小球藻病毒PBCV-1編碼的Cu,Zn-SOD 酶學(xué)穩(wěn)定性

劉建榮賈紅玉陳慧慧劉曉飛康明

(1.河北大學(xué) 生物工程技術(shù)創(chuàng)新中心,河北 保定 071002；2.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定 071002)

活性氧(reactive oxygen species,ROS)既可以由有氧生物在正常代謝活動中產(chǎn)生,又可以在脅迫條件下產(chǎn)生.生理濃度的ROS有益于生物體本身,并參與信號通路活動以及保護(hù)生物免于病原體侵染；但高濃度ROS會破壞生物大分子及細(xì)胞結(jié)構(gòu)[1-3],但細(xì)胞能利用超氧化物歧化酶(superoxide dismutases,SODs)降解ROS來降低其造成的破壞[4-5].作為金屬蛋白,SODs能將超氧陰離子轉(zhuǎn)化成較低毒性的過氧化氫和分子態(tài)氧從而保護(hù)生物有機(jī)體免受有毒活性氧破壞[6].根據(jù)與酶蛋白結(jié)合的用于超氧離子淬滅的金屬輔基的不同,SODs被分成銅鋅-超氧化物歧化酶 (Cu,Zn-SOD),鐵-超氧化物歧化酶 (Fe-SOD),錳-超氧化物歧化酶(Mn-SOD),以及鎳-超氧化物歧化酶 (Ni-SOD).哺乳動物細(xì)胞中Cu,Zn-SOD 位于細(xì)胞質(zhì)中 (SOD1) 或位于胞外空間 (SOD3),Mn-SOD 位于線粒體 (SOD2)[7]；高等植物通常具有位于線粒體的Mn-SOD、葉綠體的Fe-SOD、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞分室中的多種類型的Cu,Zn-SOD[8]；真核藻類和原生動物細(xì)胞通常具有Mn-SOD和Fe-SOD,缺乏Cu,Zn-SOD；原核生物具有Mn-SOD 和/或Fe-SOD,但很多革蘭氏陰性細(xì)菌具有Cu,Zn-SOD[9-10].Ni-SOD 只存在于數(shù)種鏈霉菌中[11].病毒極少編碼SODs,但幾類大型DNA 病毒如痘病毒 (poxviruses)、桿狀病毒 (baculoviruses)、擬菌病毒 (mimiviruses) 以及藻類DNA 病毒 (phycodnaviruses)卻編碼Cu,Zn-SOD 狀基因.除了藻類DNA 病毒和一種昆蟲痘病毒外,其他病毒編碼的SODs并未檢測到活性[12-13].藻類DNA 病毒科的模式病毒株paramecium bursaria chlorella virus 1(PBCV-1)及多數(shù)小球藻病毒屬 (chloroviruses) 同屬病毒株都編碼Cu,Zn-SOD 基因；PBCV-1編碼的銅鋅-超氧化物歧化酶 (chlorovirus Cu,Zn-SOD,cvSOD)以及其截短PBCV-1突變體truncated chlorovirus SOD(以下簡稱tcvSOD) 均具有SOD 活性,其基因的表達(dá)有可能幫助病毒淬滅宿主產(chǎn)生的ROS,有利于病毒的感染與復(fù)制[13].由于SODs能降低ROS水平,減少氧自由基對生物有機(jī)體的傷害,具有抗腫瘤、抗炎及提高免疫力的作用,使得其在食品、醫(yī)藥和日化領(lǐng)域的應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注[14].本文試圖通過測定小球藻病毒株P(guān)BCV-1 編碼的Cu,Zn-SOD 截短突變體tcvSOD 在不同溫度、p H 值、蛋白變性劑脅迫條件下的酶活性及酶學(xué)穩(wěn)定性,并進(jìn)一步評估其應(yīng)用潛力.tcvSOD 是cvSOD 截短了其N-端的第1個內(nèi)部甲硫氨酸前面的21個氨基酸殘基后形成的截短突變體,此突變體與野生型相比在大腸桿菌中具有較高的表達(dá)量并具有較強的酶活性[13],因此本研究以重組tcvSOD 為材料.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌克隆宿主DH5α和表達(dá)宿主BL21 Rosetta(DE3)(Novagen產(chǎn)品)均為本實驗室保存,表達(dá)質(zhì)粒p ET23a(+)(Novagen產(chǎn)品)為本實驗室保存.除特殊標(biāo)明的以外,本實驗所有試劑均購自國藥集團(tuán).

1.2 tcvSOD基因克隆與表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)GenBank的PBCV-1的cvSOD 序列,從N-端第1個內(nèi)部甲硫氨酸密碼子開始設(shè)計5’端引物.1對擴(kuò)增引物序列設(shè)計為a245r NdeIFrw:CCGCATATGACCAAGAACACATCTTCATTG,a245r XhoIRev:GACCTCGAGACAAA AGTTTTCTTTGGCATA.上述引物由奧科鼎盛生物科技有限公司合成.tcvSOD PCR 產(chǎn)物利用Phanta Super-Fidelity D NA 聚合酶 (Vazyme) 獲得,擴(kuò)增條件如下:模板95℃預(yù)變性30 s,95℃變性15 s,59.3℃退火15 s,72℃延伸60 s,30個循環(huán),補齊延伸10 min.PCR 產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳分離,Biomiga膠回收試劑盒純化,Takara Q.cut 限制性內(nèi)切酶NdeI與XhoI消化,再與同樣經(jīng)NdeI與XhoI消化的大腸桿菌表達(dá)載體p ET23a(+)連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆宿主DH5α,經(jīng)擴(kuò)增、酶切驗證、測序分析,確定tcvSOD 基因插入到表達(dá)載體而獲得重組質(zhì)粒p ET23a(+)-tcvsod.

1.3 tcvSOD的表達(dá)與純化

重組質(zhì)粒p ET23a(+)-tcvsod導(dǎo)入蛋白表達(dá)宿主BL21 Rosetta(DE3),以不含質(zhì)粒的宿主菌為對照,經(jīng)0.4 mmol/L的IPTG 誘導(dǎo)、細(xì)胞破碎、Ni-NTA resin (Novagen產(chǎn)品) 吸附,結(jié)合/裂解緩沖液 (50 mmol/L Na H2PO4,300 mmol/L NaCl,10 mmol/L imidazole,p H 8.0)、洗滌緩沖液 (50 mmol/L Na H2PO4,300 mmol/L NaCl,20 mmol/L imidazole,p H 8.0)、洗脫緩沖液 (50 mmol/L Na H2PO4,300 mmol/L NaCl,250 mmol/L imidazole,p H 8.0) 純化,最終將tcvSOD 收集于含體積分?jǐn)?shù)50%甘油的洗脫緩沖液中.用分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的SDS-PAGE檢測tcvSOD 的表達(dá)與純化結(jié)果.

1.4 tcvSOD活性檢測

參照Marklund的鄰苯三酚自氧化法并加以修改[14-15].

1.4.1 鄰苯三酚自氧化速率測定

將999μL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液,1 mmol/L二乙三胺五乙酸,p H 8.2,25℃下平衡20 min后迅速加入1μL 45 mmol/L鄰苯三酚溶液(用10 mmol/L HCl配制),鄰苯三酚終濃度為0.045 mmol/L,在320 nm 處進(jìn)行3 min的時間掃描.通過計算斜率ΔA/Δt得到自氧化速率R,單位為ΔA320/min,其中A為吸光度,t為掃描時間.此方法得到R=0.022/min,落在Marklund建議的用于間接測定SOD 活性的鄰苯三酚自氧化速率0.015～0.025/min內(nèi)[15].

1.4.2 tcvSOD 活性測定與鄰苯三酚自氧化抑制曲線繪制

在總體積為1 m L反應(yīng)體系中混合50 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (含1 mmol/L的二乙三胺五乙酸,p H 8.2) 和不同質(zhì)量濃度的tcvSOD 蛋白,25℃平衡20 min 后,加入1μL的45 mmol/L 鄰苯三酚溶液,320 nm 處掃描3 min以獲取R值,并通過調(diào)整tcvSOD 加入量達(dá)到對鄰苯三酚自氧化速率的最大抑制.在此條件下,SOD 對鄰苯三酚自氧化速率達(dá)到最大抑制水平的50%作為SOD 的1個活性單位,也可同時計算SOD 的比活性[16].

式中R0為320 nm 處鄰苯三酚自氧化速率；RS為添加樣品SOD 后鄰苯三酚自氧化速率；V為加樣體積(單位為m L)；N是樣品稀釋倍數(shù).

1.5 酶學(xué)穩(wěn)定性實驗

將純化的tcvSOD 適當(dāng)稀釋,測試在各種脅迫條件下反應(yīng)體系中tcvSOD 質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、1μg/m L時的相對酶活性.

溫度:在總體積為1 m L反應(yīng)體系中混合50 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (含1 mmol/L的二乙三胺五乙酸,p H 8.2),適量的tcvSOD蛋白,調(diào)整酶蛋白終質(zhì)量濃度為0.05、0.1、1μg/m L,分別在4、25、37、42、55、65、75、90℃條件下保溫30 min,加入1μL 45 mmol/L鄰苯三酚溶液,320 nm 處掃描3 min進(jìn)行相對酶活測定.

p H 值:在總體積為1 m L反應(yīng)體系中分別混合50 mmol/L 檸檬酸鹽緩沖液(p H 4,p H 6)、Tris-HCl緩沖液 (p H 8) 和甘氨酸-NaOH 緩沖液 (p H 10),均含有1 mmol/L的二乙三胺五乙酸,均加入適量的tcv-SOD 蛋白,調(diào)整酶蛋白終質(zhì)量濃度為0.05、0.1、1μg/m L,25℃保溫30 min,以不加酶的反應(yīng)體系為對照,加入1μL的45 mmol/L鄰苯三酚溶液,與1.4.2相同條件下測定酶活.

變性劑:在總體積為1 m L反應(yīng)體系中將50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(含1 mmol/L的二乙三胺五乙酸,p H 8.2),分別與相應(yīng)的變性劑(質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%,4%,6%,8%,10%的SDS；2、4、6、8、10 mol/L的尿素；1、2、3、4 mol/L的鹽酸胍) 混合,加入適量的tcvSOD蛋白,調(diào)整酶蛋白終質(zhì)量濃度為0.05、0.1、1μg/m L,25℃保溫30 min,以不加酶的反應(yīng)體系為對照,加入1μL的45 mmol/L鄰苯三酚溶液,與1.4.2相同條件下測定酶活.

2 結(jié)果與分析

2.1 tcvSOD的大腸桿菌異源表達(dá)

與人(GenBank 登錄號NP_000445.1,下同)、牛(NP_777040.1)及黑腹果蠅(CAA35210.1) 的Cu,Zn-SOD 相比,以小球藻病毒PBCV-1編碼的Cu,Zn-SOD具有32個N-端冗余氨基酸殘基,功能不詳,其中第22位是甲硫氨酸.以PBCV-1基因組DNA 為模板,以其編碼的Cu,Zn-SOD N-端22位甲硫氨酸作為起始密碼子設(shè)計引物進(jìn)行截短的SOD 突變體tcvSOD 基因擴(kuò)增,得到1條約500 bp DNA 條帶,與預(yù)期的489 bp產(chǎn)物相符 (圖1a).將tcvSOD 的PCR 產(chǎn)物與載體p ET23a(+)同時用NdeI和XhoI酶切處理、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆宿主DH5α,挑取單菌落培養(yǎng)并用Biomiga質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA,經(jīng)酶切鑒定確定tcvSOD 片段插入到了載體合適位點 (圖1b),最終對tcvSOD 陽性克隆測序確定了插入片段的正確性.經(jīng)測序驗證的p ET23a(+)-tcvsod轉(zhuǎn)化大腸桿菌外源蛋白表達(dá)載體BL21 Rosetta(DE3),用終濃度為0.4 mmol/L的IPTG 誘導(dǎo)tcvSOD 蛋白表達(dá),并以BL21 Rosetta(DE3)空菌作為陰性對照.對誘導(dǎo)后的菌體細(xì)胞進(jìn)行破碎離心、重組蛋白Ni-NTA 凝膠純化和SDS-PAGE 鑒定,發(fā)現(xiàn)重組tcvSOD 蛋白主要存在于細(xì)胞的可溶性組分中,經(jīng)Ni-NTA 凝膠結(jié)合、洗滌、洗脫得到大小約18 ku 的6×His-tcvSOD 重組蛋白(圖1c).經(jīng)BCA 蛋白濃度測定試劑盒(Solarbio產(chǎn)品)測定重組蛋白濃度,用洗脫液將重組蛋白稀釋到適當(dāng)濃度并摻入終體積分?jǐn)?shù)為50%的甘油備用.

圖1 PBCV-1編碼的tcvSOD基因的克隆與大腸桿菌異源表達(dá)Fig.1 Cloning and heterologous over-expression of tcvSOD encoded by Chlorovirus PBCV-1 in Escherichia coli

2.2 tcvSOD對鄰苯三酚自氧化的抑制

采用Marklund[15]的抑制鄰苯三酚自氧化間接測定SOD 活性的方法檢測tcvSOD 酶活性.此方法的原理是鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化,產(chǎn)生多種具不同吸收峰的中間產(chǎn)物且有超氧陰離子的參與,中間產(chǎn)物產(chǎn)量與鄰苯三酚自氧化速率呈正相關(guān).SOD 通過降解超氧陰離子抑制鄰苯三酚自氧化,因此監(jiān)測中間產(chǎn)物吸光度的改變來表示SOD 對鄰苯三酚自氧化的抑制,最終間接推測出SOD 的酶活性.用320 nm 處吸光度檢測鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的中間產(chǎn)物[14,18],具體見實驗方法1.4.2.tcvSOD對鄰苯三酚自氧化有明顯的抑制作用 (圖2),抑制率最高可達(dá)97%；在tcv-SOD質(zhì)量濃度為0.2μg/m L時達(dá)到最大抑制.按前述SOD酶活力單位定義計算得到tcvSOD比活力為16 050 U/mg.

2.3 tcvSOD熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性

圖2 tcvSOD對鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的抑制曲線Fig.2 Inhibition curve generated by tcvSOD toward the auto-oxidation of pyrogallol

將反應(yīng)體系中的tcvSOD 質(zhì)量濃度分別調(diào)整到0.05、0.1、1μg/m L,在4、25、37、42、55、65、75 及90℃下保溫30 min后測定SOD 活性,結(jié)果表明,當(dāng)反應(yīng)體系中tcvSOD質(zhì)量濃度為1μg/m L時,酶活性從4～75℃保持恒定,在90℃處理30 min后略有下降；而酶質(zhì)量濃度為0.1和0.05μg/m L時,酶活性從42℃開始下降,到90℃時幾乎完全失活(圖3a).推測溫度較高時低質(zhì)量濃度tcvSOD 更容易丟失螯合的Cu2+和Zn2+從而迅速喪失活性,但這一推斷有待實驗證明.上述結(jié)果證明,在合適的質(zhì)量濃度下tcvSOD 具有相當(dāng)高的熱穩(wěn)定性.變換p H 值從4～12,質(zhì)量濃度1μg/m L 與0.1μg/m L時tcvSOD 活性維持不變,質(zhì)量濃度0.05μg/m L樣品只是在p H 12時活性略有降低,表明tcvSOD 在較大p H值范圍內(nèi)具有穩(wěn)定性(圖3b).

圖3 tcvSOD的熱穩(wěn)定性(a)與酸堿穩(wěn)定性(b)Fig.3 Thermo-stability(a)and p H-stability(b)of tcvSOD

2.4 不同蛋白變性劑對tcvSOD活性的影響

鑒于SOD 在醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景,體外檢測SOD 在各種變性劑脅迫下的酶活穩(wěn)定性就顯得十分必要.在本文實驗條件下,終質(zhì)量濃度1μg/m L的tcvSOD,其活性在質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%～8%SDS作用下維持穩(wěn)定,質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%SDS導(dǎo)致酶活性的輕微喪失；酶質(zhì)量濃度0.1μg/m L 和0.05μg/m L 時對SDS處理非常敏感,殘留酶活性降到20%以下；質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%SDS處理下酶活性幾乎完全喪失(圖4a).與SDS處理相反,3種不同質(zhì)量濃度的tcvSOD 對2～10 mol/L尿素 (圖4b) 與1～4 mol/L鹽酸胍 (圖4c)處理不敏感,無論是質(zhì)量濃度0.05μg/m L還是1μg/m L的酶蛋白,在實驗條件下均維持活力不變.表明小球藻病毒株P(guān)BCV-1編碼的Cu,Zn-SOD 截短突變體tcvSOD 重組蛋白可抵抗較高濃度的蛋白變性劑尿素(10 mol/L)和鹽酸胍 (4 mol/L) 脅迫；當(dāng)酶質(zhì)量濃度達(dá)到1μg/m L 時也能抵抗較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的SDS(10%)脅迫.

圖4 變性劑對tcvSOD酶活性的影響Fig.4 Effects of protein denaturants on the enzymatic activity of tcvSOD

3 討論

包括PBCV-1在內(nèi)的小球藻病毒是大型DNA 病毒如痘病毒、桿狀病毒、擬菌病毒和藻類DNA 病毒中極少數(shù)編碼有活性SOD 的病毒；PBCV-1的Cu,Zn-SOD 基因表達(dá)可能有助于病毒降解宿主產(chǎn)生的ROS,利于病毒的感染與復(fù)制.其截短突變型tcvSOD 基因克隆到表達(dá)載體p GEX-2T 上,并利用大腸桿菌BL21表達(dá)出的可溶性重組蛋白具有典型的Cu,Zn-SOD 特征,例如活性受KCN 強烈抑制[14].p GEX 系列以28 ku的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶 (GST) 作為標(biāo)簽蛋白,為了免除去標(biāo)簽蛋白步驟,方便進(jìn)一步進(jìn)行tcvSOD 酶學(xué)性質(zhì)研究,本文重新構(gòu)建了p ET23a(+)-tcvsod重組表達(dá)載體,成功表達(dá)純化了帶有6×His標(biāo)簽的可溶性重組tcvSOD.該蛋白對鄰苯三酚自氧化有明顯的抑制作用,抑制率最高可達(dá)97%,表現(xiàn)出典型的SOD 酶活特征,并且在質(zhì)量濃度為0.2μg/m L時達(dá)到最大抑制.重組tcvSOD 活性對環(huán)境因素脅迫的反應(yīng)與酶濃度有一定關(guān)系,例如終質(zhì)量濃度為1μg/m L時90℃處理30 min,tcvSOD 相對酶活性仍可達(dá)到90%；而酶質(zhì)量濃度0.1和0.05μg/m L時,42℃下酶活開始下降,90℃時幾乎完全喪失；同樣質(zhì)量濃度1μg/m L的tcvSOD 在質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%～10%SDS脅迫下活性相對穩(wěn)定,而質(zhì)量濃度為0.1和0.05μg/m L 時對SDS脅迫非常敏感.與上述情況相反,3種質(zhì)量濃度的tcvSOD 在p H 4～10內(nèi)均基本保持穩(wěn)定的活性,表明它有較寬泛的p H 穩(wěn)定性；同樣,各種質(zhì)量濃度的tcvSOD 其活性不受2～10 mol/L 尿素和1～4 mol/L 鹽酸胍脅迫的影響.上述結(jié)果均表明,tcvSOD 具有進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用的潛能.鑒于SOD 在醫(yī)藥、食品、化妝品以及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用潛力,而在化妝品行業(yè)已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用[19-22],開發(fā)挖掘具有高活性、耐熱耐酸堿、對變性劑及酶解有強抵抗力的SOD 就顯得十分必要.無論是純化自天然的組織細(xì)胞中的SODs(如沙丁魚[23]、山羊[24]、克魯維酵母[25]),還是用微生物表達(dá)的重組SOD(如南極毛草[26]),小球藻病毒PBCV-1編碼的tcv-SOD 與它們相比,在穩(wěn)定性和對脅迫的抗性方面都顯得比較突出,因此具有進(jìn)一步開發(fā)利用的價值.

致謝:對河北大學(xué)生物工程技術(shù)創(chuàng)新中心的杜建芳副研究員在該論文研究中給予的幫助表示感謝.