基于網(wǎng)絡藥理學及分子對接探討當歸補血湯治療動脈粥樣硬化潛在作用機制研究＊

張君冬，尹仁芳，陳 琦，楊 碩

(中國中醫(yī)科學院中醫(yī)藥信息研究所 北京 100700)

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是臨床常見的老年性慢性血管炎癥疾病，發(fā)病率高，治療復雜困難，易引起冠心病、中風、腦梗死等各類心血管疾病[1]，且發(fā)病對象逐漸呈年輕化趨勢。目前，針對AS治療的藥物很多，但大多有明顯的毒副作用，如常用的阿司匹林和他汀類藥物雖能在一定程度上緩解AS的形成，但部分人群長期服用可能會導致大出血、肌痛等并發(fā)癥[2,3]。

中醫(yī)認為，動脈粥樣硬化可歸屬“胸痹”“眩暈”“心悸”等范疇，瘀血阻滯、氣血虧虛是其主要的發(fā)病機制[4]。當歸補血湯源自《內(nèi)外傷辨惑論》，由金元四大家之一的補土派李東垣所創(chuàng)[5]，是臨床常用的補氣活血經(jīng)典方，方中黃芪大補脾肺之氣，重在補氣活血，配以當歸養(yǎng)血合營，使陽生陰長，氣旺血生。目前，已有研究表明，當歸補血湯對于動脈粥樣硬化有良好的治療效果[6-8]，但其具體作用靶標及機制尚缺乏整體性系統(tǒng)性研究。因此，本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法及分子對接技術(shù)探究當歸補血湯治療動脈粥樣硬化的潛在作用機制，為其深入研究及臨床用藥提供參考。

1 數(shù)據(jù)來源與方法

1.1 構(gòu)建化學成分及蛋白靶點數(shù)據(jù)庫

以“當歸”“黃芪”為關鍵詞在TCMSP數(shù)據(jù)庫(https：//tcmspw.com/tcmsp.php)和TCMID2.0數(shù)據(jù)庫(http：//www.megabionet.org/tcmid/)中檢索，去除重復得到各類藥物全部化學成分及其蛋白靶點，設置口服生物利用度OB≥30%和類藥性DL≥0.18作為活性化合物的篩選條件，然后通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org)對靶標蛋白進行標準化，建立各類藥物化學成分及其靶點數(shù)據(jù)庫。

1.2 搜集動脈粥樣硬化發(fā)病靶點

以“atherosclerosis”為關鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)中進行檢索，選擇物種為“Homo sapiens”建立動脈粥樣硬化靶點數(shù)據(jù)庫。

1.3 當歸補血湯治療動脈粥樣硬化潛在作用靶點預測

通 過Venny 2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將成分靶點與疾病靶點取交集得到共同靶點即當歸補血湯治療動脈粥樣硬化的關鍵靶點。

1.4 中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建

將篩選整理得到當歸補血湯成分及關鍵靶點導入Cytoscape 3.7.1軟件(http：//www.cytoscape.org/)構(gòu)建中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡，基于NetworkAnalyser功能分析出評估節(jié)點的重要指標，并根據(jù)這類指標找出關鍵化合物及靶點基因。

1.5 PPI蛋白網(wǎng)絡構(gòu)建

將當歸補血湯治療動脈粥樣硬化相關靶點基因上傳至在線STRING 11.0平臺(http：//string-db.org)，選取Organism=“Homo sapiens”，且打分值≥0.7的高置信度數(shù)據(jù)，以確保數(shù)據(jù)的可靠性，最后通過Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建PPI蛋白網(wǎng)絡。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

本研究在BioMart(http：//www.ensembl.org/index.html)平臺基因ID轉(zhuǎn)換的基礎上，通過Omicshare(http：//www.omicshare.com/tools/)分析平臺對共同靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，根據(jù)P_Value值將富集結(jié)果做成可視化氣泡圖，同時生成化合物-靶點-通路網(wǎng)絡圖。

1.7 分子對接分析

從蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(http：//www.rcsb.org)下載靶點蛋白的PDB格式文件。采用Pymol2.3軟件刪除蛋白分子中的無關小分子后，將蛋白分子導入AutoDock Tools-1.5.6軟件刪除水分子并添加氫原子最后保存為pdbqt文件。

從PubChem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載化合物的sdf格式文件。將小分子化合物導入AutoDock Tools-1.5.6軟件刪除水分子并添加原子電荷、分配原子類型，將所有柔性鍵默認可旋轉(zhuǎn)，最后保存為pdbqt文件。

所有的對接實驗運用AutoDock Tools-1.5.6軟件。在計算過程中，采用0.375間隔的70x70x70點陣模塊。使用Lamarckian遺傳算法進行分子對接計算，算法如下：150的群體，最大值2500萬次能量評估，最高次數(shù)為2000，交叉率0.8，突變率0.02，獨立對接運行50次，并根據(jù)結(jié)合自由能評估最終對接結(jié)構(gòu)。對接結(jié)果采用Pymol 2.3軟件進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物篩選及靶點預測

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫、TCMID數(shù)據(jù)庫檢索到“當歸”“黃芪”中化合物共185個，以OB≥30%且DL≥0.18篩選出活性化合物共22個，預測靶標數(shù)量共212個(不含重復靶點)(表1)。

表1 當歸補血湯“藥物-有效成分-預測靶標”基本信息

2.2 當歸補血湯治療動脈粥樣硬化(AS)潛在作用靶點

根據(jù)GeneCards數(shù)據(jù)庫Relevance score≥10共篩選得到AS潛在作用靶點148個，通過Venny 2.1.0將成分靶點與疾病靶點取交集共得到36個交叉靶點，即當歸補血湯治療動脈粥樣硬化關鍵靶點(圖1)。

圖1 當歸補血湯和動脈粥樣硬化靶點韋恩圖

2.3 當歸補血湯中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡分析

將36個交叉靶點通過Cytoscape 3.7.1軟件(http：//www.cytoscape.org/)構(gòu)建中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡(圖2、表2)。

表2 中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡中關鍵節(jié)點

圖2 中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡

中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡共包括52個節(jié)點(2個中藥節(jié)點，14個化合物節(jié)點，36個靶點節(jié)點)和93條邊，每條邊則表示節(jié)點與節(jié)點之間的相互作用關系，節(jié)點的度與節(jié)點顏色深度成正比，顏色越深，表明該節(jié)點在整個網(wǎng)絡發(fā)揮作用的程度越大。數(shù)據(jù)庫中未查詢到對應蛋白靶點的化學成分未參與網(wǎng)絡構(gòu)建。從化合物的角度來看，作用靶點數(shù)排名前3的成分為quercetin-槲皮素、kaempferol-山奈酚、isorhamnetin-異鼠李素。從靶點的角度來看，F(xiàn)2-凝血酶、ESR1-雌激素受體、TP53-細胞腫瘤抗原P53均排名靠前。

2.4 PPI網(wǎng)絡分析

將STRING 11.0平臺得到的36個蛋白相互作用數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡，得到一組關聯(lián)密切的基因群，該基因群可能是當歸補血湯治療動脈粥硬化的核心模塊，如圖3中共包括36個節(jié)點，462條邊，節(jié)點的平均度值不低于20，字體大小與節(jié)點的度成正比，節(jié)點大小與節(jié)點的介值成正比，度值、介值越大的節(jié)點，在整個網(wǎng)絡中的重要程度就越高(表3、圖3)。

圖3 PPI蛋白網(wǎng)絡

表3 PPI蛋白網(wǎng)絡靶點信息(Degree≥30)

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

GO功能富集分析(圖4)發(fā)現(xiàn)當歸補血湯治療動脈粥樣硬化主要與以下生物進程相關：①炎癥反應(inflammatory response)，②對外部刺激反應的調(diào)節(jié)(response to external stimulus)，③對含氧化合物的反應(response to oxygen-containing compound)，④細胞因子介導的信號通路(cytokine-mediated signaling pathway)，⑤對有機物質(zhì)的反應(response to organicsubstance)⑥活性氧化物的代謝過程的調(diào)節(jié)(reactive oxygen speciesmetabolic process)等。

圖4 GO功能富集的生物過程分析

KEGG通路富集分析篩選得到前20條關鍵信號通路，主要分為以下3類：①與人類疾病相關的通路：心血管疾病(流體剪切力與動脈粥樣硬化通路)、內(nèi)分泌和代謝疾病(AGE-RAGE信號通路)、感染性疾病(瘧疾、非洲錐蟲病)、癌癥(癌癥蛋白多糖)、免疫疾病(百日咳、乙型肝炎、利什曼病)②與環(huán)境信息處理相關的通路：信號傳導通路(TNF信號通路)③與生物體系統(tǒng)相關的通路：免疫系統(tǒng)(IL-17信號通路、Toll樣受體信號通路、Fc epsilon RI信號通路、T細胞受體信號通路等)。為了更準確的說明當歸補血湯治療動脈粥樣硬化可能的作用機制，選P值較小的前20個通路構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖和可視化氣泡圖(圖5、圖6)。由圖6可知，TNF、IL1B、IL6、AKT1和流體剪切力與動脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE信號、TNF信號通路為該網(wǎng)絡的核心調(diào)控節(jié)點。

圖5 KEGG通路可視化氣泡圖

圖6 成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖(棱形代表化合物，圓形代表靶點，倒三角代表信號通路)

2.6 分子對接

一般來說，配體與受體結(jié)合能越低，對接活性越大，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。將中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡中排名前3的核心活性化合物與成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖中排名前4的蛋白靶點進行分子對接，進一步明確其發(fā)揮效用的治療機制(表4)。

表4 當歸補血湯樞紐靶點與核心化合物結(jié)合親和力

2.6.1 槲皮素，山奈酚，異鼠李素與TNF相互作用分析

腫瘤壞死因子是一種重要的細胞因子，具有強大的促炎和免疫調(diào)節(jié)作用，在多種疾病中往往過度表達，已成為自身免疫性疾病的治療靶點。目前用于靶向TNF治療的大部分都是生物大分子，因此小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)很有價值。研究的小分子主要分為直接與TNF結(jié)合，抑制TNF和TNFR1之間相互作用來調(diào)節(jié)相關信號途徑。本研究第一次用計算的方法發(fā)現(xiàn)TNF抑制劑。根據(jù)槲皮素，山奈酚，異鼠李素與TNF蛋白結(jié)合模式可以發(fā)現(xiàn)，潛在的結(jié)合位點包括LEU-120，GLY-121，SER-60，TYR-119，TYR-151等氨基酸殘基，與Molly M.He等[9]所發(fā)現(xiàn)的TNF蛋白結(jié)構(gòu)的活性位點的殘基基本一致，表明3個化合物與TNF蛋白匹配度高，是十分有潛力的抑制劑，特別是化合物異鼠李素能夠與TYR-151，SER-60形成氫鍵，氫鍵距離分別為2.5?2.3?，2.1?(圖7)，氫鍵長度短，結(jié)合能力強。進一步發(fā)現(xiàn)，3種化合物的苯環(huán)與部分殘基可以形成p-π及π-π共軛。這些氫鍵及共軛的存在說明3種化合物均能夠很好的匹配TNF蛋白的活性口袋，且匹配度高，而且與已知的的活性殘基有著較強的氫鍵作用，因此這3個化合物都可能是TNF靶點的潛在的抑制劑。

圖7 槲皮素，山奈酚，異鼠李素與TNF蛋白對接。

2.6.2 槲皮素，山奈酚，異鼠李素與IL1B相互作用分析

槲皮素，山奈酚，異鼠李素與IL1B蛋白的結(jié)合能分別為-6.23 kcal·mol-1，-6.26 kcal·mol-1，-6.76 kcal·mol-1。潛在的結(jié)合位點主要有GLN-149，SER-5，ASN-7，SER-152，TYR-24等氨基酸殘基，3種化合物均為黃酮母體，結(jié)構(gòu)具有高度的相似性，酚羥基均可以與氨基酸形成氫鍵，如山奈酚的酚羥基與SER-5，ASN-7，SER-152的活性基團形成的氫鍵，氫鍵長度分別為2.6?，2.4?，2.1?(圖8)。3種化合物與蛋白的活性位點形成的氫鍵距離均較短，表明化合物與蛋白的的口袋結(jié)合能力較強，另外化合物之間相似性也較高，結(jié)合能也相近。因此，3種化合物均可以與IL1B蛋白形成穩(wěn)定的復合物，可能是潛在的靶點蛋白的抑制劑。

圖8 槲皮素，山奈酚，異鼠李素與IL1B蛋白對接

2.6.3 槲皮素，山奈酚，異鼠李素與IL6相互作用分析

根據(jù)槲皮素，山奈酚，異鼠李素與IL6的結(jié)合模式可知，潛在的結(jié)合位點包括GLN-105，TYR-145，SER-110，GLN-112，TYR-143，LEU-104，THR-111，LYS-150等氨基酸殘基。3種化合物含有多個活性基團(酚羥基及羰基)均可以與氨基酸形成多個氫鍵，且氫鍵距離較短，平均為2.7?(圖9)。這些氫鍵的存在說明3種化合物能夠很好的匹配IL-6蛋白的活性口袋，可以有效地提高化合物在口袋中的穩(wěn)定性，從而發(fā)揮抑制作用。

圖9 槲皮素，山奈酚，異鼠李素與IL6蛋白對接

2.6.4 槲皮素，山奈酚，異鼠李素與AKT1相互作用分析

槲皮素，山奈酚，異鼠李素與AKT1對接結(jié)果表明，3個化合物和AKT1均存在較強的結(jié)合作用，結(jié)合能力強弱分別為：異鼠李素＞山奈酚＞槲皮素。通過結(jié)合位點匯總分析，3種化合物與AKT1蛋白結(jié)合的殘基有7個，分別是GLY-19、LEU-191、ALA-41、GLY-40、GLY-17、GLY-65、THR-42。槲皮素，山奈酚，異鼠李素與AKT1蛋白的結(jié)合能分別為-7.43 kcal·mol-1，-7.38 kcal·mol-1，-7.95 kcal·mol-1(圖10)。其中，槲皮素與AKT1蛋白的活性殘基形成4個氫鍵，多于另外2個化合物，說明該化合物與蛋白口袋結(jié)合較強。這些氫鍵及其他相互作用的存在說明3種化合物均能夠很好的匹配AKT1蛋白的活性口袋。

圖10 槲皮素，山奈酚，異鼠李素與AKT1蛋白對接

3 討論

動脈粥樣硬化是以脂質(zhì)沉積、平滑肌細胞增殖(SMCs)、細胞凋亡、壞死以及纖維化為特征的一種慢性炎癥疾病[10]，大多起因于人群缺乏運動、膳食結(jié)構(gòu)不合理、吸煙酗酒等不健康的生活方式導致的高血壓、高血脂、糖尿病癥。

本次研究結(jié)果來看，Degree排名靠前的化合物是quercetin-槲皮素、kaempferol-山奈酚、isorhamnetin-異鼠李素。槲皮素具有抗炎、抗氧化、降血壓、降血脂及免疫調(diào)節(jié)的作用[11]，可抑制泡沫細胞的形成來降低動脈粥樣硬化損傷面積和斑塊大小[12]。山奈酚可以顯著抑制脂質(zhì)過氧化，清除超氧化物陰離子[13-15]。異鼠李素可抑制TNF-α、IL-6發(fā)揮抗炎作用，通過降低或抑制ox-LDL形成、VEC損傷、巨噬細胞形成、脂質(zhì)堆積、VSMC增生與遷移及血栓形成等重要環(huán)節(jié)發(fā)揮抗AS作用[16]。據(jù)相關文獻報道，氧化應激、炎癥反應及高脂血癥是導致動脈粥樣硬化的重要因素[17]，因此槲皮素、山奈酚、異鼠李素3種化合物在一定程度上可以預防和治療動脈粥樣硬化。

PPI蛋白網(wǎng)絡中共包含36個核心靶點，主要以白細胞介素(IL6、IL1B、IL10)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP9、MMP2)、細胞黏附分子(VCAM1、ICAM1)及腫瘤相關基因(TNF、AKT1等)為主。IL10是由TH2細胞產(chǎn)生的抗炎因子，可抑制各類炎性介質(zhì)(如IL6、IL1B)同時促進其他抗炎因子的分泌，有效減輕炎癥對心血管損傷。基質(zhì)金屬蛋白酶由巨噬細胞分泌產(chǎn)生，尤以MMP2、MMP9最為重要，可降解細胞外基質(zhì)，使得AS斑塊纖維帽變薄容易破裂。已有研究發(fā)現(xiàn)，抑制MMP2、MMP9的活性和表達可顯著降低循環(huán)總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇，其可能機制是通過增強SMC以達到增強斑塊穩(wěn)定性的作用[18]。腫瘤壞死因子(TNF)可增強內(nèi)皮細胞通透性、促進SMC的增生和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達[19]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)參與多種生物學過程，包括代謝，增值，細胞存活，生長，血管生成等，是PI3K/AKT信號通路中的核心因子?？傮w來看，所涉及靶點主要在炎癥反應、脂質(zhì)代謝、細胞因子、細胞增殖分化、凋亡以及組織修復發(fā)揮重要作用。靶點與靶點之間聯(lián)系密切，也體現(xiàn)了當歸補血湯具有多靶點協(xié)同治療動脈粥樣硬化的優(yōu)勢。

富集分析結(jié)果來看，主要集中在心血管疾病、內(nèi)分泌和代謝疾病、感染性疾病等方面。由此推斷當歸補血湯中的活性成分可能通過作用于免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等相關靶點，調(diào)節(jié)與炎癥、心血管疾病、內(nèi)分泌和脂質(zhì)代謝等相關信號通路，達到治療動脈粥樣硬化的作用。

KEGG結(jié)果顯示關鍵通路中，流體剪切力與動脈粥樣硬化通路可以調(diào)控KLF2和內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNos)來抑制黏附分子如細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)的表達來發(fā)揮抗炎、抗黏附，維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性的效果[20]。AGERAGE信號可激活核因子-kB(NF-kB)信號通路，NFkB可促進促炎性細胞因子(如IL-1，IL-6和TNF)以及與AS相關的基因VEGF的表達[21]，從而加劇AS的新成，提示當歸補血湯有可能通過調(diào)節(jié)AGE-RAGE信號通路來抑制NF-kB信號通路激活減少炎癥因子釋放達到抗AS的作用。此外，Toll樣受體(TLR)依賴性信號通路、IL-17信號通路在一定程度上均參與了炎癥反應。氧化應激損傷和脂質(zhì)代謝紊亂也是動脈粥樣硬化形成的主要原因，當歸補血湯能一定程度上提高氧化應激狀態(tài)下的細胞自噬水平，促進損傷后的EPCs增殖、遷移能力與血管形成能力[22]，降低血清TC、TG、LDL-C，升高HDL-C，從而調(diào)節(jié)脂代謝紊亂[23-24]，修復血管損傷。

分子對接結(jié)果表明，3種度值較高的活性化合物與4類樞紐靶點蛋白均存在較強的結(jié)合作用，而其中異鼠李素和AKT1蛋白結(jié)合所需的能量最低，結(jié)合性最強。槲皮素，山奈酚，異鼠李素均為黃酮類化合物，有著較多的氫鍵受體與氫鍵供體，這有利于與靶點蛋白形成穩(wěn)定的氫鍵，從而使小分子化合物能夠穩(wěn)定的結(jié)合在蛋白的活性位點。進一步研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素，山奈酚，異鼠李素與每一個蛋白的結(jié)合模式基本相似，這也間接表明了分子對接技術(shù)的穩(wěn)定性。另外，3個化合物與蛋白活性殘基還存在疏水相互作用和范德華力以及形成共軛結(jié)構(gòu)。因此，這些作用力可以有效地使小分子固定在活性中心，有利于提高化合物在蛋白活性口袋的穩(wěn)定性，是潛在靶點蛋白的抑制劑。

4 總結(jié)與展望

綜上，本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法及分子對接技術(shù)闡述當歸補血湯治療動脈粥樣硬化多成分、多靶點協(xié)同作用的機制，結(jié)果顯示，當歸補血湯中槲皮素、山奈酚、異鼠李素等活性化合物可能通過作用于TNF、IL1B、IL6、AKT1等相關樞紐靶點，調(diào)節(jié)流體剪切力、AGE-RAGE、NF-kB及氧化應激損傷和脂質(zhì)代謝等相關信號通路，達到抗炎、抗黏附、調(diào)節(jié)脂代謝紊亂，修復血管損傷的功效。本研究數(shù)據(jù)來源主要是基于國內(nèi)已有的公共數(shù)據(jù)庫進行研究，數(shù)據(jù)的可靠性以及完整性對預測結(jié)果有著重要影響[25]，此外，本研究中當歸補血湯中所有化學成分主要來自收集黃芪、當歸單味藥化學成分進行合并得到，而黃芪、當歸在煎煮過程中能否產(chǎn)生新的化學成分及經(jīng)體代謝前后成分種類差異仍需進一步研究。