毛細(xì)管電泳法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析評(píng)價(jià)云芝胞內(nèi)糖肽的質(zhì)量

孫玉娣，張圓，王文濤，石蓓佳，，陸益紅，*，李志裕*（.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 0000；.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院生物技術(shù)藥品檢驗(yàn)一室，南京 009；.SCIEX中國(guó)，上海 00000）

云芝胞內(nèi)糖肽是運(yùn)用現(xiàn)代生物工程技術(shù)，雜色云芝菌[Polystictus versicolor（L）.Fr.，又名Trametes versicolor]經(jīng)深層培養(yǎng)后，菌體提取獲得的糖肽類(lèi)物質(zhì)，其具有增強(qiáng)機(jī)體免疫的功效，在臨床可用于慢性乙型肝炎、肝癌及老年免疫功能低下者的輔助治療。由于云芝胞內(nèi)糖肽為大分子混合物，組成復(fù)雜，含有蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、葡聚糖、糖肽、氨基酸和無(wú)機(jī)鹽等物質(zhì)[1]，因此對(duì)云芝胞內(nèi)糖肽的分離分析具有一定難度。有文獻(xiàn)報(bào)道糖類(lèi)結(jié)構(gòu)中的鄰二羥基與硼酸根離子可結(jié)合形成帶負(fù)電荷的絡(luò)合物，根據(jù)絡(luò)合物淌度的不同可實(shí)現(xiàn)毛細(xì)管電泳（CE）的有效分離[2]。除此之外，CE不受色譜填料對(duì)分子量的制約，在不破壞糖肽結(jié)構(gòu)的前提下，通過(guò)特征的糖肽指紋圖譜體現(xiàn)其組成，對(duì)確保云芝胞內(nèi)糖肽制劑的工藝穩(wěn)定性具有積極作用。本試驗(yàn)采用CE法，分離檢測(cè)云芝胞內(nèi)糖肽原料及制劑特征色譜峰，用ChemPattern軟件建立指紋圖譜，對(duì)結(jié)果進(jìn)行主成分分析（PCA）和系統(tǒng)聚類(lèi)分析（HCA），為云芝胞內(nèi)糖肽膠囊（片）的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

SCIEX PA 800 Plus 毛細(xì)管電泳分析儀，二極管陣列檢測(cè)器（DAD）；ChemPattern 2020版（科邁恩科技）。云芝胞內(nèi)糖肽膠囊（片）（共計(jì)18批，原料均來(lái)自于A廠家，具體見(jiàn)表1），菌絲體水提醇沉產(chǎn)物1，培養(yǎng)液濾液醇沉產(chǎn)物2（以下簡(jiǎn)稱(chēng)產(chǎn)物1、產(chǎn)物2，A廠家），云芝胞內(nèi)糖肽原料（Q廠家，批號(hào)：S-30200601），云芝胞內(nèi)糖肽對(duì)照品（批號(hào)：140692-200301，原料來(lái)自Q廠家）。由于生產(chǎn)工藝的差異，A廠家原料中含有產(chǎn)物1和產(chǎn)物2，Q廠家原料中僅含有產(chǎn)物1。

表1 云芝胞內(nèi)糖肽來(lái)源Tab 1 Source of coriolus versicolor intracellular glycopeptide

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取云芝胞內(nèi)糖肽膠囊內(nèi)容物、云芝胞內(nèi)糖肽片樣品研細(xì)，精密稱(chēng)取10 mg，對(duì)照品、原料藥、產(chǎn)物1與產(chǎn)物2直接精密稱(chēng)取10 mg，置于1.5 mL離心管中，加入1 mL去離子水，渦旋混勻后，3000 r·min－1離心5 min，取上清液進(jìn)行分析。

2.2 電泳條件

石英毛細(xì)管（60.2 cm×75 μm，有效長(zhǎng)度 50 cm）；運(yùn)行電壓15 kV；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm；背景電解質(zhì)溶液（BGE）為50 mmol·L－1四硼酸鈉，pH 9.18；樣品緩沖液H2O；毛細(xì)管溫度25℃；樣品室溫度25℃；進(jìn)樣條件0.5 psi 5 s；熔融石英毛細(xì)管初次使用時(shí)，依次用0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液、0.1 mol·L－1鹽酸溶液和二次去離子水在20 psi下各沖洗5 min，最后用BGE在20 psi下沖洗5 min，并在15 kV電壓下平衡10 min。在每針運(yùn)行之間依次用0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液、0.1 mol·L－1鹽酸溶液和水在20 psi條件下各沖洗3 min，最后用BGE在20 psi下沖洗5 min。數(shù)據(jù)處理采用32 Karat軟件[3-4]。

2.3 數(shù)據(jù)分析

采用ChemPattern軟件，以A廠家制劑樣品中6個(gè)特征峰（保留時(shí)間分別為8.9、12.8、14.4、17.2、17.8、24.9 min）的峰面積建立共有模式，對(duì)樣本進(jìn)行PCA和HCA分析[5-6]。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取A企業(yè)原料（批號(hào)：20200101），按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各峰峰面積的RSD（n＝6）。結(jié)果顯示，各峰峰面積的RSD均小于1.0%，各峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.5%，表明該儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取A企業(yè)原料（批號(hào)：20200101），按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、4、8、12、18、24 h按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，計(jì)算各峰峰面積的RSD（n＝6）。結(jié)果顯示，各峰峰面積的RSD均小于0.3%，各峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.7%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取A企業(yè)原料（批號(hào)：20200101），按“2.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，計(jì)算各峰峰面積的RSD（n＝6）。結(jié)果顯示，各峰峰面積的RSD均小于1.0%，各峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 毛細(xì)管電泳指紋圖譜的建立

2.5.1 樣品疊加圖譜的生成 取5個(gè)廠家云芝胞內(nèi)糖肽膠囊（片）各1批，A廠家提供的產(chǎn)物1、產(chǎn)物2，Q廠家原料和對(duì)照品分別按“2.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄CE色譜圖。采用ChemPattern軟件，對(duì)圖譜進(jìn)行中值基線濾波去背景，使用保留時(shí)間校正進(jìn)行全峰匹配建立指紋圖譜，共有6個(gè)特征峰，見(jiàn)圖1。

圖1 云芝胞內(nèi)糖肽樣品的指紋圖譜疊加圖Fig 1 CE fingerprints of coriolus versicolor intracellular glycopeptide

2.5.2 共有模式圖譜的建立 各廠家云芝胞內(nèi)糖肽制劑的原料均來(lái)自于A廠家，因此以A廠家3批樣品為代表性樣品，以A廠家圖譜的6個(gè)峰作為特征峰建立共有模式，見(jiàn)圖2。

圖2 云芝胞內(nèi)糖肽共有模式圖Fig 2 Common pattern of coriolus versicolor intracellular glycopeptide

2.6 毛細(xì)管電泳指紋圖譜的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.6.1 相似度分析[7-8]將18批云芝胞內(nèi)糖肽膠囊（片）、A廠家原料、產(chǎn)物1、產(chǎn)物2、Q廠家原料和對(duì)照品的CE圖導(dǎo)入ChemPattern軟件，以共有模式圖譜為參照，計(jì)算夾角余弦相似度，結(jié)果見(jiàn)表2，相似度統(tǒng)計(jì)圖見(jiàn)圖3。表2結(jié)果顯示，A廠家及使用A廠家原料各廠家的制劑與共有模式相似度在0.96以上，圖3結(jié)果顯示產(chǎn)物2、A廠家原料及使用A廠家原料各廠家的制劑與產(chǎn)物1、Q廠家原料和對(duì)照品呈明顯區(qū)分。

圖3 云芝胞內(nèi)糖肽相似度結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖Fig 3 Statistical chart of similarity of coriolus versicolor intracellular glycopeptide

表2 相似度分析結(jié)果Tab 2 Similarity analysis

2.6.2 系統(tǒng)聚類(lèi)分析[9-11]將所有CE圖導(dǎo)入Chem Pattern軟件，對(duì)圖譜進(jìn)行UV標(biāo)度化處理，以共有模式圖譜為參照，采用街區(qū)距離計(jì)算方法為測(cè)度，以最短距離法連接，進(jìn)行HCA分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。樣品間的分類(lèi)距離值越大，差異性就越大。HCA樹(shù)狀圖結(jié)果表明，共有模式與A廠家原料、使用A廠家原料各廠家的制劑及產(chǎn)物2為一類(lèi)，Q廠家原料和對(duì)照品為一類(lèi)。

圖4 云芝胞內(nèi)糖肽HCA結(jié)果圖Fig 4 HCA diagram of coriolus versicolor intracellular glycopeptide

2.6.3 主成分分析[12]使用ChemPattern軟件對(duì)圖譜進(jìn)行UV標(biāo)度化處理，用PCA程序分析樣品組間差異性。當(dāng)提取 6個(gè)主成分時(shí)，檢驗(yàn)因變量個(gè)數(shù)P＝6，χ2＝146.56，自由度df＝15，顯著性P＝0，按檢驗(yàn)水平α＝0.05，拒絕假設(shè)H0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)PCA模型分析生成得分圖、載荷圖，分別見(jiàn)圖5～6。

圖5 云芝胞內(nèi)糖肽PCA得分圖Fig 5 PCA score diagram of coriolus versicolor intracellular glycopeptide

圖6 云芝胞內(nèi)糖肽PCA 載荷圖Fig 6 PCA load diagram of coriolus versicolor intracellular glycopeptide

PCA得分圖中各點(diǎn)聚集狀態(tài)反映了樣品批之間內(nèi)的異同，由圖5可知，產(chǎn)物2、A廠家原料及使用A廠家原料各廠家的制劑數(shù)據(jù)點(diǎn)與共有模式同群，說(shuō)明同一原料廠家來(lái)源的制劑化學(xué)成分具有相似性。產(chǎn)物1、Q廠家原料和對(duì)照品與共有模式離群，說(shuō)明不同生產(chǎn)廠家原料之間存在差異性，分類(lèi)結(jié)果與HCA結(jié)果一致。結(jié)合PCA載荷圖和自變量主成分累計(jì)解釋方差表（見(jiàn)表3）可知，峰6為樣本識(shí)別的主要因素。

表3 自變量主成分累計(jì)解釋方差Tab 3 Principal component cumulative interpretation variance of independent variables

3 討論

本試驗(yàn)采用CE法建立了5個(gè)生產(chǎn)廠家18批云芝胞內(nèi)糖肽膠囊（片）、工藝中間產(chǎn)物1和產(chǎn)物2、對(duì)照品及兩個(gè)廠家（A、Q廠家）云芝胞內(nèi)糖肽原料的指紋圖譜，采用ChemPattern軟件分析，確定6個(gè)共有峰。結(jié)果同一原料及其使用同一原料不同廠家的制劑的相似度均大于 0.96，說(shuō)明云芝胞內(nèi)糖肽膠囊（片）質(zhì)量穩(wěn)定。HCA和PCA可將樣品明顯聚類(lèi)和區(qū)分，A廠家原料、使用A廠家原料各廠家的制劑和產(chǎn)物2間具有相似性，可聚為一類(lèi)，而Q廠家原料、對(duì)照品和產(chǎn)物1有明顯差異，說(shuō)明不同原料生產(chǎn)廠家之間共有峰存在差異。找到一個(gè)差異識(shí)別峰（峰6），可作為區(qū)分不同來(lái)源云芝胞內(nèi)糖肽的手段。

A廠家原料生產(chǎn)工藝為：菌株P(guān)olystictus versicolor，28℃發(fā)酵培養(yǎng)40～50 h。發(fā)酵完成后，發(fā)酵液過(guò)濾分為菌絲與培養(yǎng)液兩部分。菌絲部分經(jīng)水煮提取濾液，與培養(yǎng)液濾液合并。合并的濾液經(jīng)濃縮、醇沉，75℃ 減壓干燥、粉碎過(guò)篩即得。制劑都是原料直接灌裝或者加乙醇濕法制粒的，無(wú)輔料干擾。將工藝中菌絲體水提醇沉即得產(chǎn)物1，培養(yǎng)液濾液醇沉即得產(chǎn)物2。Q廠家原料生產(chǎn)工藝與A廠家基本相似，但是在最后沒(méi)有與培養(yǎng)液濾液合并，因此沒(méi)有產(chǎn)物2。指紋圖譜顯示，產(chǎn)物1的1～6號(hào)CE特征峰均呈現(xiàn)較高峰，且出現(xiàn)多個(gè)額外的色譜峰；產(chǎn)物2幾乎沒(méi)有特征峰檢出。結(jié)合HCA和PCA可知，產(chǎn)物1因各峰面積顯著高于其他樣本而離群，對(duì)照品、Q廠家原料則因峰6峰面積高而離群?？梢猿醪酵茰y(cè)兩原料生產(chǎn)廠家的生產(chǎn)工藝不同是造成差異的主要原因。

CE無(wú)法對(duì)特征峰進(jìn)行定性，無(wú)法確定各特征峰組成，后期可采用CE與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)各未知峰進(jìn)行定性分析[13-14]，確定峰6的組成，針對(duì)峰6建立云芝胞內(nèi)糖肽的質(zhì)量控制體系，以提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性和一致性。

綜上所述，本研究建立的云芝胞內(nèi)糖肽膠囊（片）CE指紋圖譜測(cè)定方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，準(zhǔn)確、簡(jiǎn)捷，具有較好的分析評(píng)價(jià)能力，可作為區(qū)分云芝胞內(nèi)糖肽和質(zhì)量評(píng)價(jià)的依據(jù)。