基于ITS DNA條形碼技術(shù)的牛至及其混偽品鑒定研究

卓 維，任風(fēng)鳴*，劉 艷，盧圣鄂，朱 軍

(1. 重慶市藥物種植研究所 特色生物資源研究與利用川渝共建重點實驗室，重慶 南川 408435；2. 新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830004)

牛至(OriganumvulgareL.)，又名滇香薷，是唇形科(Labiatae)牛至屬(Origanum)多年生草本植物，該屬約有15～20個種，多分布于地中海至中亞地區(qū)等地，中國僅有牛至一種，主要分布在浙江、四川、云南、新疆等地[1]。牛至全草入藥，具有抗病毒、抗菌、抗氧化等作用，是一種優(yōu)良的天然植物抗生素[2-3]。從牛至中提取的牛至精油，抗菌作用顯著[4-5]，可提高機體免疫力，促進動物生長，作為抗生素替代品在飼料中廣泛使用[6-8]。從2020年7月1日起，我國全面禁止藥物源抗生素在飼料中添加(不包括中草藥)。牛至作為優(yōu)良的抗生素替代品，市場需求激增，原料供不應(yīng)求，導(dǎo)致大量混偽品出現(xiàn)。而不同產(chǎn)地牛至表型差異大[10]，形態(tài)相似的植物較多，尤其在干燥加工后，葉片呈卷曲狀，花脫落，通過形態(tài)學(xué)方法難以進行準確鑒定。大量混偽品混跡市場，嚴重影響牛至產(chǎn)品的安全性和有效性，迫切需要建立快速、有效的鑒定方法。

近年來，國內(nèi)外對牛至的研究主要集中在牛至油化學(xué)成分的提取與分析[10]、活性成分應(yīng)用[11-12]、動物生產(chǎn)應(yīng)用和飼料添加劑開發(fā)[13]、牛至種下類群研究[14-15]等方面，對牛至屬植物基原鑒定的研究較少。牛至屬基原鑒定主要是采取性狀鑒別和顯微鑒定法兩種傳統(tǒng)方法，宮海燕等[16]首次使用顯微法對新疆牛至不同部位的性狀及顯微特征進行分析。但是，這類方法主觀性較強，需要精準的結(jié)構(gòu)圖為參考資料，鑒別人員也需專業(yè)的知識背景，這使得準確鑒定較為困難。而DNA條形碼是基因組中一段高度保守的DNA片段，鑒定方法不受個體形態(tài)特征和發(fā)育階段影響、從基因水平上客觀區(qū)分物種，同時該方法操作步驟簡單、穩(wěn)定性較好，常被用于植物的快速識別與鑒定[17]。余春霞等[18]研究巴西牛至屬植物藥HORTELA時，發(fā)現(xiàn)性狀鑒別和顯微特征均不能準確鑒定其基原，而通過DNA條形碼能確定其基原植物。本試驗采用ITS DNA條形碼技術(shù)，通過BLAST比對、K2P遺傳距離、SNP分析以及NJ樹4種方法評估其鑒定效率，以期尋找牛至快速、精準的分子鑒定方法，為牛至的安全、有效利用提供依據(jù)和支撐。

1 材 料

1.1 植物材料

本研究涉及74份研究對象，包括牛至屬(Origanum)9個種、薄荷屬(Mentha)2個種、香薷屬(Elsholtzia)3個種、石薺苧屬(Mosla)1個種，并選擇荊芥(Nepetahormozganica)和益母草(Leonurusjaponicus)為外類群。采集的植物樣本來源于云南大理、昆明、麗江及重慶云陽、長壽、渝北等地，經(jīng)重慶市藥物種植研究所劉正宇研究員鑒定后，取新鮮葉片硅膠干燥保存?zhèn)溆?，樣品信息見?。

表1 樣品信息Table 1 Experimental sample information

表1 樣品信息Table 1 Experimental sample information

1.2 試劑

植物基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)購自北京君諾德生物技術(shù)有限公司；PCR擴增使用的I-5TM2×High-Fidelity Master Mix購自北京擎科生物科技有限公司；DL 2000 DNA maker購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；ITS引物合成由擎科生物科技有限公司完成；其他實驗試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

2 方 法

2.1 植物DNA提取

參照植物基因組DNA快速提取試劑盒說明書，選擇干燥后的植物葉片用球磨儀以1 800次/min研磨2 min，稱取樣品細粉20 mg，按照說明書提取樣品基因組DNA，電泳檢測條帶，分光光度計測定純度和質(zhì)量后置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PCR擴增與測序

試驗反應(yīng)體系為25 μL，包括正反向引物(10 μmol/L)各0.6 μL，2×High-Fidelity Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.8 μL，模板DNA 2 μL。擴增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s，53℃退火30 s，72℃延伸40 s，38個循環(huán)。ITS引物(F：5'-CCTTATCATTTAGAGGAAGG-3'，R：5'-TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3')，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至北京擎科生物有限公司測序。

2.3 數(shù)據(jù)分析

測序結(jié)果用Bod Edit和DNAMAN軟件對序列進行編輯和拼接；使用軟件ClustalX和MEGA 7.0.14對齊序列，分析樣本序列特征，堿基變異位點，并使用MEGA軟件中K2P雙參數(shù)模型計算遺傳距離。將獲得的完整序列建立NJ系統(tǒng)進化樹，設(shè)置bootstrap值為1 000。用相似性搜索BLAST法于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫對序列進行比對。

3 結(jié)果與分析

3.1 ITS序列特征

本試驗采集的牛至及其混偽品樣品經(jīng)PCR擴增ITS序列，電泳凝膠成像檢測后在500～750 bp中間呈現(xiàn)單一且明亮條帶，擴增成功率為100%。純化回收送至公司測序，測序成功率均為100%。分析74條ITS序列的特征(表2)，發(fā)現(xiàn)序列長度為631～661 bp，堿基C+G含量在55.3%～65.6%；其中牛至ITS序列長度為646～659 bp，堿基C+G含量在58.1%～58.7%。

表2 樣本ITS序列特征Table 2 Sample ITS sequence characteristics

不同屬植物的種內(nèi)變異位點存在差異，其中牛至(O.vulgare)、留蘭香(M.spicata)、球花香薷(E.strobilifera)以及荊芥草(N.hormozganica)的種內(nèi)變異位點較多，分別含有8個、8個、11個和22個變異位點；而O.boissieri、O.sipyleum、石香薷(M.chinensis)和百里香(T.mongolicus)無變異位點。

3.2 BLAST法比對序列

將獲得的30份牛至及其混偽品樣品ITS序列上傳數(shù)據(jù)庫獲得ID號，并通過BLAST法于NCBI數(shù)據(jù)庫比對序列，選擇相似度最高的物種，比對結(jié)果顯示(表3)：牛至、薄荷、野香草、香薷、球花香薷和石香薷均鑒定成功，最高相似度序列均為對應(yīng)物種，而留蘭香最高相似序列為Menthacanadensis(KC473228.1)有98.62%，其次為Menthaspicata(DQ667244.1)有98.47%，但其相似物種均為薄荷屬植物，未有牛至屬植物，即通過BLAST法能夠成功鑒定牛至樣品。

表3 試供樣品在NCBI中BLAST鑒定結(jié)果Table 3 BLAST identification results of test samples in NCBI

3.3 遺傳距離分析

基于K2P遺傳距離模型計算ITS序列的種間、種內(nèi)遺傳距離(表4)。試驗樣品ITS序列的種內(nèi)平均遺傳距離為0.002(0～0.008)，種間平均遺傳距離為0.125(0.008～0.239)，樣品的種間最小遺傳距離均大于種內(nèi)最大遺傳距離。故通過遺傳距離分析能夠成功鑒定牛至及其混偽品。

表4 試驗樣品ITS序列的遺傳距離Table 4 The genetic distance of the ITS sequence of the test sample

“Barcoding gap”是指理想DNA條形碼中種內(nèi)遺傳距離明顯小于種間距離，兩者之間存在明顯的界限。K2P遺傳距離模型中樣品ITS序列的種間平均遺傳距離是種內(nèi)平均遺傳距離的56.82倍，遺傳距離分布圖具有明顯的“Barcoding gap”，未有樣品重疊(圖1)，故ITS序列可作為牛至及其混偽品的DNA條形碼。

圖1 牛至及其混偽品ITS序列的遺傳距離分布圖Fig. 1 The barcoding map of ITS sequences in O.vulgare and its adulterants

3.4 SNP位點分析

利用MEGA軟件比較74條ITS序列變異位點，尋找特異性SNP，結(jié)果表明(圖2A)：牛至屬內(nèi)存在2個穩(wěn)定的變異位點，第36位堿基均為T，第535位堿基均為A，明顯區(qū)別于混偽品，但牛至無特異性SNP，故不能通過SNP位點鑒定牛至及其混偽品。

同時，發(fā)現(xiàn)牛至屬不同種ITS序列中共存在21個變異位點(圖2B)，除牛至無特異性SNP位點，其他8個種均有SNP位點。其中，O.grosii、O.dictamnu、O.onites有1個SNP位點，O.elongatum、O.majorana、O.boissieri有2個SNPs位點，O.syriacum有3個SNPs位點，O.sipyleum有9個SNPs位點。

圖2 SNP位點分析Fig. 2 SNP locus analysis注：A圖為樣品的SNP位點分析，B圖為牛至屬下9個種的SNP位點分析。

3.5 系統(tǒng)進化樹分析

基于74條ITS序列構(gòu)建牛至及其混偽品NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類結(jié)果如圖所示(圖3)：牛至屬植物聚為一大支，自展支持率為99%，牛至、O.grosii、O.elongatum、O.majorana等9個種分別單獨聚為一支，聚集度較好，具有良好的單系性；而混偽品百里香、薄荷、留蘭香、野香草、香薷、球花香薷、石香薷分別單獨聚為一支，未出現(xiàn)與牛至交叉現(xiàn)象，自展支持率均大于50%；外類群益母草和荊芥草位于進化樹外圍，單獨聚為一支。在NJ樹中，牛至與百里香、薄荷、香薷等7種混偽品聚于不同分支，故NJ樹能夠有效鑒定牛至及其混偽品。

圖3 基于ITS序列構(gòu)建NJ聚類樹Fig. 3 Constructing clustering Neighbor-Joining tree based on ITS sequence

4 討 論

我國農(nóng)業(yè)部已經(jīng)批準牛至油作為一種藥物飼料添加劑可長期在飼料中使用，歐盟食品安全局亦評估牛至精油為安全的動物飼料添加劑[19]。隨著全面飼料“禁抗”政策實行，牛至作為天然植物“抗生素”，具有廣闊的市場發(fā)展和應(yīng)用前景[20]。但隨著牛至原料需求量增加，市場上出現(xiàn)大量混偽品，薄荷、香薷、百里香等植物常被混為牛至使用。因此，本研究基于ITS序列對牛至及混偽品進行分子鑒定，發(fā)現(xiàn)BLAST法、K2P遺傳距離法、NJ樹可成功鑒定牛至及其混偽品，鑒定效率為100%；而SNP分析不能成功鑒定牛至。BLAST法中牛至樣品相似度最高的序列為99.85%(Origanumvulgare, MH645777.1)，且無其他物種混雜；遺傳距離分析顯示樣品的種間最小遺傳距離均大于種內(nèi)最大遺傳距離，存在明顯“Barcoding gap”；NJ進化樹中牛至樣品聚為一支，呈單系群，同一種植物聚類明顯無交叉，故ITS序列可作為牛至鑒定的DNA條形碼。

遺傳多樣性是指不同種群之間或一個種群內(nèi)不同個體的遺傳變異，種內(nèi)的遺傳變異程度決定其種群進化的趨勢[21]。目前，關(guān)于牛至屬遺傳多樣性方面的研究主要集中在國外，Kaoutar等[22]使用微衛(wèi)星基因座將摩洛哥OriganumcompactumL.分為3大種群，種群之間高度分化(Fst = 0.22)，基因流率低(Nm = 0.88)，推測是由于生境干擾而導(dǎo)致的種群隔離。El-Shaimaa等[23]使用AFLP法發(fā)現(xiàn)牛至屬植物具有豐富的多態(tài)性信息。而Karagoz等[24]通過iPBS標(biāo)記將土耳其牛至(Origanumacutidens)分為3個主群8個亞群，群體間遺傳分化小(Fst = 0.22)，雜合度為0.354。本研究采集了云南昆明、大理、麗江三個地區(qū)的牛至樣品，其種內(nèi)平均遺傳距離為0.002，NJ樹中三個地區(qū)的牛至樣品相互交叉聚為一大支，表明云南地區(qū)的牛至群體間遺傳分化小，親緣關(guān)系近，未呈現(xiàn)因地理距離導(dǎo)致的種群分化。結(jié)合前人對不同地域牛至屬植物遺傳多樣性的研究[21-24]，發(fā)現(xiàn)不同地域的牛至屬種群遺傳多樣性呈現(xiàn)不同的分化模式，這可能是因為地理環(huán)境影響導(dǎo)致種群隔離，基因交流頻率低，親緣關(guān)系逐漸變遠，形成種內(nèi)高度分化[25]，也可能與牛至繁育方式(花粉、種子)，自然環(huán)境相關(guān)，導(dǎo)致呈現(xiàn)不規(guī)律的遺傳分化。

單核苷酸多態(tài)性SNP分子標(biāo)記具有數(shù)量多、分布廣、遺傳穩(wěn)定等特點，是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ姆肿訕?biāo)記[26]。該技術(shù)已成功應(yīng)用于中藥材及其混偽品的鑒定，包括三七[27]、柴胡[28]、人參[29]、黃芪[30]等常用藥材的分類與鑒定。除此之外，SNP分子標(biāo)記也用于同屬多種(亞種)植物的分類與親緣關(guān)系分析。蘭青闊等[31]研究貝母屬種下分類與川貝母中藥資源鑒定時發(fā)現(xiàn)，川貝母、浙貝母等的葉綠體基因組序列上均有獨特的SNP鑒定位點。盧媛等[32]利用SNP標(biāo)記芯片技術(shù)對49份不同來源的糯玉米和普通玉米自交系進行全基因組掃描，旨在將譜來源不清晰的玉米品種明確歸類。本研究中，發(fā)現(xiàn)牛至屬O.grosii、O.elongatum、O.syriacum等8個種均有獨特的變異位點，通過這些SNP 位點可成功區(qū)分牛至屬8個種，這為牛至屬下分類與鑒定提供參考依據(jù)，該變異位點亦是潛在分子標(biāo)記。本研究利用DNA條形碼技術(shù)，通過ITS序列成功鑒定牛至及其混偽品，找到牛至屬種內(nèi)鑒定與分類的潛在SNP分子標(biāo)記，這不僅為正確區(qū)分牛至、減小市場上混淆品使用，規(guī)范、安全合理地利用牛至資源提供理論支持，而且為牛至種質(zhì)資源評價、遺傳多樣性研究和豐富牛至屬DNA條形碼數(shù)據(jù)庫提供幫助。