雞樅菌產(chǎn)水溶性胞外多糖發(fā)酵條件及抗氧化活性的初步研究

趙紫君，杜全能，楊 正，肖思遠，徐 茜，陳思宇，朱文娟，蘭時樂

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

雞樅菌（Collybia albuminosa）又名白蟻菇、雞宗、雞絲菇、三壇菌，主要分布于我國云南、四川、貴州等地區(qū)，是一種十分珍貴的食藥用大型真菌[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，雞樅菌含有人體必需的氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素、脂類、糖類、核黃酸、尼克酸、麥角甾醇以及鈣、磷、鐵等多種營養(yǎng)元素[3-5]。多糖是雞樅菌中天然存在的物質(zhì)，研究表明，雞樅菌多糖具有降血脂[6]、增強機體免疫力[7]、預(yù)防動脈硬化[8]、抗菌消炎[9]、抗腫瘤[10]、抗氧化[11-12]、保護肝臟[13]等多種功能。雞樅菌多糖主要是從菌絲體[14]和子實體[15-16]中提取，由于野生雞樅菌數(shù)量少，栽培周期長，從中大規(guī)模提取多糖受到限制。近幾年來，對雞樅菌的研究已由菌種分離、液體培養(yǎng)條件等轉(zhuǎn)向生物活性物質(zhì)的研究，并取得了一系列研究成果。QI J等[17]從雞樅菌子實體中分離到對小鼠PC12細胞具有不同神經(jīng)抑制作用的腦苷脂。有研究表明，雞樅菌菌絲體醇提物具有很好的清除自由基的能力[8，18]。

本試驗通過液體深層發(fā)酵，研究雞樅菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件對胞外水溶性多糖產(chǎn)量的影響，并進一步探討水溶性多糖與抗氧化的相關(guān)性，旨在為雞樅菌液體發(fā)酵生產(chǎn)胞外水溶性多糖提供理論參考，同時為雞樅菌胞外多糖的深度開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

雞樅菌（Collybia albuminosa）Z-1：保藏于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物研究室。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、（NH4）2SO4、KH2PO4（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酵母提取粉、酵母膏、蛋白胨：上海盛思生化科技有限公司；苯酚（分析純）：天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司；MgSO4·7H2O（分析純）：湖南化學(xué)試劑總廠；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl，DPPH）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（diammonium2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate，ABTS）：合肥博美生物科技有限公司；玉米粉、玉米淀粉、豆粕粉（無蟲蛀和霉變）：市售；酵母粉：西安維特生物科技有限責(zé)任公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基[19]：土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂粉20g，H2O1000mL，pH值自然。

液體種子培養(yǎng)基：土豆汁200 g/L，玉米粉10 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO41.5 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L，pH自然。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5%，酵母膏2%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.1%，維生素B10.001%。

以上培養(yǎng)基均在115 ℃條件下滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

72EE紫外可見光分光光度計：上海光譜儀器有限公司；himac CR 21G高速冷凍智能離心機：日本Hitachi公司；SX-500高壓蒸汽滅菌鍋：日本TOMY株式會社；QYC2112恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

斜面菌種培養(yǎng)：將保存于4 ℃冰箱的菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d，備用。

液體種子培養(yǎng)：將培養(yǎng)成熟的斜面菌種接種于裝有150 mL液體種子培養(yǎng)基的300 mL三角瓶中，30 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)3 d。

發(fā)酵培養(yǎng)：按5%（V/V）接種量將培養(yǎng)好的液體種子接種于裝有150 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的300 mL三角瓶中，30 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5 d，3次重復(fù)。

1.3.2 產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件研究

發(fā)酵方法同1.3.1，考察碳源種類（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米淀粉、乳糖）及添加量（3%、4%、5%、6%、7%）、氮源種類（酵母膏、蛋白胨、酵母提取粉、豆餅粉、（NH4）2SO4）及添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、KH2PO4添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）、MgSO4·7H2O（0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%）、接種量（3%、4%、5%、6%、7%）、裝液量（110 mL/300 mL、130 mL/300 mL、150 mL/300 mL、170 mL/300 mL、190 mL/300 mL）、種齡（3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）和發(fā)酵時間（3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）對胞外多糖產(chǎn)量的影響。每個試驗重復(fù)3次。

1.3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇裝液量（A）、種齡（B）和發(fā)酵時間（C）為自變量，以胞外多糖產(chǎn)量（R1）為響應(yīng)值，依據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計原理，運用Design-Expert V12.0.3.0軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗，因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for fermentation conditions optimization

1.3.4 胞外多糖測定

（1）發(fā)酵液預(yù)處理：將發(fā)酵液于10 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，取上清液用3倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇沉淀并置于4 ℃冰箱過夜，過濾，將沉淀于80 ℃條件下溶解，Sevag法脫蛋白后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容。

（2）胞外多糖含量測定：參照文獻[20]提供的方法進行。

1.3.5 胞外多糖體外抗氧化活性測定

DPPH自由基清除能力測定：參照文獻[21]提供的方法進行測定；ABTS自由基清除能力測定：參照文獻[22]提供的方法進行測定；OH自由基清除能力測定：參照文獻[23]提供的方法進行測定。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理與顯著性差異分析采用SPSS 12.0軟件對結(jié)果進行分析。響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計分析利用Design Expert 12.0.3.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件研究

2.1.1 碳源種類對胞外多糖產(chǎn)量的影響

分別在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入5%的蔗糖、麥芽糖、玉米淀粉、乳糖替代葡萄糖，其他條件不變，考察不同碳源對雞樅菌產(chǎn)水溶性胞外多糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，不同碳源對雞樅菌發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量影響較大，麥芽糖為碳源時，多糖產(chǎn)量最高，為291.67μg/mL。玉米淀粉次之，乳糖為碳源時，胞外多糖產(chǎn)量最低。因此，選擇麥芽糖作為最適碳源。

圖1 不同碳源對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on exopolysaccharide yield

2.1.2 麥芽糖添加量對胞外多糖產(chǎn)量的影響

改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中麥芽糖添加量分別為3%、4%、5%、6%、7%，其他條件不變，考察麥芽糖添加量對雞樅菌產(chǎn)水溶性胞外多糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，隨著麥芽糖添加量的增加，胞外多糖產(chǎn)量也隨之增加。當(dāng)麥芽糖添加量為6%時，多糖產(chǎn)量最高，達384.35 μg/mL。但麥芽糖添加量超過6%，多糖產(chǎn)量下降明顯。原因為過多添加碳源，改變了培養(yǎng)基中的碳氮比，從而影響雞樅菌的生長和多糖的合成分泌。故選擇最佳麥芽糖添加量為6%。

圖2 麥芽糖添加量對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of maltose addition on exopolysaccharide yield

2.1.3 氮源種類對胞外多糖產(chǎn)量的影響

分別在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入2%的蛋白胨、酵母提取粉、豆餅粉、（NH4）2SO4替代酵母膏，保持氮含量為0.22 g/100 mL，其他條件不變，考察不同氮源對雞樅菌產(chǎn)水溶性多糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖3。從圖3可知，當(dāng)酵母提取粉為氮源時，胞外多糖產(chǎn)量最高達420.49 μg/mL，酵母粉和酵母膏次之，故選擇酵母提取粉作為最適氮源。

圖3 不同氮源種類對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources types on exopolysaccharide yield

2.1.4 酵母提取粉對胞外多糖產(chǎn)量的影響

改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母提取粉添加量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，其他因素不變，考察酵母提取粉添加量對雞樅菌產(chǎn)水溶性胞外多糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，雞樅菌產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量隨酵母提取粉添加量增加而減少，當(dāng)酵母提取粉添加量為1.5%時，多糖產(chǎn)量達451.63 μg/mL，繼續(xù)增加酵母提取粉添加量，多糖產(chǎn)量顯著下降。主要原因為培養(yǎng)基中氮源濃度過高，導(dǎo)致菌體大量生長、發(fā)酵液變稠、溶氧水平下降，從而影響了雞樅菌胞外多糖的合成和分泌。故選擇最佳酵母提取粉添加量為1.5%。

圖4 酵母提取粉添加量對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of yeast extract addition on exopolysaccharide yield

2.1.5 KH2PO4添加量對胞外多糖產(chǎn)量的影響

磷是微生物生長、繁殖、代謝不可缺少的營養(yǎng)元素之一，適量的磷有利于微生物生長和代謝，若培養(yǎng)基中缺少磷，則影響微生物對碳源的利用，但磷過量則抑制代謝產(chǎn)物的合成，甚至對菌體產(chǎn)生毒性作用。改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中KH2PO4的添加量，其他條件不變，考察KH2PO4添加量對雞樅菌產(chǎn)水溶性胞外多糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，在一定范圍內(nèi)，多糖產(chǎn)量隨KH2PO4添加量的增加而增加。當(dāng)KH2PO4添加量為0.1%時，胞外多糖產(chǎn)量最高，達491.37 μg/mL，但KH2PO4添加量超過0.1%，多糖產(chǎn)量下降。故選擇最佳KH2PO4添加量為0.1%。

圖5 KH2PO4添加量對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of KH2PO4 addition on exopolysaccharide yield

2.1.6 MgSO4·7H2O添加量對胞外多糖產(chǎn)量的影響

鎂是微生物生長和代謝不可缺少的微量元素之一，也是微生物細胞內(nèi)酶活性中心的組成部分，具有提高酶活性的功能。添加適量的鎂元素，有助于菌體的生長和提高代謝活性，但濃度過高，一方面提高了培養(yǎng)基的滲透壓，另一方面可能對菌體產(chǎn)生毒性，進而影響菌體代謝產(chǎn)物的合成。MgSO4·7H2O添加量對雞樅菌產(chǎn)水溶性胞外多糖產(chǎn)量的影響見圖6。由圖6可知，當(dāng)MgSO4·7H2O添加量為0.05%時，胞外多糖的產(chǎn)量達511.74 μg/mL，但添加量超過0.05%，多糖產(chǎn)量顯著下降。故選擇最佳MgSO4·7H2O添加量為0.05%。

圖6 MgSO4·7H2O添加量對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of MgSO4·7H2O addition on polysaccharide yield

2.1.7 接種量對胞外多糖產(chǎn)量的影響

在上述試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，改變接種量分別為3%、4%、5%、6%、7%，考察接種量對雞樅菌產(chǎn)水溶性胞外多糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知，在一定的接種量范圍內(nèi)，隨著接種量的增加胞外多糖產(chǎn)量隨之增加。當(dāng)接種量為6%時，胞外多糖產(chǎn)量最高，為521.33 μg/mL，但接種量超過6%，多糖產(chǎn)量下降。故選擇最佳接種量為6%。

圖7 接種量對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of inoculum on exopolysaccharide yield

2.1.8 裝液量對胞外多糖產(chǎn)量的影響

在上述試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，于300mL三角瓶中分別裝入110 mL、130 mL、150 mL、170 mL、190 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，考察裝液量對雞樅菌產(chǎn)水溶性胞外多糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖8。由圖8可知，隨著裝液量的增加，多糖產(chǎn)量隨之增加。當(dāng)裝液量為150 mL/300mL時，胞外多糖產(chǎn)量最高，為559.41 μg/mL，但裝液量超過150 mL/300 mL時，多糖產(chǎn)量下降，原因為裝液量太大，影響培養(yǎng)液中的溶氧量，從而影響菌體的生長及多糖的合成和分泌，故選擇最佳裝液量為150 mL/300 mL。

圖8 裝液量對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of liquid volume on exopolysaccharide yield

2.1.9 種齡對胞外多糖產(chǎn)量的影響

按5%接種量在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接入培養(yǎng)3 d、4 d、5 d、6 d、7 d的液體種子，考察菌株不同種齡對雞樅菌產(chǎn)水溶性胞外多糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖9。由圖9可知，在一定的種齡范圍內(nèi)，胞外多糖含量隨種齡的增加而增加。當(dāng)種齡為5 d時，多糖含量達到591.24 μg/mL，但種齡超過5 d，多糖產(chǎn)量下降。其原因為種齡太小，種子液中細胞數(shù)量少，導(dǎo)致延遲期延長，而種齡太大，菌體自溶，同樣會影響胞外多糖的合成和分泌，故選擇最佳種齡為5 d。

圖9 種齡對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of seed age on exopolysaccharide yield

2.1.10 發(fā)酵時間對胞外多糖產(chǎn)量的影響

在上述試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別于發(fā)酵的第3天、第4天、第5天、第6天、第7天取樣，測定發(fā)酵液中胞外多糖的產(chǎn)量，考察不同的發(fā)酵時間對雞樅菌產(chǎn)水溶性胞外多糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖10。由圖10可知，胞外多糖產(chǎn)量隨發(fā)酵時間的延長而提高，當(dāng)發(fā)酵時間為6 d時，發(fā)酵液中胞外多糖產(chǎn)量達679.27 μg/mL，但發(fā)酵時間超過6 d，多糖產(chǎn)量下降，可能是由于雞樅菌自身產(chǎn)生了能降解胞外多糖的酶，使胞外多糖產(chǎn)量下降，故選擇最佳發(fā)酵時間為6 d。

圖10 發(fā)酵時間對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.10 Effect of fermentation time on exopolysaccharide yield

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以水溶性胞外多糖產(chǎn)量為響應(yīng)值，選擇對胞外多糖產(chǎn)量影響較大的因素裝液量、種齡和發(fā)酵時間進行3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗。試驗結(jié)果見表2。對回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology for fermentation conditions optimization

利用響應(yīng)面Design-Expert V12.0.3.0軟件對水溶性多糖產(chǎn)量進行多元回歸擬合，獲得胞外多糖的回歸模型方程：

從表3可以看出，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.975 6，校正決定系數(shù)R2為0.931 8，說明模型方程擬合度良好。發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的影響最大，種齡次之，裝液量最小。結(jié)合表中F值可知，發(fā)酵時間（C）、種齡和發(fā)酵時間的交互項（BC）、裝液量的二次項（A2）和種齡的二次項（B2）為極顯著影響因素（P＜0.01），種齡（B）和發(fā)酵時間的二次項（C2）為顯著影響因素（P＜0.05），其他因素影響較?。≒＞0.05）。采用Design-Expert V12.0.3.0軟件對胞外多糖產(chǎn)量的回歸方程進行分析，裝液量、種齡和發(fā)酵時間各因素交互作用的響應(yīng)面圖見圖11。

表3 以水溶性多糖產(chǎn)量為評價指標(biāo)的回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis of regression model with water soluble polysaccharide yield as evaluation index

圖11 各因素交互作用對胞外多糖產(chǎn)量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.11 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on exopolysaccharides yield

由圖11可以看出，種齡和發(fā)酵時間之間的交互作用極顯著（P＜0.01），而裝液量和種齡、裝液量和發(fā)酵時間之間的交互作用均不顯著（P＞0.05）。通過Design-Expert V12.0.3.0軟件對雞樅菌液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖工藝進行優(yōu)化處理，以水溶性胞外多糖產(chǎn)量為評價指標(biāo)，得到雞樅菌液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的適宜工藝條件為：種齡5.07d，裝液量149.58mL/300mL，發(fā)酵時間6.92 d，此時胞外多糖的理論產(chǎn)量為683.72 μg/mL。為了驗證模型的可靠性，考慮實際操作情況，將發(fā)酵條件調(diào)整為種齡5 d，裝液量150 mL/300 mL，發(fā)酵時間7 d，通過3次重復(fù)試驗得到胞外多糖平均產(chǎn)量為671.57 μg/mL，與理論值相差1.78%。說明使用該回歸模型優(yōu)化雞樅菌液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的條件是可行的。

2.3 胞外多糖抗氧化能力初步研究

2.3.1 DPPH自由基清除能力

由圖12可知，雞樅菌胞外多糖具有較強的DPPH自由基活性。隨著胞外多糖濃度的增加，清除率顯著提高。當(dāng)胞外多糖質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達到77.18%。

圖12 胞外多糖濃度對DPPH自由基清除率的影響Fig.12 Effect of exopolysaccharide concentration on DPPH free radical scavenging rate

2.3.2 ABTS自由基清除能力

由圖13可知，在胞外多糖質(zhì)量濃度0.2～0.6 mg/mL的范圍內(nèi)，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，ABTS自由基清除能力增強。但多糖濃度超過0.6 mg/mL時，對ABTS自由基清除能力增長減緩。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時，ABTS自由基清除率達95.74%。

圖13 胞外多糖濃度對ABTS自由基清除率的影響Fig.13 Effect of exopolysaccharide concentration on ABTS free radical scavenging rate

2.3.3 OH自由基清除能力

由圖14可知，隨著胞外多糖質(zhì)量濃度的增加，OH自由基清除率隨之提高。當(dāng)胞外多糖質(zhì)量濃度為0.2～0.8 mg/mL范圍內(nèi)，OH自由基清除率增加迅速，但胞外多糖濃度增加，清除率增速放緩。當(dāng)胞外多糖質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時，OH自由基清除率達80.04%。

圖14 胞外多糖濃度對OH自由基清除率的影響Fig.14 Effect of exopolysaccharide concentration on OH free radical scavenging rate

3 結(jié)論

該研究通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗研究了雞樅菌液體深層發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件，并研究了其對DPPH，ABTS，OH自由基的清除效果。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件為麥芽糖6%，酵母提取粉1.5%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，維生素B10.001%，接種量6%，裝液量150 mL/300 mL，種齡5 d，發(fā)酵時間7 d。在此條件下，胞外多糖產(chǎn)量達671.57 μg/mL?？寡趸囼灲Y(jié)果表明，雞樅菌胞外多糖在質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時，對DPPH、ABTS、OH自由基的清除率分別達77.18%、95.74%和80.04%，顯示了雞樅菌胞外多糖在天然保健品中的應(yīng)用具有廣闊的開發(fā)前景。