落新婦花、莖、葉揮發(fā)油成分的GC-MS分析及抗氧化能力測定

李廣杰，袁航，葉江海，潘爐臺，鄒娟，何康（貴州中醫(yī)藥大學，貴陽 550025）

落新婦Astilbe chinensis（Maxim.）Franch.et Savat.為虎耳草科落新婦屬多年生草本植物，又名小升麻、術活、馬尾參等，生于海拔390～3600 m的山谷、溪邊、林下、林緣及草甸等處，在我國貴州、四川、云南、黑龍江、遼寧、吉林、河北、陜西、山西、甘肅南部和東部、青海東部、山東、浙江、河南、江西、湖南、湖北等省均有分布[1]。其味苦、性涼，具有祛風、清熱、止咳的功效，主治風熱感冒、頭身疼痛、咳嗽等[2]。《本草經(jīng)集注》中記載“解毒，取葉挼作小兒浴湯，主驚杵”；云南阿昌族用落新婦花治跌打損傷、手術后疼痛以及風濕關節(jié)痛；四川彝族用全草熬水吃治療感冒，以及全草泡酒，內(nèi)服外搽治風濕關節(jié)痛[3]；貴州苗族用落新婦煨甜酒治吐血[4]。

現(xiàn)代藥理研究表明，落新婦具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等作用[5-6]。目前，有關落新婦藥效物質(zhì)基礎的研究多為地下部分化學成分研究，從中分離得到的化學成分主要為三萜、黃酮類化合物，也發(fā)現(xiàn)少量的甾醇、苯丙酸類等其他類型的化合物[7-9]。有關落新婦揮發(fā)油成分的研究僅報道了其地下部分揮發(fā)油成分的研究[10]，未見其地上部分揮發(fā)油成分研究的報道。近年來，有關植物中揮發(fā)油抗氧化活性的研究成為熱點，如黃精[11]、彝族藥斯赤列[12]等。本實驗采用水蒸氣蒸餾法提取落新婦花、莖、葉3個部位的揮發(fā)油，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術及歸一化法對3個部位的揮發(fā)油進行成分和含量分析，并研究其抗氧化能力，以期為落新婦的開發(fā)與利用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

落新婦藥材采自貴州六盤水梅花山，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學王澤歡博士鑒定為虎耳草科落新婦屬植物落新婦Astilbe chinensis（Maxim.）Franch.et Savat.。手動分揀出花、莖、葉3個部位。

L-抗壞血酸（AR，上海麥克林生化科技有限公司）；無水硫酸鈉（AR，成都金山化學試劑有限公司）；無水乙醇、石油醚（AR，天津市富宇精細化工有限公司）。

1.2 儀器

HP6890/5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；UV-1800島津紫外可見分光光度計（島津儀器蘇州有限公司）；JA2003電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）；EYELA N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛郎儀器有限公司）。

2 方法

2.1 揮發(fā)油的提取

取干燥的落新婦花、莖、葉各200 g，粉碎，過2號篩，各精密稱取100 g置于2000 mL圓底燒瓶，加入1000 mL蒸餾水及玻璃珠數(shù)粒，參照《中國藥典》2020年版四部通則2204揮發(fā)油測定法甲法[13]，提取6 h，將餾出液用石油醚萃取，干燥，減壓回收石油醚得到淡黃色具有特殊氣味的油狀物。

2.2 GC-MS分析條件

2.2.1 氣相色譜條件 色譜柱為HP-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，柱溫40℃，保持2 min，然后以3.5℃·min－1升溫至180℃，再以8℃·min－1升溫至308℃，運行時間65 min；汽化室溫度250℃；載氣為高純氦氣（99.999%）；柱前壓110.52 kPa，載氣流量1.0 mL·min－1；分流進樣，分流比：30∶1；溶劑延遲時間6 min。

2.2.2 質(zhì)譜條件 離子源為EI源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1941 V；接口溫度280℃；質(zhì)量范圍29～500 amu。

2.2.3 數(shù)據(jù)處理 運用質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)對總離子流圖中的各峰進行檢索并核對Nist17和Wiley275標準質(zhì)譜圖，確定揮發(fā)油化學成分，再通過峰面積歸一化法測定各成分的相對質(zhì)量分數(shù)。

2.3 抗氧化能力測定

2.3.1 樣品溶液配制 取落新婦花、莖、葉中揮發(fā)油以及陽性對照品L-抗壞血酸各適量，分別制備成質(zhì)量濃度為0.031 25、0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0 mg·mL－1的樣品溶液，置于低溫避光處，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3.2 DPPH自由基清除能力測定 按文獻[14-15]的方法，分別取1 mL上述不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與1 mL 0.2 mmol·L－1的DPPH乙醇溶液混合，避光條件放置2 h，在517 nm處測定吸光值Ai；相同條件下，測定1 mL 0.2 mmol·L－1DPPH乙醇溶液與1 mL無水乙醇混合溶液的吸光值為Ac；1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品液與1 mL無水乙醇混合溶液的吸光值為Aj。重復3次，取平均值。按以下公式計算自由基清除率，清除率（%）＝[1－（Ai－Aj）/Ac]×100%。

2.3.3 羥基自由基清除能力測定 采用Fenton法，參照文獻[16-17]的方法，分別取1 mL上述不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，加入1 mL 6 mmol·L－1FeSO4溶液與1 mL 6 mmol·L－1H2O2溶液，搖勻，靜置10 min，再加入1 mL 6 mmol·L－1水楊酸乙醇溶液，搖勻，靜置30 min，在510 nm處測定吸光值Ai；相同條件下，將樣品溶液換為1 mL無水乙醇測定的吸光值為Ac，將水楊酸乙醇溶液換為1 mL無水乙醇測定的吸光值為Aj。參照“2.3.2”項下公式計算自由基清除率。

3 結果

3.1 揮發(fā)油收油率

運用水蒸氣蒸餾法提取落新婦花、莖、葉3個部位的揮發(fā)油，其中落新婦花的收油率最高，為0.49%；其次是落新婦葉，收油率為0.43%；落新婦莖收油率最低，為0.32%。

3.2 揮發(fā)油成分分析

根據(jù)落新婦花、莖、葉中揮發(fā)油的總離子流圖鑒定了47種化合物見表1，主要為烷烴類化合物，還有少量萜烯、酮、醇等其他類型的化合物。其中鯨蠟烯、1-十八烯以及二十九烷僅在落新婦葉中檢測出；十四烷、十五烷、十七烷、十八烷、十九烷、1-二十二烯、異植物醇、棕櫚酸、角鯊烯、α-紫羅蘭酮及反-β-紫羅蘭酮未在落新婦莖中檢測到。圖1為落新婦花、莖、葉中揮發(fā)油的總離子流圖。

表1 落新婦花、莖、葉中揮發(fā)油成分相對含量Tab 1 Relative content of volatile oil components in the flowers，stems and leaves of Astilbe chinensis

圖1 落新婦花（A）、莖（B）、葉（C）中揮發(fā)油成分的總離子流圖Fig 1 Total ion current diagram of volatile oil components in the flowers（A），stems（B）and leaves（C）of Astilbe chinensis

落新婦花中鑒定出44種化合物，占揮發(fā)油總量的82.92%。含量最高的是苯甲醇（33.13%）；其次，相對含量較高的是2-甲基己烷（8.72%）、辛烷（5.92%）、3-甲基己烷（3.88%）、2-甲基庚烷（2.88%）、3-甲基庚烷（2.88%）、葉綠醇（1.88%）、2，3-二甲基戊烷（1.84%）、棕櫚酸甲酯（1.66%）、庚烷（1.63%）、二十五烷（1.33%）、6，10，14-三甲基-2-十五烷酮（1.31%）、乙酸丁酯（1.12%），剩余31種化合物相對含量均小于1%。

落新婦莖中鑒定出33種化合物，占揮發(fā)油總量的85.14%。含量最高的是苯甲醇（38.64%）；其次，相對含量較高的是2-甲基己烷（12.11%）、辛烷（6.53%）、3-甲基己烷（4.52%）、3-甲基庚烷（3.32%）、2-甲基庚烷（3.03%）、2，3-二甲基戊烷（2.18%）、庚烷（1.88%）、4-甲基庚烷（1.26%）、棕櫚酸甲酯（1.02%），剩余23種化合物相對含量均低于1%。

落新婦葉中鑒定出47種化合物，占揮發(fā)油總量的86.16%。含量最高的是苯甲醇（30.83%）；其次，相對含量較高的是葉綠醇（6.03%）、2-甲基己烷（5.75%）、辛烷（3.33%）、二十二烷（3.31%）、二十四烷（2.85%）、二十三烷（2.69%）、6，10，14-三甲基-2-十五烷酮（2.28%）、二十一烷（1.96%）、二十六烷（1.94%）、3-甲基己烷（1.92%）、二十五烷（1.83%）、二十烷（1.63%）、3-甲基庚烷（1.50%）、棕櫚酸甲酯（1.32%）、十六烷（1.32%）、二十七烷（1.31%）、十八烷（1.25%）、2-甲基庚烷（1.17%）、異植物醇（1.12%），剩余27種化合物相對含量均低于1%。

3.3 DPPH自由基清除能力

不同質(zhì)量濃度（0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0 mg·mL－1）落新婦花、莖、葉中揮發(fā)油及陽性對照品L-抗壞血酸對DPPH自由基的清除率見表2。由表2可知，L-抗壞血酸對DPPH自由基的清除率最優(yōu)，其次為葉中揮發(fā)油、莖中揮發(fā)油，花中揮發(fā)油對DPPH自由基的清除能力最小?；ㄖ袚]發(fā)油對DPPH自由基的清除能力在質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL－1時清除率最高，為21.07%；莖中揮發(fā)油隨著質(zhì)量濃度的增大對DPPH的清除率增大，質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL－1時清除率最高（53.40%），到1.0 mg·mL－1時又開始變??；葉中揮發(fā)油隨著質(zhì)量濃度增大對DPPH自由基清除率也增大，當質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL－1時最大為68.18%；陽性對照品L-抗壞血酸隨著質(zhì)量濃度增加呈先增大后減小的規(guī)律，當質(zhì)量濃度為0.0625 mg·mL－1時清除率最大為96.52%。

表2 落新婦花、莖、葉中揮發(fā)油對DPPH自由基清除率 (%)Tab 2 DPPH free radical scavenging rate of volatile oil from the flowers，stems and leaves of Astilbe chinensis (%)

3.4 羥基自由基清除能力

不同質(zhì)量濃度（0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0 mg·mL－1）落新婦花、莖、葉中揮發(fā)油及陽性對照品L-抗壞血酸對羥基自由基的清除率見表3。由表3可知，在質(zhì)量濃度＜0.5 mg·mL－1時，落新婦花、莖、葉中揮發(fā)油對羥基自由基的清除能力均大于陽性對照品L-抗壞血酸，當質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL－1時，L-抗壞血酸對羥基自由基的清除能力大于落新婦花、莖、葉中揮發(fā)油?；ê腿~中揮發(fā)油在質(zhì)量濃度為0.0625 mg·mL－1時清除率均為最大，分別為75.76%和83.19%；莖中揮發(fā)油濃度為0.125 mg·mL－1時清除率最大，為82.24%；陽性對照品L-抗壞血酸在質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL－1時清除率最大，為74.86%。

表3 落新婦花、莖、葉中揮發(fā)油對羥基自由基清除率 (%)Tab 3 Hydroxyl free radical scavenging rate of volatile oil from the flowers，stems and leaves of Astilbe chinensis (%)

4 討論

田陽等[10]通過水蒸氣蒸餾法提取了落新婦地下部分的揮發(fā)油，結合GC-MS技術檢測出57種化合物并鑒定了其中50種，主要為烷烴類、酯類及萜烯類化合物。本研究與之相同的化合物有12種，占總成分的25.53%，為棕櫚酸甲酯、棕櫚酸、鯨蠟烯、十五烷、十六烷、十七烷、十八烷、十九烷、二十烷、二十二烷、二十四烷及二十八烷，表明落新婦地上部分（花、莖、葉）與地下部分揮發(fā)油成分存在較大差異。

本研究表明，落新婦花、莖、葉3個部位中揮發(fā)油具有成分差異小，成分相對含量差異大的特點?；ā⑶o、葉都含有的成分有33種，占總成分的70.21%；其中，11種成分只在花、葉中出現(xiàn)，而莖中未檢測到；3種成分僅在葉中檢測到。各成分在3個不同部位的相對含量有所差異，3個部位含量最高的成分均為苯甲醇，但相對含量有所區(qū)別，在花、莖、葉中分別為33.13%、38.64%、30.83%；其次為葉綠醇，在葉中相對含量為6.03%，但在花和莖中相對含量僅有1.88%和0.71%；6，10，14-三甲基-2-十五烷酮在花和葉中相對含量均在1%以上，而在莖中相對含量僅為0.35%；2，3-二甲基戊烷在花和莖中相對含量為1.84%、2.18%，而在葉中相對含量僅為0.95%。

在抗氧化活性測定中，落新婦花、莖、葉中揮發(fā)油對DPPH和羥基自由基均表現(xiàn)出一定的清除作用，對羥基自由基的清除能力略強于對DPPH自由基的清除。與陽性對照品L-抗壞血酸相比，對羥基自由基的清除能力略強于L-抗壞血酸，而對DPPH自由基的清除能力則小于L-抗壞血酸。表明落新婦花、莖、葉中揮發(fā)油具有一定的抗氧化活性，特別是對羥基自由基的清除。

本研究測定分析了落新婦花、莖、葉3個部位的揮發(fā)油成分，并對3個部位揮發(fā)油作體外抗氧化測定，為該植物進一步開發(fā)利用提供基礎理論依據(jù)。鑒定出的47種化合物中有多種化合物具有很好的藥理活性。如角鯊烯具有抗氧化、消除疲勞、增強機體活力、改善心肺功能以及降膽固醇、降血脂、調(diào)節(jié)免疫功能、防止動脈粥樣硬化的功效[17-18]；α-紫羅蘭酮能刺激肌肉生成以及減弱骨骼肌肌管萎縮[19]；β-紫羅蘭酮具有較強的抑癌作用[20]；葉綠醇能促進肌肉的發(fā)育以及影響糖脂代謝[21]；異植物醇是合成維生素E的原料[22]；苯甲醇可作為注射液的抑菌劑[23]等。相關揮發(fā)油的功能和藥效有待進一步深入研究。