多花黃精內生真菌多樣性研究

程子洋，黃宇飛，鄔家成，孫 濤，王國凱

(1.黃山學院 化學化工學院，安徽 黃山245041；2.安徽中醫(yī)藥大學 中藥研究與開發(fā)安徽省重點實驗室，安徽 合肥230012；3.安徽中醫(yī)藥大學 醫(yī)藥信息工程學院，安徽 合肥230012)

多花黃精（Polygonatum cyrtonemaHua.）是百合科多花黃精屬植物[1]，為“十大皖藥”之一，是我國傳統(tǒng)中藥，最早由《名醫(yī)別錄》記載，也是2020年版《中國藥典》收載的3種黃精之一，常以干燥根莖入藥。多花黃精根狀莖肥厚，通常連珠狀或結節(jié)成塊，廣泛分布在江西、湖南等地區(qū)[2]，大多生長于灌木叢、山林或者山坡背陰處。藥理研究表明多花黃精具有延緩衰老、養(yǎng)陰生津、抗骨質疏松、抗疲勞、抗癌、抗糖、調節(jié)免疫力、神經保護作用等[3,4]，其營養(yǎng)價值也十分豐富[5]，在藥膳、保健品、化妝品、食品和飼料添加劑等方面都具有很高的開發(fā)價值,市場前景廣闊[6,7]。多花黃精中富含皂苷、黃酮、蒽醌、多糖、木質素等化合物[8,9]，具有良好的藥用價值。

植物內生真菌是寄生于健康植物，并不使寄主表現(xiàn)任何疾病癥狀的一類真菌[10]。植物與內生真菌形成良好的生態(tài)共生關系，內生真菌可以從植物中吸取自己所需的營養(yǎng)物質，也在促進植物正常的生長發(fā)育進化過程中起到重要的作用，比如內生真菌的代謝物可以刺激植物的生長發(fā)育，幫助植物抵御自然病蟲害的侵襲，也能夠增強宿主植物的抗旱能力、毒性、減少動物的傷害，從而形成兩者之間的共生互作。近些年對內生真菌的研究方向主要集中在次生代謝產物方面，在藥物植物中的內生真菌大部分存在藥理活性物質，例如抗氧化、抑制腫瘤生長等。同時，藥物植物內生真菌是發(fā)現(xiàn)活性化合物以及新藥源的潛在資源[11,12]。內生真菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)天然的組成部分，對植物有多方面的積極作用。因植物內生菌有充分的碳源和氮源供應，相對于暴露在外界的惡劣環(huán)境更有利于發(fā)揮生物防治作用[13]。目前，國內外對多花黃精的研究報道較少，李艷玲等[14]研究了泰山黃精內生真菌的分布及其多樣性，并篩選具有抑菌活性的內生真菌。黃銀芳等[15]對多花黃精不同組織部位內生真菌進行分離并進行抗菌活性篩選。曹冠華等[16]調查不同產地滇黃精根系中叢枝菌根真菌和深色有隔內生真菌定殖情況，并探討其與主要功效成分之間的相關性。本研究從多花黃精中分離出多種內生真菌，豐富了多花黃精內生真菌的資源，以期為多花黃精的綜合開發(fā)利用提供依據。

1 實驗部分

1.1 實驗原料

多花黃精（Polygonatum cyrtonemaHua.）2019年7月采自安徽省黃山市休寧縣商山鎮(zhèn)，經安徽中醫(yī)藥大學謝冬梅副教授鑒定。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）不含抗生素，北京奧博星生物技術有限責任公司提供。

1.2 實驗儀器

SPT-P250C智能生化培養(yǎng)箱（合肥華德利）；SW-CJ-2FD雙人單面超凈工作臺（蘇州蘇潔）；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安）；TGL-16G臺式離心機（上海安亭）；植物/真菌基因組DNA小量提取試劑盒（天根生化）；G-BOX凝膠成像系統(tǒng)（Syngene公司）；DYY-8C電泳儀（北京六一）。

2 實驗方法

2.1 內生真菌的分離、純化

采用組織塊分離法。取多花黃精新鮮健康植株根部，去須根，蒸餾水沖洗，濾紙吸干水分，放置陰涼處風干。在超凈工作臺依次進行以下消毒步驟：75%乙醇浸泡2min，5%次氯酸鈉沖洗3min，75%乙醇沖洗30s，無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸干表面水分。吸取200μL最后一次沖洗的無菌水，用無菌涂布棒均勻涂布在PDA表面，作為空白對照，平行3份。取經過處理的多花黃精，無菌濾紙充分吸干水分，切成0.2×0.2cm小塊。將組織塊接種于PDA培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)基中4塊，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-14d。采用尖端菌絲挑取法挑取不同形態(tài)的菌絲，移至新PDA培養(yǎng)基中純化，純化培養(yǎng)2-4代后，將內生真菌轉移到PDA斜面培養(yǎng)基，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 內生真菌的形態(tài)鑒定

將內生真菌置于PDA培養(yǎng)基28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-10d，觀察真菌菌落大小、菌絲形態(tài)、表面特征、產孢結構類型及孢子形態(tài)等，參照《真菌鑒定手冊》[17]進行初步鑒定。

2.3 分子鑒定

挑取適量單一菌絲體，置酒精燃燒消毒并冷卻后的研缽中。加入液氮3次冷凍菌絲體，充分研磨后，按照基因組DNA小量提取試劑盒操作步驟，得到DNA提取液。然后將DNA溶液置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用擴增真菌引物對ITS1/ITS4進行PCR擴增，序列：ITS15′-TCCGTAGGTGAACCTGC?GG-3′，ITS45′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，50μL體系進行PCR擴增，如表1。

表1 PCR擴增rDNA-ITS的反應體系

測序結果在GenBank數據庫中進行同源性比對。利用美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫BLAST中已知序列對其進行相似性分析與鑒定，得到真菌的分類并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.4 分離頻率

分離頻率[18]（isolation frequency，IF）=分離到的各屬內生真菌的菌株數÷內生真菌分離菌株總數×100%。當IF>10%時，定義為優(yōu)勢屬，當5%

3 結果

3.1 內生真菌的分離

通過組織塊分離法，從多花黃精中分離得到70株內生真菌，分屬于21屬59種。其中Diaporthe5株，F(xiàn)usarium23株，Arthrinium1株，Phomopsis2株，Rhizopus2株，Aspergillus5株，Talaromyces4株，Peni?cillium5株，Cladosporium1株，Alternaria5株，Clonos?tachys2株，Colletotrichum3株，Macrophomina1株，Sordariomycetes1株，Neurospora1株，Gliocladiopsis3株，Setophoma1株，Ascomycete1株，Kohlmeyeriop?sis1株，Trichoderma2株，Gibberella1株。

3.2 形態(tài)學的鑒定

分離得到的內生真菌通過菌落對比和顯微觀察，HJ1、HJ14、HJ52、HJ73、HJ78子囊果壁亞革質，內部灰色，有長喙，子囊梭形，子囊孢子梭形至橢圓形，無色。HJ4、HJ44、HJ49、HJ66、HJ70表面菌絲呈棉絮狀，較密集，分生孢子梗單生或集成分生孢子座，或產生輪輻狀排列的瓶型小梗，大型孢子微彎或兩端尖而彎曲顯著，鐮刀型，小型孢子長圓形，直或微彎。HJ16、HJ53菌絲在基質面跳躍式蔓延，并在與基質接觸點產生黑褐色假根深入基質，孢囊梗由假根處的匍匐菌絲生出，孢子囊先呈白色，后變?yōu)榍嗪谏?，表面有針形結晶，容易消融。囊軸與囊壁基部相結合，在囊壁消失后與中軸基連城棍棒形。HJ42分生孢子梗簇生，顏色較暗，從生成為黑點，形狀和大小變化較大，呈卵圓形或圓筒形。在培養(yǎng)過程中生長度極慢。HJ27、HJ37、HJ39、HJ41、HJ43菌落生成大量小顆粒狀孢子團，產生綠色或黑色孢子粉，分生孢子梗垂直生出，多無隔膜，頂端膨大成橢圓形、半圓形、球形或棍棒形的泡囊。HJ31、HJ56、HJ58、HJ79小梗細長，分生孢子橢圓形，兩端尖，光滑，帶暗藍綠色至灰綠色。HJ32、HJ55、HJ57、HJ62、HJ87菌落綠色、黃綠色、青綠或灰綠色，分生孢子串呈不分枝鏈狀，球形、卵圓形、橢圓形的單個孢子，光滑或粗糙，無色、綠色或其他雜色。HJ50、HJ51、HJ54、HJ64、HJ74分生孢子暗色，有縱橫隔膜，倒棍棒形，橢圓形或卵形，形成鏈，頂端有喙狀的附屬絲。HJ23、HJ60、HJ77分生孢子盤先埋葬后暴露，深色，分生孢子梗短，不分枝，分生孢子圓筒形至紡錘形。HJ16、HJ53孢子囊先呈白色，后變?yōu)榍嗪谏?，半球形或球形，表面平滑或有針形結晶，容易消融。HJ63分生孢子較為狹長，分生孢子橢圓形至棍棒形，微彎，菌核呈黑色。HJ65子囊殼表生，壁膜質或革質，有少量的毛，略透明，有孔口，口內有周絲，子囊圓筒形，子囊之間有側絲，一般為膠質膜所包圍。HJ72子囊殼有毛，壁亞革質或炭質，頂部突起處生孔口，子囊圓筒形。HJ85表面菌絲發(fā)達，有隔膜，可直接產生孢子或孢子梗，或集結成為菌核或子座，分生孢子大都外生，暴露于外或分生孢子器中。HJ59、HJ76菌落呈白色，分生孢子密生于小梗的頂端，螺旋形排成簇狀。HJ82、HJ83、HJ88分生孢子光滑，在培養(yǎng)基上初為無色，后轉灰褐色，背部暗褐色至黑褐色，厚桓孢子結集成不規(guī)則的球形。HJ94、HJ97菌落菌叢密集，菌絲側枝分生出孢子梗，直立，分枝，小枝常對生，頂端不膨大，上生分生孢子團，分生孢子球形，淺色或無色。HJ94、HJ97菌落初期為白色，漸變?yōu)榉凵蜃仙?，生長迅速，分生孢子梗從菌絲的側枝上生出，直立，分枝，小枝常對生，頂端不膨大，上生分生孢子團。菌株HJ71因不產生孢子，因此形態(tài)學和顯微鑒定無意義。參考《真菌鑒定手冊》，鑒定菌株HJ1、HJ14、HJ52、HJ73、HJ78為腐皮殼屬（Diaporthe）；HJ4、HJ44、HJ49、HJ66、HJ70為鐮孢霉屬（Fusarium）；HJ27、HJ37、HJ39、HJ41、HJ43為曲霉屬（Aspergillus）；HJ31、HJ56、HJ58、HJ79為黃絲曲霉屬（Talaromyces）；HJ32、HJ55、HJ57、HJ62、HJ87為青霉屬（Penicilli?um）；HJ50、HJ51、HJ54、HJ64、HJ74為交鏈孢霉屬（Alternaria）；HJ23、HJ60、HJ77為刺盤孢菌屬（Colle?totrichum）；HJ16、HJ53為根霉屬（Rhizopus）；HJ85為子囊菌屬（Ascomycete）；HJ94、HJ97為木霉屬（Trichoderma）；HJ98為赤霉屬（Gibberella）。形態(tài)與顯微形態(tài)特征如圖1所示。

圖1 內生真菌菌落及顯微結構

3.3 分子生物學鑒定

3.3.1 PCR擴增產物電泳

PCR擴增后，產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，在550bp左右處可見單一明亮的條帶。

3.3.2 對比rDNA-ITS序列、構建系統(tǒng)發(fā)育樹

對比美國國家生物技術信息中心國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology In?formation，NCBI)（www.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫已知序列，結果見表2。利用MEGA4.0和ClustalX軟件構建rDNA-ITS分子序列系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。

圖2 鄰接法構建內生真菌ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 多花黃精內生真菌分子鑒定序列比對表

續(xù)表2

由上可知多花黃精內生真菌分布類型廣泛，分布的21個屬主要集中在Fusarium、Diaporthe、Asper?gillus、Penicillium和Alternaria中，占比61.43%。分布最廣的Fusarium屬共有23株，其分離頻率為32.86%，是多花黃精的優(yōu)勢種群。

4 討論

內生真菌幾乎在所有的植物體內均有分布[19]。在植物微生態(tài)系統(tǒng)中，藥用植物內生真菌是其重要組成部分，有的內生真菌影響植物的萌發(fā)以及生長發(fā)育，有的內生真菌具有合成宿主次生代謝產物的能力[20]。近年來，隨著對藥用植物分類、化學、藥理等方面的深入研究，有關藥用植物內生真菌備受關注。隨著市場需求量的增加，多花黃精逐漸成為一種具有廣泛發(fā)展前景的藥食同源中藥[21]。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，關于多花黃精內生真菌研究的相關報道較少，本研究通過對多花黃精內生真菌的培養(yǎng)、分離、鑒定，共分離得到70株菌種。結果顯示，在多花黃精中分布最廣的是鐮孢霉屬（Fusarium），共有14種23株，其SF值為32.86%，為多花黃精的優(yōu)勢種屬。鐮孢霉屬是自然界中廣泛存在的一種微生物類群，在寧前胡、霍山石斛[22]、海南粗榧[23]、亳芍[24]等植物中也廣泛存在。本實驗中分離得到的部分菌株在其他黃精中已有發(fā)現(xiàn)，如Fusarium、Diaporthe、Aspergil?lus、Penicillium和Alternaria等，也是上述多花黃精中分離頻率較高的菌種，其他屬內生真菌如Clonos?tachys、Macrophomina、Sordariomycetes、Neurospora、Gliocladiopsis等還沒有在相關多花黃精內生真菌文獻中報道過，本研究對多花黃精藥用部位內生真菌進行初步研究，豐富了內生真菌的種類和資源，為多花黃精的開發(fā)利用和資源保護奠定基礎。