過(guò)培養(yǎng)條件優(yōu)化提高萘生產(chǎn)1-萘酚的效率，以期為實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生物法生產(chǎn)1-萘酚奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藥品與設(shè)備

蛋白胨、酵母粉、NaCl、NaH2PO4、K2HPO4、萘、FeSO4、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲基叔丁基醚(METB)及其他藥品均為市售分析純。

DHZ-LA型恒溫振蕩器，太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司；YXQ-LS-50S11型高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；FA2004型電子分析天平，上海舜宇恒平科技儀器有限公司；PHS-3C型數(shù)字式精密pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；B￣2￣0￣4￣L￣E￣D￣R型雙目生物顯微鏡，上海比目?jī)x器有限公司；TGL-16M型冷凍高速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；752S型分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司，1260型高效液相色譜儀，Agilent公司。

1.1.2 樣品采集

從南京某化工廠的排水溝里分別采集到泥水混合物樣品6份，編號(hào)后保存于4 ℃冰箱待用。

1.1.3 培養(yǎng)基配制

富集培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨1.0、NaH2PO4·2H2O 0.7、Na2HPO4·12H2O 0.3、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01。

馴化培養(yǎng)基(g/L)：萘0.5、NaH2PO4·2H2O 0.7、Na2HPO4·12H2O 0.3、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01。

分離培養(yǎng)基(g/L)：萘0.1、蛋白胨1.0、酵母粉0.5、NaCl 0.5、純化瓊脂20。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 1-萘酚生產(chǎn)菌的富集培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，將采集到的5 mL樣品(充分混勻的泥水混合物)分別加入100 mL富集培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)4 d后按5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)基中，反復(fù)傳代培養(yǎng)3次，以富集1-萘酚生產(chǎn)菌[17]。

1.2.2 1-萘酚生產(chǎn)菌的馴化培養(yǎng)

取5 mL富集樣置于100 mL以萘為唯一碳源的馴化培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)4 d 進(jìn)行馴化,取5 mL的馴化液接種至新鮮馴化培養(yǎng)基中，重復(fù)操作直至馴化液中檢測(cè)到1-萘酚的存在。

1.2.3 1-萘酚生產(chǎn)菌的分離純化

用無(wú)菌水將馴化液按10-1～10-8梯度稀釋?zhuān)?.2 mL稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，在平板上選擇不同形態(tài)特征的單菌落，重新轉(zhuǎn)接至分離培養(yǎng)基上，直至分離為單菌落。將得到的單菌落接種至馴化培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d 后，檢測(cè)1-萘酚的存在以驗(yàn)證其具有1-萘酚生產(chǎn)能力。將具有生產(chǎn)1-萘酚性能的菌種劃線(xiàn)于固體斜面培養(yǎng)基上,于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 1-萘酚生產(chǎn)菌的形態(tài)學(xué)鑒定

1)菌落形態(tài)特征。將1-萘酚生產(chǎn)菌株接種至分離培養(yǎng)基，于30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察。

2)菌體細(xì)胞形態(tài)特征。對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色鑒定[18],使用100倍油鏡觀察菌株，若菌株呈紫色，則菌株QCG為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌;若菌株呈紅色，則菌株為革蘭氏陰性細(xì)菌。

1.2.5 1-萘酚生產(chǎn)菌株的生理生化鑒定

參照《蠟樣芽孢桿菌生化鑒定條使用說(shuō)明書(shū)(HBIG07-1)》中的方法，用生理生化條(海博生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行過(guò)氧化氫酶、西蒙氏檸檬酸鹽、動(dòng)力、溶菌酶、硝酸鹽、乙酰甲基甲醇(VP)試驗(yàn)、明膠、甘露醇、葡萄糖淀粉水解試驗(yàn)，觀察反應(yīng)結(jié)果并記錄。

1.2.6 基于16S rDNA基因序列的同源性比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

利用DNA提取試劑盒(擎科生物科技有限公司)提取分離降解菌的總DNA，具體操作參照文獻(xiàn)[19]。

1)擴(kuò)增引物選用16S rDNA的通用引物27F和1492R。引物序列為(27F-5′-A￣G￣T￣T￣G￣A￣T￣C￣M￣T￣G￣G￣C￣T￣C￣A￣G-3′，1492R-5′-G￣G￣T￣T￣A￣C￣C￣T￣T￣G￣T￣T￣A￣C￣G￣A￣C￣T￣T-3′-2)。PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件PCR反應(yīng)體系(25 μL)：基因組DNA模板0.5 μL，10×擴(kuò)增緩沖液(含Mg2+)2.5 μL，dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL，Taq酶0.2 μL，上下游引物各0.5 μL。

2)16S rDNA的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)循環(huán)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃繼續(xù)延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鑒定正確后，再用純化試劑盒純化收集，送擎科生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。

3)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析與同源性比對(duì)。將所得分離降解菌的序列輸入NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.ncbi.mlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)進(jìn)行同源序列的檢索，從檢索的結(jié)果中選擇14個(gè)相似度最高的序列作為參考序列并以其他不同種屬或種的菌株作為外群，使用MEGA7.0軟件對(duì)所測(cè)序列和所選序列進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)剪去不整齊的堿基并在序列間插入適當(dāng)空格，以達(dá)到最大同源性。最后使用該軟件以鄰接法(Neighbor-Joinning法)構(gòu)建QCG菌株與其親緣關(guān)系較近菌屬的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.7 全細(xì)胞催化體系及液相方法的建立

1)全細(xì)胞催化條件。選用30 mL玻璃離心管，反應(yīng)體積為2 mL，包含0.1 mL的3 g/L的萘-DMF溶液、1.9 mL的OD600為40的菌液(磷酸鉀緩沖液(PBS)，pH 7.2)。全細(xì)胞催化條件：溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min，反應(yīng)時(shí)間2 h[20]。

2)樣品處理。反應(yīng)結(jié)束后，在體系里添加4 mL甲基叔丁基醚(METB)萃取，劇烈渦旋5 min、超聲處理20 min、再渦旋1 min，取2 mL上清液置于潔凈的玻璃離心管中，減壓蒸發(fā)溶劑至揮發(fā)完全后，再添加1 mL甲醇溶解，劇烈渦旋5 min、超聲處理20 min、再渦旋1 min，過(guò)膜后使用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)。

3)HPLC檢測(cè)方法。1-萘酚采用安捷倫1260系統(tǒng)HPLC分析。色譜柱為Agilent 5 HC-C18 250 mm×4.6 mm柱，紫外檢測(cè)器。具體條件：進(jìn)樣量為10 μL，波長(zhǎng)為272 nm，流速為1 mL/min，柱溫為25 ℃，流動(dòng)相純水和乙腈。采用梯度洗脫方法，梯度為0 min 50%乙腈、5 min 70%乙腈、10～16 min 90%乙腈。

1-萘酚產(chǎn)率計(jì)算公式為Y=X/0.166 6。其中，X為產(chǎn)物1-萘酚的質(zhì)量濃度(g/L)，Y為菌株QCG全細(xì)胞催化在2 h的產(chǎn)率(g/g)。

1.2.8 生物量的測(cè)定

取一定體積培養(yǎng)液，8 000 r/min離心10 min，用10 mmol/L PBS(pH 7.2)洗滌后用同樣體積緩沖液重懸，將該菌懸液分別稀釋至不同的濃度(OD600)，以PBS作空白對(duì)照；將2 mL稀釋的菌體離心后烘干至恒質(zhì)量，精確稱(chēng)質(zhì)量。以細(xì)胞干質(zhì)量(CDW)為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[21]。

生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=0.041x+0.002 6。其中，y為細(xì)胞干質(zhì)量(g)；x為細(xì)胞生物量(以O(shè)D600表示)

1.2.9 培養(yǎng)條件優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：考察接種量、培養(yǎng)時(shí)間、溫度和裝液量的優(yōu)化，其他條件保持不變，每組設(shè)置3個(gè)平行樣，最后分別取最優(yōu)條件做全細(xì)胞催化。

1)接種量的優(yōu)化。以0.1%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的接種量將菌接種于LB培養(yǎng)基中，在pH 7.0、30 ℃、200 r/min、裝液量為100 mL(500 mL搖瓶)的條件下培養(yǎng)24 h后離心收菌，用PBS(pH 7.0)洗滌后，加PBS稀釋并控制OD600為40，進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

2)培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化。以1.0%的接種量將菌接種于LB培養(yǎng)基中，在pH 7.0、30 ℃、200 r/min、裝液量為100 mL 的條件下分別培養(yǎng)12、18、24和36 h后離心收菌，用PBS(pH 7.0)洗滌后，加PBS稀釋并控制OD600為40，進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

3)培養(yǎng)溫度的優(yōu)化。以1.0%的接種量將菌接種于LB培養(yǎng)基中，在pH 7.0、30 ℃、200 r/min、裝液量為100 mL 的條件下，在不同的溫度(22、26、30、34和37 ℃)下培養(yǎng)24 h后離心收菌，用PBS(pH 7.0)洗滌后，加PBS稀釋并控制OD600為40，進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

4)培養(yǎng)容器裝液量的優(yōu)化。以1%的接種量將菌接種于LB培養(yǎng)基中，在pH 7.0、200 r/min、裝液量為100 mL條件下，在不同的溫度(22、26、30、34和37 ℃)下培養(yǎng)24 h后離心收菌，用PBS(pH 7.0)洗滌后，加PBS稀釋并控制OD600為40，進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 1-萘酚生產(chǎn)菌株的分離篩選及形態(tài)學(xué)鑒定

以萘為唯一碳源從南京某化工廠的排污水道水體中通過(guò)富集、馴化和分離篩選到了1株能轉(zhuǎn)化萘為1-萘酚的菌株，并命名為QCG，對(duì)其在平板上進(jìn)行培養(yǎng)，再進(jìn)行染色鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，該菌在篩選培養(yǎng)基和30 ℃的條件下培養(yǎng)24 h后呈2～3 mm單菌落、不透明、呈乳白色，易挑取。光學(xué)顯微鏡觀察該菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，經(jīng)生物顯微鏡測(cè)定該菌大小約為1.0 μm×4.0 μm，呈短桿狀。

圖1 菌株QCG的菌落形態(tài)及革蘭氏染色鑒定Fig.1 Morphological observation and microscopic gram-examination results of strain QCG

2.2 菌株的生理生化特性

通過(guò)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌嚴(yán)格好氧，適應(yīng)生長(zhǎng)溫度為10～45 ℃，適宜生長(zhǎng)pH為7～10。利用GenⅢ微孔板對(duì)該菌生理生化試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，該菌對(duì)動(dòng)力培養(yǎng)基試驗(yàn)、H2O2試驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)、明膠試驗(yàn)及淀粉水解試驗(yàn)呈陽(yáng)性。

表1 生理生化鑒定試驗(yàn)

2.3 菌株QCG的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)菌株QCG進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序,并與GenBank中已知序列進(jìn)行比對(duì)，菌株QCG的GenBank ID為MK305199。根據(jù)BLAST結(jié)果，選擇有代表性的菌株，用軟件Clustalx 8.0進(jìn)行序列比對(duì)，使用軟件MEGA 7.0利用臨接法(Neighbor-Joinning)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：該菌屬蠟樣芽孢桿菌，命名為BacilluscereusQCG,該菌株與Bacilluscereus9_julio、BacilluscereusBS1的相似度達(dá)99%，是否為同一菌種尚需進(jìn)一步鑒定。

圖2 菌株QCG基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on partial 16S rDNA gene sequences of QCG and reference strains

2.4 產(chǎn)物1-萘酚的鑒定

為證明菌株QCG能生產(chǎn)1-萘酚，對(duì)發(fā)酵液采用高效液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知：1-萘酚標(biāo)品的保留時(shí)間為4.6 min，而發(fā)酵轉(zhuǎn)化液在4.6 min出現(xiàn)了同樣的吸收峰，說(shuō)明有目標(biāo)產(chǎn)物1-萘酚的存在。為了更精確的鑒定，以產(chǎn)物出峰時(shí)間段(4.3～4.9 min)的流出液進(jìn)行質(zhì)譜分析。ESI+質(zhì)譜結(jié)果顯示，出現(xiàn)了荷質(zhì)比(m/z)為145.065 1(1-萘酚+H)的質(zhì)譜峰，由此可以確定1-萘酚的存在。

圖3 高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用分析發(fā)酵液Fig.3 HPLC-mass spectrometry analysis of fermentation samples

2.5 培養(yǎng)條件對(duì)全細(xì)胞催化活性的影響

2.5.1 接種量對(duì)產(chǎn)率的影響

接種量會(huì)影響菌株的1-萘酚產(chǎn)率，因此考察不同的接種量培養(yǎng)的菌株全細(xì)胞催化對(duì)1-萘酚產(chǎn)率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知：接種量為1.5%時(shí)，1-萘酚產(chǎn)率最高；當(dāng)接種量小于或大于1.5%時(shí)，1-萘酚的產(chǎn)率均呈下降趨勢(shì)。

圖4 接種量對(duì)產(chǎn)率的影響Fig.4 Effects of inoculation volume on 1-naphthol yield

2.5.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)率的影響

培養(yǎng)時(shí)間短，菌株的關(guān)鍵酶活不足，但培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)產(chǎn)生一些次級(jí)代謝產(chǎn)物，從而影響菌株的活力[12]。因此，考察不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株全細(xì)胞催化對(duì)1-萘酚產(chǎn)率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，1-萘酚產(chǎn)率逐漸增大，在18 h達(dá)到峰值；隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，1-萘酚的產(chǎn)率出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，選取培養(yǎng)18 h作為菌株QCG的最佳培養(yǎng)時(shí)間。

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)率的影響Fig.5 Effects of culture time on 1-naphthol yield

2.5.3 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)率的影響

溫度對(duì)微生物的影響是通過(guò)影響微生物的代謝系統(tǒng)間接影響菌株活力[12]，是微生物催化過(guò)程中的一個(gè)限制因素。因此考察培養(yǎng)溫度對(duì)1-萘酚產(chǎn)率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知：菌株QCG的最佳培養(yǎng)溫度是26 ℃，高于或低于26 ℃培養(yǎng)，1-萘酚的產(chǎn)率都降低。這與Inoue等[7]研究的1-萘酚生產(chǎn)菌的發(fā)酵最優(yōu)溫度相似。

圖6 溫度對(duì)產(chǎn)率的影響Fig.6 Effects of temperature on 1-naphthol yield

2.5.4 培養(yǎng)時(shí)的裝液量對(duì)產(chǎn)率的影響

裝液量會(huì)影響培養(yǎng)基的溶氧，進(jìn)而影響菌株的產(chǎn)酶能力。選擇5個(gè)不同的裝液量，研究其對(duì)菌株全細(xì)胞催化對(duì)1-萘酚產(chǎn)率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知：在500 mL的三角瓶中，當(dāng)裝液量小于80 mL時(shí)，1-萘酚的產(chǎn)率隨著裝液量的增加而提高；當(dāng)裝液量大于80 mL時(shí)，產(chǎn)率隨著裝液量的增加而降低，因此確定最佳的裝液量為80 mL(500 mL搖瓶)。這與李文利等[22]研究的結(jié)果相似。

圖7 裝液量對(duì)產(chǎn)率的影響Fig.7 Effects of liquid volume on 1-naphthol yield

最終，初步確定菌株QCG轉(zhuǎn)化萘為1-萘酚的較優(yōu)條件：接種量為1.5%、培養(yǎng)時(shí)間為18 h、培養(yǎng)溫度為30 ℃、裝瓶量為80 mL(500 mL搖瓶)。 此時(shí)，產(chǎn)物1-萘酚質(zhì)量濃度可達(dá)22.23 mg/L，產(chǎn)率為(0.97±0.06) g/g 。

3 結(jié)論

通過(guò)富集、馴化和分離篩選，從化工廠廢水中獲得1株可轉(zhuǎn)化萘為1-萘酚的菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)檢測(cè)，鑒定為蠟樣芽孢桿菌，命名為BacilluscereusQCG。通過(guò)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用確定了1-萘酚的生成。最終，通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化，菌株QCG轉(zhuǎn)化萘生成1-萘酚的產(chǎn)量可達(dá)22.23 mg/L，為生物法轉(zhuǎn)化萘為1-萘酚提供了可能。