蔬菜水果中菊酯類農(nóng)藥殘留快速檢測的方法研究

林 津，程 慧，程銀棋，榮 茂，皮江一，胡家勇，周陶鴻，彭青枝

（1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430070；2.黃梅縣公共檢驗檢測中心，湖北 黃梅 435500）

我國是水果和蔬菜生產(chǎn)和消費大國，水果年產(chǎn)量達1.5億t，蔬菜年產(chǎn)量超過6億t。農(nóng)藥是果蔬生產(chǎn)的必要保障，菊酯類農(nóng)藥作為第二大殺蟲劑類農(nóng)藥，由于其具有殺蟲譜廣、藥效迅速、藥效時間長、抗性低、對光和熱穩(wěn)定等特點，使用量占據(jù)了近30%的農(nóng)藥市場，被廣泛應用于蔬果除蟲防治[1-3]。由于菊酯類農(nóng)藥的大量和大范圍使用，暴露于環(huán)境中的菊酯是引起人類和動物慢性毒性效應的主要因素，而且，菊酯類被報道是水環(huán)境中具有最高生態(tài)毒理學活性的農(nóng)藥[4-6]。此外，菊酯還會對生物構(gòu)成累積風險，甚至在陸地生物、海洋哺乳動物和沉積物中也能發(fā)現(xiàn)[7]。已報道的菊酯的毒性效應和健康風險有：神經(jīng)毒性、細胞毒性、基因毒性、生殖毒性、生長發(fā)育毒性、代謝毒性、攝入風險、殘留風險、致癌風險等。因此水果蔬菜菊酯類農(nóng)藥殘留監(jiān)管顯得尤為重要[8-10]。

國家衛(wèi)健委、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部及市場監(jiān)管總局聯(lián)合發(fā)布的GB 2763—2019《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中明確規(guī)定了11種菊酯類農(nóng)藥及其同分異構(gòu)體在蔬菜水果中的使用范圍和最大使用量。即使國家強制標準中已有限量要求，但是食用農(nóng)產(chǎn)品中菊酯類農(nóng)藥的殘留量超標事件一直屢禁不止，根據(jù)全國抽檢數(shù)據(jù)顯示菊酯類農(nóng)藥經(jīng)常被使用于韭菜、芹菜、青椒、豇豆、梨、柑橘，且不合格率的問題較為突出[11-12]。

目前蔬菜水果中菊酯類農(nóng)藥殘留量的檢測多采用氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法等[13-15]，這些方法雖具有結(jié)果準確可靠、檢測限低，但其方法樣品前處理繁瑣耗時，儀器昂貴龐大，檢測費用成本高，環(huán)境條件和人員技能要求高，不能適應大批量樣品的現(xiàn)場快速檢測要求，因此迫切需要開發(fā)簡便高效的快檢方法，填補蔬菜水果中菊酯類的快速檢測方法規(guī)范性文件的缺失[16-18]。目前市面上流通的蔬菜水果中菊酯類快檢試劑盒，主要采用的是膠體金免疫層析法，由于缺乏統(tǒng)一的檢驗方法的約束，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊、好壞難辨，準確度不高，檢出限虛標[19-20]，無法滿足同時檢測一類菊酯農(nóng)殘的市場需求，本快檢檢測方法的研制勢在必行。本研究將選購市場上常見的菊酯類農(nóng)殘快速檢測產(chǎn)品，對快速檢測蔬菜水果中菊酯農(nóng)殘的前處理步驟進行研究和簡化，同時對膠體金方法檢測性能進行技術上統(tǒng)一規(guī)定，考察每種快檢產(chǎn)品在果蔬基質(zhì)樣品檢測中的靈敏度、特異性、假陽性率、假陰性率和準確度，同時考察產(chǎn)品的適用性，另外對各快檢產(chǎn)品進行整體性評價，旨在為水果蔬菜中菊酯類農(nóng)殘日常監(jiān)管、重大活動保障、案件稽查提供簡便、快捷、準確的技術支撐，提高監(jiān)管效能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗所用蔬菜、水果樣品：市售（經(jīng)GB 23200.113—2018《植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》測試，本次所購蔬菜本底不含本方法中的11種菊酯類農(nóng)藥）；氟胺氰菊酯、氟氯氰菊酯和高效氟氯氰菊酯、氟氰戊菊酯、甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、氯氟氰菊酯和高效氯氟氰菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯和高效氯氰菊酯、醚菊酯、氰戊菊酯和順式氰戊菊酯、溴氰菊酯11種菊酯農(nóng)藥及其同分異構(gòu)體標準品（純度均≥99%）：農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；氯化鈉、乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、曲拉通、硼砂、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、Tris-鹽酸（純度均≥99%）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

B114127491電子天平：梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司；YPNSY-12攜式樣品濃縮儀：金壇區(qū)西城新瑞儀器廠；FSJ-A05N6小熊牌粉碎機：天貓旗艦店；5811FN879374冷凍離心機：德國艾本德公司。

1.3 方法

本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中菊酯類農(nóng)殘與膠體金標記的特異性抗體發(fā)生結(jié)合，抑制了抗體與試紙條/檢測卡中檢測線（T線）上抗原的結(jié)合，從而導致T線顏色深淺的變化。通過T線與控制線（C線）顏色深淺比較，對樣品中的菊酯類農(nóng)殘進行定性判定。

1.3.1 前處理方法

（1）直接稀釋法：稱取5 g搗碎蔬菜、水果樣品于50 mL塑料離心管中，加入5 mL稀釋液（Tris-鹽酸緩沖溶液，pH 8.5），充分振蕩混勻，用于測定。

（2）直接提取法：稱取5 g搗碎蔬菜、水果樣品于50 mL塑料離心管中，加入5 mL提取液（乙腈∶乙酸乙酯=2∶8），渦旋混勻，加入1.5 g NaCl劇烈振蕩數(shù)次，4 000 r/min離心5 min。準確吸取2.5 mL上清液于10 mL離心管中，40 ℃下空氣吹至近干，加入1 mL稀釋液進行復溶，用于測定。

1.3.2 提取條件優(yōu)化

（1）提取溶劑的選擇

考察4種提取溶劑乙腈、甲醇、乙酸乙酯和丙酮對菊酯類農(nóng)藥的提取效果，選擇最佳提取溶劑。

（2）提取試劑的優(yōu)化

比較當5 mL提取劑中乙腈與乙酸乙酯體積比為5∶5、4∶6、3∶7、2∶8以及純乙酸乙酯對模擬陽性樣本中11種菊酯提取率的影響，選擇最佳提取試劑。

（3）稀釋液的選擇

比較pH 8.5的Tris-鹽酸溶液、0.5%曲拉通-硼砂緩沖溶液、0.5%曲拉通-磷酸鹽緩沖溶液3種稀釋液對樣品進行處理后膠體金試紙條的顯色效果，選擇最佳稀釋液。

（4）加樣量的選擇

取菊酯質(zhì)量濃度為2 mg/kg的模擬樣品，比較當樣品加樣量分別為80 μL、120 μL、200 μL、240 μL加于金標微孔時試紙條的顯色反應，選擇最佳加樣量。

1.3.3 提取率的計算

提取率的計算公式如下：

1.3.4 檢出限測定

取菊酯質(zhì)量濃度為1 mg/kg、2 mg/kg、4 mg/kg（其中甲氰菊酯的質(zhì)量濃度達到0.25 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg）的模擬樣品，按照前處理方法和分析步驟進行處理，觀察試紙條最終的顯色效果。

1.3.5 試劑條測定

吸取上述待測液200 μL于金標微孔中，抽吸5～10次混勻，3 min后將試紙條插入微孔中。6 min后進行結(jié)果判定。檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或者檢測線（T線）顏色與控制線（C線）顏色相當，表明樣品中菊酯類殘留量低于方法檢測限，判定為陰性；檢測線（T線）不顯色或檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色淺，表明樣品中菊酯類殘留量高于方法檢測限，判定為陽性；控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或試紙條無效。

1.3.6 實驗方法學研究

（1）產(chǎn)品方法性能指標的測定

稱取以大白菜、韭菜和柑橘為代表的空白基質(zhì)樣品，11種菊酯混標制成添加水平為0、1 mg/kg、2 mg/kg和4 mg/kg的盲樣樣品各50份，共計600份樣品。按上述前處理方法和測定方法進行測定。

（2）交叉反應

制備5 g大白菜、韭菜、柑橘的空白基質(zhì)樣品，分別添加10 μg、20 μg、40 μg苯、萘、乙酸乙酯、有機磷酸酯類農(nóng)藥（馬拉硫磷、苯硫磷、喹硫磷）、氨基甲酸酯類農(nóng)藥（甲萘威、異丙威）的標準溶液，按照上述測定方法考察含有相同基團的物質(zhì)對試劑盒的影響。

（3）環(huán)境溫度的影響

利用菊酯混標添加量為1 mg/kg、2 mg/kg的模擬樣品在14～40 ℃范圍進行環(huán)境溫度適應性考察，每份濃度樣品進行3次平行測試。

（4）與參比方法一致性

稱取以大白菜、韭菜、柑橘等為代表的空白基質(zhì)樣品，11種菊酯混標添加量為1 mg/kg、2 mg/kg的盲樣樣品各60份。分別用本研究建立的快檢方法和標準參比方法GB 23200.113—2018《植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》進行檢測，對方法一致性進行研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的比較

在韭菜、柑橘和大白菜的空白基質(zhì)樣品中添加菊酯類標準溶液，分別制成添加水平為0、2 mg/kg、4 mg/kg、8 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg的樣品，分別采用直接稀釋法和直接提取法進行前處理，膠體金試劑條進行檢測，以檢出陽性結(jié)果最低值作為其檢出限，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，直接稀釋法的檢出限較高，達到10 mg/kg，無法滿足檢測要求；直接提取法檢出限低至2 mg/kg，可滿足現(xiàn)場檢測的要求。

表1 前處理方法的檢出限比較Table 1 Comparison of detection limits for preprocessing methods

2.2 提取溶劑的選擇

利用膠體金試紙條和參比方法對比考察了4種不同濃度的提取溶劑（乙腈、甲醇、乙酸乙酯和丙酮）對甲氰菊酯類農(nóng)藥的提取效果，結(jié)果見表2。由表2可知，4種提取溶劑（乙腈、甲醇、乙酸乙酯和丙酮）對甲氰菊酯的提取效果為：乙腈＞乙酸乙酯＞丙酮＞甲醇；其中乙腈對甲氰菊酯的提取回收率可達98%～102%；考慮乙腈空氣吹干速度慢，而乙酸乙酯吹干速度較快，因此，綜合考慮本實驗采用乙腈與乙酸乙酯復合溶劑作為提取溶劑。

表2 不同提取溶劑對甲氰菊酯提取效果比較Table 2 Comparison of extraction effects of cypermethrin with different extraction solvents

2.3 提取試劑的優(yōu)化

比較5 mL提取劑中乙腈與乙酸乙酯不同配比對模擬陽性樣本中11種菊酯提取率的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，當5 mL提取劑中乙腈與乙酸乙酯體積比為5∶5、4∶6、3∶7、2∶8和純乙酸乙酯時，11種菊酯的提取率無顯著性變化，考慮到吹干速率和環(huán)保低毒的要求，同時乙酸乙酯的毒性低于乙腈，盡量選擇對環(huán)境和實驗人員友好的溶劑配比，因此最終采用的提取劑中乙腈與乙酸乙酯最佳體積比為2∶8。

圖1 乙腈與乙酸乙酯不同體積積比對11種菊酯提取率的影響Fig.1 Effect of different volume ratios of acetonitrile and ethyl acetate on extraction yield of 11 kinds of permethrins

2.4 稀釋液的選擇

考慮到11種擬除蟲菊酯的理化性質(zhì)以及硝酸纖維素膜（nitrocellulose filter membrane，NC）特性，選取終質(zhì)量濃度為2 mg/kg的大白菜基質(zhì)加標樣，分別使用pH 8.5的Tris-鹽酸溶液，0.5%曲拉通-硼砂緩沖溶液，0.5%曲拉通-磷酸鹽緩沖溶液這3種稀釋液對樣品進行處理后，經(jīng)膠體金試紙條檢測后結(jié)果見圖2。

圖2 三種稀釋液顯色情況Fig.2 Color rendering of three diluents

由圖2可知，用硼砂緩沖溶液混合試劑作為稀釋液時，C線較淺；用磷酸鹽緩沖溶液混合試劑作為稀釋液時，陽性樣中T線沒有明顯淺于C線，不利于判斷，而用Tris-鹽酸溶液作為稀釋液時，T線和C線顯色穩(wěn)定，顏色均勻，區(qū)分度明顯，有利于結(jié)果判定，故選用Tris-鹽酸溶液作為稀釋液。

2.5 加樣量的選擇

結(jié)果表明，當加樣量為80 μL時，膠體金試紙條表現(xiàn)出層析速度較慢，且T線附近底色呈現(xiàn)較深紅色；當加樣量為120 μL時，C線顯色，但顏色較淺；當加樣量為240 μL時，NC膜吸附樣液色素過多導致試紙條背景色太深，上述情況均不利于顯色結(jié)果的觀察和判斷。而當取樣量為200 μL時，檢測結(jié)果重復性好，C線和T線顏色區(qū)分明顯，利于判斷。因此，待測液的加樣量選擇200 μL。

2.6 檢出限測定

由圖3可知，10種菊酯質(zhì)量濃度為2 mg/kg，甲氰菊酯質(zhì)量濃度為0.5 mg/kg時，C線顯色明顯且T線不顯色，為陽性結(jié)果，因此，11種菊酯及其同分異構(gòu)體的檢出限為2 mg/kg（其中甲氰菊酯的檢出限為0.5 mg/kg）。

圖3 11種菊酯及其同分異構(gòu)體的試紙條顯色情況Fig.3 Color rendering of test strips of 11 permethrins and their isomers

2.7 產(chǎn)品方法性能指標的測定

由表3可知，大白菜、韭菜和柑橘基質(zhì)陽性樣品均檢出300個陽性結(jié)果，假陰性率均為0；大白菜、韭菜和柑橘基質(zhì)陰性樣品均檢出300個陰性結(jié)果，假陽性率均為0；并且優(yōu)化后的檢測方法測定的大白菜、韭菜和柑橘基質(zhì)樣品靈敏度、特異性均為100%。上述性能指標均符合食藥監(jiān)科便函[2017]43號《食品快速檢測方法評價技術規(guī)范》[21]的技術要求。

表3 方法性能指標的計算結(jié)果Table 3 Calculation results of performance indexes of the methods

2.8 交叉反應

根據(jù)文獻資料以及菊酯類農(nóng)藥的化學結(jié)構(gòu)分析，考慮到菊酯可能與含有苯環(huán)、酯鍵、間苯氧基的結(jié)構(gòu)的物質(zhì)存在交叉反應，當萘、乙酸乙酯、有機磷酸酯類、氨基甲酸酯類標準品添加水平在2 mg/kg時，進行菊酯類膠體金試紙條交叉反應測試，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，菊酯類膠體金試紙條判定結(jié)果均為陰性，上述結(jié)構(gòu)的物質(zhì)及農(nóng)藥與本方法的試劑盒無交叉反應。

圖4 交叉反應試紙條顯色情況Fig.4 Color rendering of cross reaction test strips

2.9 環(huán)境溫度影響

由表4可知，本方法對環(huán)境溫度不敏感，環(huán)境溫度14～40 ℃之間均可，測定3次的快檢結(jié)果與國標結(jié)果均相符，符合率為100%。

表4 溫度耐變性實驗結(jié)果Table 4 Results of temperature variability test

2.10 與參比方法一致性分析

分別用建立的快速檢測方法與標準參比方法GB 23200.113—2018《植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》檢測6種不同基質(zhì)的果蔬陰性樣品和模擬陽性樣品，結(jié)果表明，菊酯類農(nóng)殘膠體金試紙條的檢測結(jié)果與參比方法檢測結(jié)果的符合率為100%，通過卡方檢驗得出x2=0，即本方法與參比方法的陽性確證比率在95%的置信區(qū)間內(nèi)沒有顯著性差異，方法的假陽性率、假陰性率均為0，表明該方法選擇性強，準確度高，膠體金卡/試紙條能夠有效應用于蔬菜水果中菊酯類農(nóng)殘的現(xiàn)場檢測。

3 結(jié)論

選用蔬菜（韭菜、大白菜和芹菜）及水果（柑橘、蘋果、梨）作為研究對象，對11種菊酯及其同分異構(gòu)體的膠體金快速檢測試劑盒產(chǎn)品進行方法學研究。研究表明，直接提取法在檢測蔬果時，檢出限較低，能夠滿足日常監(jiān)管檢測需要；在前處理條件優(yōu)化下，菊酯類膠體金快檢檢測方法的檢出限可以達到2 mg/kg；該方法的靈敏度為100%，特異性為100%，假陽性率為0，假陰性率為0。交叉反應率結(jié)果顯示萘、乙酸乙酯、有機磷酸酯類、氨基甲酸酯類與本方法試劑盒無交叉反應。環(huán)境溫度適應性考察顯示本方法對環(huán)境溫度不敏感。同時，與參比方法進行一致性分析比較時，結(jié)果表明與參比方法陽性確證比例在95%的置信區(qū)間內(nèi)沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

本研究研制出菊酯類農(nóng)藥殘留速測盒產(chǎn)品，該法操作簡便、快速，樣品只需進行簡單的處理，然后采用速測試劑進行檢測，20 min內(nèi)即可出結(jié)果。此外，該產(chǎn)品靈敏度高，對常見擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的最低檢出限可達到2 mg/kg；檢測樣品時，其結(jié)果與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的測定結(jié)果基本吻合，檢測速度遠快于氣質(zhì)聯(lián)用法，適合于現(xiàn)場快速檢測。