浩乳德用直投式發(fā)酵劑保護(hù)劑配方優(yōu)化及應(yīng)用

景安琪，張鳳梅，孫立山，吳 楠，雙 全

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.正藍(lán)旗長(zhǎng)虹乳制品廠(chǎng)，內(nèi)蒙古 錫林郭勒盟 027200）

隨著人們生活水平的不斷提高，各種乳及乳制品開(kāi)始被大眾選擇，經(jīng)過(guò)30多年的不懈努力，我國(guó)已成為世界第三大產(chǎn)奶國(guó)[1]，在國(guó)家政策的扶持下，我國(guó)在自制乳制品方面大有突破[2]，但在傳統(tǒng)乳制品這一方面，我國(guó)大部分企業(yè)仍需依靠購(gòu)買(mǎi)進(jìn)口發(fā)酵劑才能進(jìn)行生產(chǎn)，存在著生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)速率低、價(jià)位高等問(wèn)題，因此自主研發(fā)相關(guān)直投式發(fā)酵劑成為了至關(guān)重要的一環(huán)。主流的直投式發(fā)酵劑通常采用真空冷凍干燥法、噴霧干燥法等[3]生產(chǎn)方式，由于噴霧干燥過(guò)程中熱空氣對(duì)乳酸菌的致死效應(yīng)導(dǎo)致干燥后乳酸菌的存活率較低，因而真空冷凍干燥法最為常用，具有避免熱敏感產(chǎn)品的高溫加工，降低產(chǎn)品因熱不穩(wěn)定而造成的損失[4]等優(yōu)勢(shì)，而且冷凍干燥過(guò)程中向菌懸液中添加凍干保護(hù)劑，可以有效防止外界壓力對(duì)細(xì)胞膜磷脂雙分子層的破壞，從而減少低溫、高壓等物理或化學(xué)傷害[5-6]，提高乳酸菌的存活率。

近年來(lái)，很多學(xué)者對(duì)發(fā)酵劑保護(hù)劑進(jìn)行了研究，ZHANG J等[7]以干酪乳桿菌（Lactobacillus casei-Zhang）為研究對(duì)象，根據(jù)細(xì)胞存活率和生理特性，研究了不同凍融保護(hù)劑的凍融效果。結(jié)果表明，添加谷胱甘肽作為理想的低溫保護(hù)劑，可顯著提高存活率達(dá)86.6%。GUL L B等[8]以短乳桿菌ED25為研究對(duì)象，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化凍干保護(hù)劑，得到最佳保護(hù)劑由脫脂乳（17.28%）、乳糖（2.12%）和蔗糖（10%）組成，凍干后對(duì)細(xì)胞活力的保護(hù)率＞99%。柏旭[9]在制備干酪乳桿菌直投式發(fā)酵劑（Directed-Vat-Set，DVS）時(shí)，對(duì)生理鹽水、蔗糖、乳糖、半乳糖、脫脂乳粉、甘油、葡萄糖、甘露糖、甘露醇、海藻糖和谷氨酸鈉11種凍干保護(hù)劑進(jìn)行研究，最終確定海藻糖（49.20%）和谷氨酸鈉（50.80%）復(fù)合凍干保護(hù)劑能夠使干酪乳桿菌凍干存活率從不到10%提升至65.07%。忻勝兵[10]對(duì)適于冰葡萄酒生產(chǎn)的復(fù)合直投式發(fā)酵菌劑工藝進(jìn)行研究，以耐糖酵母CX13和產(chǎn)酯酵母K2"-27為研究對(duì)象，確定復(fù)合凍干劑最優(yōu)保護(hù)劑配方為將海藻糖（7%）、蔗糖（7%）、甘油（4%）、谷氨酸鈉（2%）以及脫脂乳（5%）混合，存活率可達(dá)85.33%。劉剛等[11]在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用正交試驗(yàn)優(yōu)化嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophiles）Q4F8保護(hù)劑的工藝條件，得到最優(yōu)保護(hù)劑配方為脫脂乳120 g/L、谷氨酸鈉10 g/L、甘油60 g/L和海藻糖80 g/L，此條件下存活率達(dá)90.08%。

浩乳德又稱(chēng)為奶豆腐、奶酪，是以生鮮乳為原料，經(jīng)凈乳、發(fā)酵、部分脫脂、加熱、排乳清、凝乳塊乳化、裝模成型等蒙古族傳統(tǒng)工藝制成的奶制品[12-13]，浩乳德中蛋白質(zhì)含量高，其中酪蛋白是主要蛋白質(zhì)，其氨基酸比例平衡，必需氨基酸含量較高，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，消化率接近100%，因此，奶豆腐是人體補(bǔ)充優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的良好來(lái)源[14]。本試驗(yàn)前期從傳統(tǒng)浩乳德發(fā)酵乳中分離純化出一株優(yōu)勢(shì)菌株，編號(hào)為686，經(jīng)16S rDNA鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。為制備菌株686直投試發(fā)酵劑，本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選保護(hù)劑成分，以?xún)龈纱婊盥蕿槟繕?biāo)，結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面分析法，選擇出最優(yōu)保護(hù)劑配比方案。此外，采用菌株686直投試發(fā)酵劑制備浩乳德，并對(duì)其進(jìn)行理化指標(biāo)及掃描電鏡分析，對(duì)其保護(hù)機(jī)制進(jìn)行探討，為生產(chǎn)改進(jìn)型奶酪用直投式發(fā)酵劑的規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

鮮牛乳（水分87.5%、蛋白質(zhì)3.6%、脂肪3.5%、碳水化合物4.8%）：內(nèi)蒙古正藍(lán)旗長(zhǎng)虹乳制品廠(chǎng)提供；脫脂乳粉（蛋白質(zhì)34%、脂肪1%、碳水化合物53.3%）：北京酷來(lái)搏科技有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）686：分離自?xún)?nèi)蒙古正藍(lán)旗長(zhǎng)虹乳制品廠(chǎng)浩乳德（奶豆腐）發(fā)酵乳。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡萄糖（分析純）：天津福晨化學(xué)試劑廠(chǎng)；菊粉：河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；海藻糖、谷氨酸鈉、谷胱甘肽（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉（分析純）：北京化工廠(chǎng)；甘油（分析純）：天津科貿(mào)化學(xué)試劑有限公司；山梨醇（分析純）：美國(guó)Sigma公司；凝乳酶（40 000 U/g）：澳大利亞Clerici Spa公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯、MRS固體培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ESR-500型高剪切分散乳化機(jī)：上海易勒機(jī)電設(shè)備有限公司；KDC-140HR高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BSA223S-CW電子分析天平：德國(guó)Sartorius公司；FDU-2200真空冷凍干燥機(jī)：日本Eyela公司；DW-86L728J超低溫保存箱：海爾集團(tuán)；SX-500全自動(dòng)高壓滅菌鍋：日本TomyDigitalBiology公司；XL30掃描電子顯微鏡：荷蘭Philips公司；K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；SA 402B電子舌：日本Insent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 浩乳德加工工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

均質(zhì)：為防止殺菌過(guò)程中脂肪上浮，將新鮮牛乳放入潔凈的均質(zhì)機(jī)中，在60～65 ℃、20 MPa條件下均質(zhì)30 min。

殺菌：均質(zhì)后將牛乳放入80 ℃的水浴鍋中加熱15 min進(jìn)行巴氏殺菌，迅速冷卻至37 ℃。

接種：菌株686在MRS肉湯中活化2代后，按照2%的接種量加入巴氏殺菌后的牛乳中，發(fā)酵至凝乳，制作成母發(fā)酵液。將母液按照10%的接種量加入牛乳中進(jìn)行發(fā)酵，控制發(fā)酵溫度為37～38 ℃，每隔20 min取樣，測(cè)定其酸度。

凝乳酶進(jìn)行活化：稱(chēng)取2 g食品級(jí)NaCl，用蒸餾水定容至100mL容量瓶中制成質(zhì)量濃度為20g/L的鹽水，滅菌（121℃、15 min）后放入37 ℃水浴鍋，以0.04 g/kg計(jì)算稱(chēng)取凝乳酶的添加量，將稱(chēng)取的凝乳酶倒入小燒杯中，以凝乳酶∶鹽水=1∶50固液比（g∶mL）量取預(yù)熱好的鹽水并倒入盛放凝乳酶的燒杯中進(jìn)行活化，活化30 min備用。

凝乳酶凝乳：待牛乳發(fā)酵酸度達(dá)到22～23°T，加入活化后的凝乳酶，迅速攪拌1 min并將發(fā)酵溫度調(diào)至42 ℃，靜置發(fā)酵凝乳40 min。

切割：凝乳塊達(dá)適當(dāng)硬度時(shí)，用食指斜向插入凝塊中約3 cm，當(dāng)手指向上抬起時(shí)，如裂紋整齊，指上無(wú)小片凝塊殘留且乳清透明時(shí)，即可開(kāi)始進(jìn)行切割。將凝塊切成1 cm3的小方塊，在原溫度下保持10 min。

排乳清：當(dāng)乳清大量析出時(shí)，乳清分兩次排除，第一次排除50%，攪拌5 min，然后排除所有乳清。將干酪粒堆釀，堆釀期間每隔10 min將凝塊上下翻轉(zhuǎn)。

堆釀、加鹽：將堆釀后的凝塊切碎，加入原乳3%的食鹽，攪拌均勻。

熱燙、拉伸：將浩乳德粒裝入容器中，加入85 ℃左右水，反復(fù)揉捏并拉伸折疊，凝塊可拉成絲狀即可。

冷卻、包裝：將浩乳德裝入模具中，放入5～10 ℃的高濃度（20%）鹽水中使其硬化，30 min后取出，進(jìn)行真空包裝，得到浩乳德成品。

1.3.2 菌株培養(yǎng)及凍干菌粉的制備

將保藏的菌株686活化，按照3%的接種量接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h后，在5 500 r/min條件下離心15 min，用0.85%的生理鹽水沖洗兩次后，去除上清液，得到菌泥，參考陳合等[15]的配比方法，加入與菌泥體積比為2∶1的保護(hù)劑，混勻后，于-80 ℃條件下預(yù)冷凍12 h后，真空冷凍干燥24 h，得到凍干菌粉。

1.3.3 凍干存活率

將凍干后的乳酸菌粉加入與凍干前等體積的生理鹽水（濃度為0.85%）進(jìn)行復(fù)水，按照稀釋涂布平板法接入MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，每組做3個(gè)平行。凍干存活率計(jì)算公式如下[16]：

式中：a為凍干存活率，%；m1為凍干前活菌數(shù)，CFU/mL；m2為凍干后活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.4 保護(hù)劑配方優(yōu)化單因素試驗(yàn)[5，17]

經(jīng)查閱大量相關(guān)文獻(xiàn)，將凍干保護(hù)劑分為多元醇類(lèi)、糖類(lèi)、氨基酸類(lèi)、蛋白質(zhì)/肽類(lèi)和聚合物類(lèi)這五大類(lèi)，本試驗(yàn)選擇了多元醇類(lèi)：甘油、山梨醇；糖類(lèi)：葡萄糖、菊粉、海藻糖；氨基酸類(lèi)：谷氨酸鈉；蛋白質(zhì)/肽類(lèi)：脫脂乳和谷胱甘肽，這8種作為凍干保護(hù)劑進(jìn)行研究，添加量分別為3 g/100 mL、6g/100mL、9g/100mL、12g/100mL、15g/100mL、18g/100mL、21 g/100 mL、24 g/100 mL，分別考察各因素對(duì)凍干菌株存活率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化保護(hù)劑配方

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選擇脫脂乳（A）、海藻糖（B）、谷氨酸鈉（C）為3個(gè)影響因素，顯著中心為零水平，高水平和低水平比零水平高或者低1/2個(gè)原始實(shí)際步長(zhǎng)[18]，用Box-Behnken法優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以?xún)龈纱婊盥剩╕）為響應(yīng)值來(lái)確定最佳凍干保護(hù)劑的配比研究，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 保護(hù)劑配方優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for protective agent formulation optimization

1.3.6 掃描電鏡觀測(cè)凍干菌體形態(tài)特征

以添加最優(yōu)保護(hù)劑的凍干菌粉686為試驗(yàn)組，以生理鹽水（0.85%）為保護(hù)劑的乳酸菌686為空白對(duì)照組，用XL30型掃描電子顯微鏡進(jìn)行不同放大倍數(shù)微觀結(jié)構(gòu)的觀察。

1.3.7 改進(jìn)式浩乳德品質(zhì)測(cè)定

用最優(yōu)保護(hù)劑凍干的菌粉686用無(wú)菌0.85%的生理鹽水復(fù)水，以3%的接種量接入脫脂乳中，按照1.3.2中工藝流程制作改進(jìn)式浩乳德，以長(zhǎng)虹乳制品廠(chǎng)生產(chǎn)的傳統(tǒng)浩乳德為對(duì)照組，根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》[19]、GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[20]、GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》[21]及GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定》[22]中規(guī)定方法測(cè)定水分、蛋白質(zhì)、脂肪及灰分，用電子舌對(duì)滋味進(jìn)行測(cè)定。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016、SPSS 22.0進(jìn)行處理分析，用Origin 8.5進(jìn)行圖片處理制作，用Design-Expert 11.0.3進(jìn)行響應(yīng)面模型擬合并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 保護(hù)劑配方優(yōu)化單因素試驗(yàn)

由圖1可知，保護(hù)劑為脫脂乳、海藻糖及谷氨酸鈉時(shí)，凍干存活率顯著高于其他組（P＜0.05），當(dāng)保護(hù)劑為12.0 g/100 mL脫脂乳時(shí)出現(xiàn)峰值（79.08%）；在谷氨酸鈉質(zhì)量濃度為15.0 g/100 mL時(shí)，菌株686出現(xiàn)最高存活率（76.78%）。脫脂乳的積極作用可以歸因于其提供涂層的能力，在冷凍干燥過(guò)程中保護(hù)微生物細(xì)胞的膜[4]；谷氨酸鈉的保護(hù)機(jī)制被認(rèn)為是保護(hù)劑中的氨基與細(xì)菌蛋白質(zhì)的羧基之間反應(yīng)的結(jié)果，從而穩(wěn)定了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[23]；大量試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在海藻糖中存活率較高，是較優(yōu)質(zhì)的凍干保護(hù)劑，并經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)海藻糖能和細(xì)胞膜中的某些成分形成氫鍵作用，取代水的位置，保護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[24-25]，提高乳酸菌的存活率，通過(guò)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)海藻糖質(zhì)量濃度為6.0 g/100 mL和18.0g/100 mL時(shí)，存活率出現(xiàn)兩次峰值（74.69%和77.76%），但考慮到實(shí)際應(yīng)用及成本費(fèi)用等因素，盡量選擇低成本、高效率的保護(hù)劑。因此，本試驗(yàn)選擇脫脂乳12.0 g/100 mL、海藻糖6.0 g/100 mL、谷氨酸鈉15.0 g/100 mL三種凍干保護(hù)劑進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖1 不同保護(hù)劑對(duì)菌株686凍干存活率的影響Fig.1 Effect of different protective agent on freeze-drying survival rates of strain 686

2.2 凍干保護(hù)劑配方優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以脫脂乳（A）、海藻糖（B）和谷氨酸鈉（C）添加量為自變量，以?xún)龈纱婊盥剩╕）為響應(yīng)值，利用Design-Expert 11.0.3軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。經(jīng)回歸擬合后得到菌株686凍干存活率的回歸方程如下：

表2 保護(hù)劑配方優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for protective agent formulation optimization

由表3可知，模型P＜0.000 1，說(shuō)明回歸模型極顯著，且失擬項(xiàng)P值＞0.05，證明試驗(yàn)誤差較小，可以用該模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析[26]。一次項(xiàng)A、C，交互項(xiàng)AB，二次項(xiàng)A2、B2和C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)B對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。比較F值可知，對(duì)菌株686凍干存活率影響順序?yàn)锳脫脂乳＞C谷氨酸鈉＞B海藻糖。

響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖可以反映兩因素之間的交互作用，響應(yīng)面越陡峭說(shuō)明兩自變量間的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響程度越大，相反，則不顯著，同時(shí)等高線(xiàn)越接近橢圓，兩因素的交互作用越顯著，越接近圓形則交互作用越不顯著[27-29]。

固定谷氨酸鈉為零水平，脫脂乳和海藻糖對(duì)凍干存活率的影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)見(jiàn)圖2。由圖2可知，因素AB響應(yīng)面曲面陡峭，等高線(xiàn)接近橢圓，因此因素AB之間是有顯著的交互作用（P＜0.05）；當(dāng)脫脂乳為低濃度時(shí)，存活率隨著海藻糖濃度增加呈先上升至某一值后緩慢下降的趨勢(shì)，這可能是由于高濃度的保護(hù)劑可以加速細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)聚合，形成較強(qiáng)的玻璃化結(jié)構(gòu)，反而不利于細(xì)胞的保存，且復(fù)水效果不好[30]；將海藻糖濃度固定時(shí)，存活率隨著脫脂乳濃度增加呈迅速上升至某一值后緩慢下降的趨勢(shì)。且通過(guò)響應(yīng)面圖形可看出，脫脂乳上升幅度比海藻糖陡峭，說(shuō)明脫脂乳對(duì)存活率的影響更大，這與方差分析結(jié)果一致。

圖2 脫脂乳和海藻糖交互作用對(duì)菌株686凍干存活率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)Fig.2 Response surface plots and contour lines of effect of interactions between degreased milk and trehalose on freeze-drying survival rates of strain 686

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)建立模型進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化分析[31]，以?xún)龈纱婊盥首罡咧禐閮?yōu)化目標(biāo)，得到菌株686的最佳保護(hù)劑配方為脫脂乳添加量12.348 g/100 mL，海藻糖添加量5.963 g/100 mL，谷氨酸鈉添加量14.485 g/100 mL，在此優(yōu)化配方條件下，菌株686凍干存活率理論值為80.90%。為了便于實(shí)際操作，將上述優(yōu)化配方條件修正為脫脂乳添加量12.5 g/100 mL，海藻糖添加量6.0 g/100 mL，谷氨酸鈉添加量14.5 g/100 mL。在此優(yōu)化配方條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，菌株686凍干存活率實(shí)際值為81.59%，與預(yù)測(cè)值基本吻合，說(shuō)明本次試驗(yàn)?zāi)Ｐ褪强尚械摹?/p>

2.4 掃描電鏡觀測(cè)凍干菌體形態(tài)特征

為觀察添加保護(hù)劑前后的凍干狀態(tài)，對(duì)植物乳桿菌686凍干菌粉進(jìn)行掃描電鏡測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 凍干菌株686凍干菌粉的掃描電鏡結(jié)果Fig.3 Scanning electron microscope results of freeze-drying powder of strain 686

由圖3可知，未添加保護(hù)劑的菌體均暴露于表面，完整性差，極易受到各種物理及化學(xué)損傷，有些菌體已經(jīng)變型甚至破裂，菌體之間有拉絲狀物質(zhì)，因而存活率低。加入保護(hù)劑的樣品在凍干后介質(zhì)呈現(xiàn)出多孔疏松的結(jié)構(gòu)，更利于迅速?gòu)?fù)水及速溶的特性。并且添加保護(hù)劑組幾乎看不到菌體，菌體被完整的包埋于保護(hù)劑中，從而避免受到外界傷害，提高了乳酸菌的存活率，這與蘇萍等[32-33]的研究結(jié)果相似。

2.5 改進(jìn)浩乳德品質(zhì)特性

由圖4可知，將對(duì)試驗(yàn)組及對(duì)照組進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，試驗(yàn)組與對(duì)照組浩乳德水分分別為50.28%和52.36%，無(wú)顯著差異（P＞0.05）；試驗(yàn)組蛋白質(zhì)含量25.16%，高度顯著高于對(duì)照組（P＜0.001），說(shuō)明在制作浩乳德過(guò)程中，排出乳清較為清澈，蛋白質(zhì)流失較少；試驗(yàn)組的脂肪含量為20.8%，對(duì)照組為19.8%，極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；試驗(yàn)組與對(duì)照組分含量分別為3.32%和3.19%，試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），可能是由于試驗(yàn)組水分含量比對(duì)照組低，因此灰分含量上升。

圖4 改進(jìn)前后浩乳德理化指標(biāo)Fig.4 Physicochemical indexes of Haorude before and after improvement

本試驗(yàn)采用電子舌系統(tǒng)檢測(cè)兩組浩乳德的6種基本滋味和3種回味，試驗(yàn)組與對(duì)照組具有相似滋味得分輪廓，差異很小，無(wú)法看出二者的區(qū)別。因此進(jìn)一步進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，改進(jìn)前后各滋味指標(biāo)得分及差異性分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 改進(jìn)前后浩乳德各滋味指標(biāo)及差異性分析Table 4 Taste indexes and difference analysis of Haorude before and after improvement

由表4可知，試驗(yàn)組與對(duì)照組在酸味、苦味、澀味、回味-A及回味-B無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明試驗(yàn)組與對(duì)照組均無(wú)不良風(fēng)味，而試驗(yàn)組在咸味及甜味與對(duì)照組有顯著差異（P＜0.01），可能是由于試驗(yàn)組在浸泡完鹽水后，立即取出進(jìn)行測(cè)試，表面鹽水濃度過(guò)高，導(dǎo)致咸味值高，后續(xù)可通過(guò)工藝優(yōu)化來(lái)解決此問(wèn)題；試驗(yàn)組的鮮味值顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），可能是因?yàn)樘砑恿税l(fā)酵乳酸菌液，乳酸菌將大分子的蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生各種游離氨基酸（如天冬氨酸、谷氨酸等），因此鮮味有所提高[34]，同理，試驗(yàn)組的豐富度也高度顯著高于對(duì)照組（P＜0.001）。

直投式發(fā)酵劑發(fā)酵的浩乳德在滋味方面與市售浩乳德相似，脂肪、蛋白質(zhì)、灰分的含量?jī)?yōu)于市售傳統(tǒng)浩乳德，可對(duì)直投式發(fā)酵劑替代傳統(tǒng)浩乳德生產(chǎn)進(jìn)行更深入的研究。

3 結(jié)論

本研究以菌株686的凍干存活率為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面分析法確定了保護(hù)劑最佳配方為脫脂乳12.5 g/100 mL，海藻糖6.0g/100 mL，谷氨酸鈉14.5 g/100 mL。在此優(yōu)化條件下，菌株686的凍干存活率為81.59%。掃描電鏡結(jié)果表明優(yōu)化的保護(hù)劑對(duì)穩(wěn)定乳酸菌686菌體形態(tài)起到良好的保護(hù)作用，對(duì)微生物細(xì)胞膜也有較好的保護(hù)效果。將直投式發(fā)酵劑用于改進(jìn)式浩乳德后測(cè)得水分、蛋白質(zhì)、脂肪及灰分分別為50.28%、25.16%、22.8%及3.76%，與市售浩乳德相比有所提高；電子舌測(cè)得改進(jìn)式浩乳德與市售浩乳德得分輪廓相似，在鮮味及豐富度優(yōu)于市售浩乳德。

結(jié)果表明，此配方凍干保護(hù)劑有效的提高了乳酸菌的存活率，且直投式發(fā)酵劑制作浩乳德在滋味方面基本無(wú)差異，理化指標(biāo)顯著優(yōu)于市售浩乳德，為后續(xù)高效率且低成本的優(yōu)質(zhì)浩乳德開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。