香蕉胡蘿卜復(fù)合果蔬汁的發(fā)酵工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

黃 杰，韋 璐，鄭博強(qiáng)，孫欽菊，杜麗娟，張嘉佳，文 凈

（廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品工程系，廣西 南寧 530007）

香蕉（Musa nanaLour.）為芭蕉科芭蕉屬植物，是熱帶地區(qū)最常見(jiàn)和最受歡迎的水果之一。近年來(lái)，我國(guó)香蕉產(chǎn)量達(dá)1 100 萬(wàn)t，其廣泛種植于我國(guó)廣東、廣西、臺(tái)灣、海南等地區(qū)[1-2]。香蕉風(fēng)味好、口感甜美，富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因而受到消費(fèi)者的青睞。胡蘿卜（Daucus carrot）又名紅蘿卜，其原料豐富價(jià)格低廉，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含β-胡蘿卜素、核黃素、尼克酸、硫胺素等多種維生素，具有抑制衰老、抵抗癌、健胃和降血壓等功能[3-4]。胡蘿卜汁因其色澤、口感、外觀品質(zhì)良好，而受到人們的喜愛(ài)。果蔬類食品在儲(chǔ)藏和運(yùn)輸過(guò)程中易產(chǎn)生腐敗變質(zhì)，造成浪費(fèi)[5]。對(duì)果蔬進(jìn)行深加工利用，可以延長(zhǎng)其貨架期，提高產(chǎn)品的商品價(jià)值[6]。

有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵給果蔬汁帶來(lái)了獨(dú)特的口感，發(fā)酵過(guò)程中又產(chǎn)生了多種營(yíng)養(yǎng)成分和一些乳酸菌的代謝產(chǎn)物。這些產(chǎn)物能調(diào)節(jié)腸胃菌群，降低膽固醇的活性，對(duì)人體有一定的保健效果[7]。因此，近年來(lái)利用益生菌發(fā)酵果蔬汁類飲品越來(lái)越受到人們的關(guān)注[8-10]。SEELAM D N S等[11]利用球形芽孢桿菌發(fā)酵胡蘿卜汁，制備了一款風(fēng)味好、營(yíng)養(yǎng)豐富的發(fā)酵果蔬汁飲品，并且發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的胡蘿卜汁有更高的氧化活性。李南薇等[12]以香蕉和橙為主要原料，制備了一款營(yíng)養(yǎng)豐富、酸甜適口，具有濃郁的香蕉、橙香味，穩(wěn)定性較好的混合果汁酸乳飲料。韋璐等[13]以香蕉、芒果、六堡茶湯為主要原料，佰生優(yōu)益生菌果蔬酵素發(fā)酵菌為菌種，研制了一款發(fā)酵型香蕉復(fù)合果汁飲料。

本研究以香蕉、胡蘿卜為原料，研究利用植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）和發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentium）復(fù)合菌種發(fā)酵香蕉胡蘿卜果蔬汁的加工工藝，考察原料配比、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間等發(fā)酵條件對(duì)乳酸發(fā)酵的影響，通過(guò)單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)分析了其成分指標(biāo)和抗氧化活性，為香蕉、胡蘿卜類果蔬汁飲品開(kāi)發(fā)利用途徑提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香蕉、胡蘿卜、白砂糖：市售；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）21802、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）21800：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；MRS培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；果膠酶（1.0×104U/g）：南寧市東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-diazo-di-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）：上海源葉生物科技有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SKP-01 電熱恒溫培養(yǎng)箱：湖北省黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1F 潔凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰技術(shù)有限公司；TG16-WS 臺(tái)式高速離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；IS-RDV1 恒溫振蕩箱：上海呈天醫(yī)流科技股份有限公司；HWS-28電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；T6-新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ME204E 電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；IMJ-54A 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TM-767Ⅲ攪拌機(jī)：中山市海盤電器有限公司；LB90T 糖度計(jì)：廣州市速為電子科技有限公司；PHS-3C pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 香蕉胡蘿卜復(fù)合果蔬汁的加工工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

香蕉胡蘿卜汁的制備：將去皮的香蕉和清洗干凈的胡蘿卜分別切成1 cm左右的片狀，并分別放置于攪拌機(jī)中不加水打漿至漿狀，然后按0.1%的果膠酶分別添加到香蕉漿和胡蘿卜漿中，水?。?0 ℃，3 h）下攪拌酶解。將酶解后的香蕉汁和胡蘿卜汁分別置于高速離心機(jī)（8 000 r/min，20 ℃、10 min）離心，取上清液，得香蕉汁和胡蘿卜汁。

均質(zhì)：將香蕉汁和胡蘿卜汁分別按照不同體積比（4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2）混合，并在均質(zhì)機(jī)內(nèi)均質(zhì)均勻（230 MPa，55 ℃）。

殺菌、冷卻：取均質(zhì)好的香蕉胡蘿卜復(fù)合果蔬汁300 mL，置于500 mL廣口瓶中，用兩層紗布封口，水浴條件下殺菌（90 ℃、15 min），然后冷卻至室溫備用。

菌株活化[14]：挑取適量的植物乳桿菌凍干粉、發(fā)酵乳桿菌凍干粉分別接種至10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，按接種量10%（V/V）分別接種至100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，待用。

接種：取活化好的植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌按1∶1配比，按照一定接種量接種至殺菌冷卻后的復(fù)合果蔬汁中。

發(fā)酵：將接種后復(fù)合果蔬汁置于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵一段時(shí)間，當(dāng)發(fā)酵液澄清且無(wú)氣泡產(chǎn)生時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，即得香蕉胡蘿卜復(fù)合果蔬汁。

1.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

設(shè)定香蕉汁與胡蘿卜汁體積比分別為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2，接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%，發(fā)酵溫度分別為27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃條件下發(fā)酵24 h、36 h、48 h、60 h、72 h，分別測(cè)定其活菌數(shù)并進(jìn)行感官評(píng)分，分別考察香蕉汁與胡蘿卜汁體積比、接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間對(duì)香蕉胡蘿卜復(fù)合果蔬汁品質(zhì)的影響。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置香蕉汁與胡蘿卜汁體積比（A）、乳酸菌菌種接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）4個(gè)因素為自變量，以發(fā)酵產(chǎn)品感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 分析檢測(cè)

乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定：采用GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》規(guī)定方法；pH值的測(cè)定：采用pH計(jì)；可溶性固形物含量的測(cè)定：采用手持折光儀；總酸（以乳酸計(jì)）含量的測(cè)定：采用電位滴定法[15]；還原糖含量的測(cè)定：按照GB 5009.7—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測(cè)定》規(guī)定方法；羥自由基清除率的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[16-17]的方法；DPPH自由基清除率的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[18-19]的方法測(cè)定；ABTS自由基清除率：參照文獻(xiàn)[20]的方法。

1.3.5 感官評(píng)定

參考文獻(xiàn)[21-22]方法，由10名具有食品專業(yè)的老師和同學(xué)組成品評(píng)小組，分別從色澤、口感、香氣、組織狀態(tài)四個(gè)方面來(lái)對(duì)復(fù)合果蔬汁進(jìn)行感官評(píng)定，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 香蕉胡蘿卜復(fù)合果蔬汁飲料感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of compound fruit and vegetable juice beverage

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2019軟件繪圖，采用SPASS 26.0對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析，每組試驗(yàn)均做3組平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 香蕉汁與胡蘿卜汁體積比的影響

由圖1可知，香蕉汁與胡蘿卜汁體積比在4∶1、3∶1、2∶1時(shí)，發(fā)酵果蔬汁感官評(píng)分隨著香蕉汁的減少而逐漸提高；并在香蕉汁與胡蘿卜汁體積比為2∶1時(shí)感官評(píng)分最高，為82分；香蕉汁與胡蘿卜汁體積比在1∶1、1∶2時(shí)感官評(píng)分有所下降。而活菌數(shù)隨著香蕉汁和胡蘿卜汁體積比的變化而逐漸緩慢的減少。原因可能是，當(dāng)香蕉汁含量較高時(shí)，復(fù)合果蔬汁飲料口感稍甜，色澤稍暗，感官評(píng)分較低；當(dāng)香蕉汁和胡蘿卜汁的體積比達(dá)到2∶1時(shí)，復(fù)合果蔬汁飲料的酸甜度較適宜，外觀色澤也較好；當(dāng)香蕉汁和胡蘿卜汁的體積比繼續(xù)變化時(shí)，復(fù)合果蔬汁飲料的酸度逐漸增加，又由于此時(shí)復(fù)合果蔬汁飲料酸甜比例不協(xié)調(diào)，也導(dǎo)致了感官評(píng)分開(kāi)始減小。而隨著原料的配比的減小，復(fù)合果蔬汁飲料中總糖含量也逐漸減少，乳酸菌生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)減少，導(dǎo)致活菌數(shù)逐漸減少[23]。因此，選擇最適香蕉汁和胡蘿卜汁體積比為2∶1。

圖1 不同香蕉汁與胡蘿卜汁體積比對(duì)復(fù)合果蔬汁飲料感官評(píng)分和活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect of different volume ratio of banana juice and carrot juice on viable count and sensory evaluation of compound fruit and vegetable juice beverage

2.1.2 接種量的影響

由圖2可知，當(dāng)乳酸菌接種量從1%增大到5%時(shí)，復(fù)合果蔬汁飲料的感官評(píng)分和活菌數(shù)持續(xù)增加；并當(dāng)接種量為5%時(shí)感官評(píng)分最高，為82分；而當(dāng)接種量＞5%之后，感官評(píng)分逐漸緩慢的減小。當(dāng)接種量為1%～7%時(shí)，活菌數(shù)隨接種量增加而迅速增高；當(dāng)接種量為7%～9%時(shí)，活菌數(shù)增加的較為緩慢。這可能是因?yàn)椋?dāng)乳酸菌的接種量＜7%時(shí)，乳酸菌的初始數(shù)量較少，生長(zhǎng)和繁殖的速度緩慢，導(dǎo)致其發(fā)酵能力有限，影響了果蔬汁的口感，導(dǎo)致感官評(píng)分較低；當(dāng)接種量＞5%時(shí)，繼續(xù)加大乳酸菌的接種量，使得乳酸菌的初始數(shù)目增加了，但因其生長(zhǎng)繁殖消耗了太多的營(yíng)養(yǎng)，使得最終活菌數(shù)數(shù)目增加不明顯，同時(shí)，由于此時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生的酸度較高，導(dǎo)致復(fù)合果蔬汁飲料口感不協(xié)調(diào)，感官評(píng)分降低[24-25]。因此，選擇最適乳酸菌接種量為5%。

圖2 不同接種量對(duì)復(fù)合果蔬汁飲料感官評(píng)分和活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of different inoculum on viable count and sensory evaluation of compound fruit and vegetable juice beverage

2.1.3 發(fā)酵溫度的影響

由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵溫度從27 ℃升高到33 ℃時(shí)，復(fù)合果蔬汁飲料的感官評(píng)分和活菌數(shù)都隨之升高；當(dāng)發(fā)酵溫度為33 ℃時(shí)，復(fù)合果蔬汁飲料的感官評(píng)分和活菌數(shù)都達(dá)到最高，分別為82分；而當(dāng)發(fā)酵溫度高于33 ℃之后，復(fù)合果蔬汁飲料的感官評(píng)分和活菌數(shù)都呈現(xiàn)出快速減少的趨勢(shì)。這是因?yàn)槿樗峋L(zhǎng)和發(fā)酵有最適宜的溫度，當(dāng)?shù)陀谠摐囟葧r(shí)，乳酸菌生長(zhǎng)受到抑制，發(fā)酵不足產(chǎn)酸量較低，導(dǎo)致感官評(píng)分減少。而當(dāng)高于該溫度時(shí)，乳酸菌生長(zhǎng)緩慢或者不能繼續(xù)生長(zhǎng)，導(dǎo)致了活菌數(shù)和感官評(píng)分都降低[26-27]。因此，選擇最適發(fā)酵溫度為33 ℃。

圖3 不同發(fā)酵溫度對(duì)復(fù)合果蔬汁飲料感官評(píng)分和活菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of different fermentation temperature on viable count and sensory evaluation of compound fruit and vegetable juice beverage

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間的影響

由圖4可知，不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)合果蔬汁飲料感官評(píng)分的影響存在明顯差異，隨著發(fā)酵時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，復(fù)合果蔬汁飲料的感官評(píng)分先增加后減小，到48 h時(shí)最大?；罹鷶?shù)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，36 h以前增長(zhǎng)的很快，從36 h后增長(zhǎng)的較為緩慢。復(fù)合果蔬汁飲料在發(fā)酵的過(guò)程中，由于發(fā)酵時(shí)間不足，造成酸度不夠，使得產(chǎn)品風(fēng)味還不夠好；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，乳酸菌發(fā)酵能力有限，不再繼續(xù)產(chǎn)酸，同時(shí)時(shí)間延長(zhǎng)后又會(huì)產(chǎn)生其他代謝產(chǎn)物和產(chǎn)生雜菌污染的問(wèn)題，導(dǎo)致感官評(píng)分降低[28]。因此，選擇最適發(fā)酵時(shí)間為48 h。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)合果蔬汁飲料感官評(píng)分和活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of different fermentation time on viable count and sensory evaluation of compound fruit and vegetable juice beverage

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以香蕉汁與胡蘿卜汁體積比（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）為自變量，感官評(píng)分（Y）為因變量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments design

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

續(xù)表

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行二次回歸方程擬合，得到感官評(píng)分（Y）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的擬合方程為：

由表4可知，建立的模型是極顯著的（P＜0.000 1），說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)結(jié)果有效。其中，一次項(xiàng)A、B、C、D和交互項(xiàng)CD，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)結(jié)果影響是極顯著的（P＜0.01），AB、AC、AD、BC和BD對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。方差分析結(jié)果表明，各因素對(duì)結(jié)果影響大小依次為：接種量＞香蕉汁與胡蘿卜汁體積比＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間。

2.2.2 響應(yīng)面最佳配方的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)復(fù)合果蔬汁的4個(gè)影響因素進(jìn)行交互分析，其響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖5。

由圖5可知，各因素交互響應(yīng)面圖均為曲面且開(kāi)口向下，這表明隨著各個(gè)因素的增長(zhǎng)，感官評(píng)分值先增大，增大到最大值后，各因素繼續(xù)增大，感官評(píng)分將逐漸減小。

圖5 各因素交互作用對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on sensory score

經(jīng)Design Expert 8.0.6軟件分析得到的復(fù)合果蔬汁最佳發(fā)酵工藝條件為：香蕉汁與胡蘿卜汁體積比1.69∶1.00、菌種接種量4.41%、發(fā)酵溫度32.10 ℃、發(fā)酵時(shí)間49.46 h，在此條件下復(fù)合果蔬汁的感官評(píng)分的預(yù)測(cè)值為84.64分。為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確性和實(shí)際試驗(yàn)操作的方便，將發(fā)酵工藝條件修正為香蕉汁與胡蘿卜汁體積比1.7∶1.0、發(fā)酵時(shí)間50.0 h、菌種添加量4.4%、發(fā)酵溫度32.0 ℃。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得出復(fù)合果蔬汁的感官評(píng)分實(shí)測(cè)值為85分，與預(yù)測(cè)值比較近，說(shuō)明該模型可行性較高，可作為實(shí)際生產(chǎn)的依據(jù)。

2.3 香蕉胡蘿卜復(fù)合發(fā)酵飲料品質(zhì)分析和體外抗氧化活性

利用最優(yōu)發(fā)酵條件發(fā)酵的香蕉胡蘿卜復(fù)合果蔬汁的品質(zhì)指標(biāo)見(jiàn)表5，體外抗氧化活性指標(biāo)見(jiàn)表6。

表5 香蕉胡蘿卜復(fù)合果蔬汁飲料理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of physicochemical indexes of banana and carrot compound fruit and vegetable juice beverage

表6 香蕉胡蘿卜復(fù)合果蔬汁飲料抗氧化活性Table 6 Antioxidant activity of banana and carrot compound fruit and vegetable juice beverage

由表5和表6的結(jié)果可知，優(yōu)化條件下復(fù)合果蔬汁的pH值為3.29，可溶性固形物含量為12.00%，總酸含量為9.66 g/100 mL，還原糖含量為5.65 g/100 mL，香蕉胡蘿卜復(fù)合果蔬汁飲料對(duì)DPPH·、ABTS+·、·OH的清除率分別為53.60%、77.00%、46.97%，結(jié)果表明復(fù)合果蔬汁飲料具有一定的抗氧化活性。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)分析得到香蕉胡蘿卜復(fù)合果蔬汁飲料的最佳發(fā)酵條件為：香蕉汁與胡蘿卜汁體積比1.7∶1.0、發(fā)酵時(shí)間50.0 h、菌種添加量4.4%、發(fā)酵溫度32.0 ℃。在此優(yōu)化工藝條件下，香蕉胡蘿卜果蔬汁的感官評(píng)分為85分，活菌數(shù)為5.8×106CFU/mL，發(fā)酵果蔬汁的pH值為3.29，可溶性固形物為12.00%，總酸為9.66 g/100 mL，還原糖為5.65 g/100 mL，復(fù)合果蔬汁飲料對(duì)DPPH·、ABTS+·、·OH的清除率分別為53.60%、77.00%、46.97%。該復(fù)合果蔬汁飲料色澤鮮艷、風(fēng)味良好、澄清透明、口感協(xié)調(diào)，并且具有一定的抗氧化活性，試驗(yàn)結(jié)果為香蕉、胡蘿卜的開(kāi)發(fā)利用途徑提供了參考依據(jù)。