• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一種基于微芯片電泳平臺(tái)的級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光信號(hào)放大策略用于HIV-DNA的高靈敏檢測(cè)

    2021-07-02 09:32:04趙書(shū)林
    分析測(cè)試學(xué)報(bào) 2021年6期
    關(guān)鍵詞:雙鏈化學(xué)發(fā)光靶標(biāo)

    鐘 潔,趙書(shū)林

    (廣西師范大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,藥用資源化學(xué)與藥物分子工程省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 桂林 541004)

    人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)即艾滋病病毒,它通過(guò)破壞輔助性的T淋巴細(xì)胞,并使體內(nèi)的多種免疫細(xì)胞受到損害,最終引起各種機(jī)會(huì)性感染和腫瘤的發(fā)生。艾滋病(ADIS)也稱為獲得性免疫缺陷綜合征,HIV不僅僅會(huì)侵蝕細(xì)胞,無(wú)視抗體甚至?xí)l(fā)癌變奪走人的生命,所以,艾滋病是目前全球范圍內(nèi)造成人類死亡的主要病因之一[1]。自HIV被發(fā)現(xiàn)以來(lái),它已經(jīng)吸引了越來(lái)越多的科學(xué)家致力于如何預(yù)防和治療艾滋病。

    HIV感染可通過(guò)檢測(cè)病毒的抗體、抗原、核酸確定,其中HIV抗體或抗原檢測(cè)是最常用的檢測(cè)方法,它是診斷艾滋病病毒感染和艾滋病的主要指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)項(xiàng)目。常見(jiàn)的HIV抗體或抗原檢測(cè)有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)[2-3]、免疫熒光分析[4-6]和ADIS測(cè)試紙[7-10]等。人感染HIV病毒后,會(huì)在體內(nèi)不斷復(fù)制并產(chǎn)生大量HIV病毒,該過(guò)程要先于體內(nèi)對(duì)HIV的識(shí)別和產(chǎn)生免疫反應(yīng)(抗體抗原的產(chǎn)生等)。因此,在3~12周的窗口期間很難通過(guò)上述方法準(zhǔn)確檢測(cè)HIV抗體或抗原,這將會(huì)導(dǎo)致病毒的傳播與惡化,使患者在不知道感染的情況下錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)間[11]。對(duì)于絕大多數(shù)HIV感染者,只要HIV病毒在體內(nèi)開(kāi)始復(fù)制(6~14 d),血液中就會(huì)有相應(yīng)的病毒基因存在,通過(guò)核酸檢測(cè)方法即可檢出。與檢測(cè)HIV抗體、抗原相比,艾滋病病毒基因(HIV-DNA)可以更早地檢出[12],從而較早獲得艾滋病的陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。目前,用于HIV-DNA檢測(cè)的分析方法有電化學(xué)[13-15]和熒光[16-18]分析方法等,但由于HIV感染初期的含量非常低,這些方法難以準(zhǔn)確測(cè)定。為了更早更準(zhǔn)確獲得檢測(cè)結(jié)果,構(gòu)建靈敏、快速、有效的HIV-DNA檢測(cè)方法對(duì)于艾滋病早期診斷具有重要意義。

    本研究基于微芯片電泳-化學(xué)發(fā)光檢測(cè)(MCE-CL)平臺(tái),建立了一種高靈敏檢測(cè)HIV-DNA的新方法,與其它HIV-DNA檢測(cè)方法[19-21]相比,該方法具有更高的靈敏度,將其用于實(shí)際人血清中痕量HIV-DNA的測(cè)定,結(jié)果令人滿意。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 試劑與儀器

    實(shí)驗(yàn)所用DNA片段和標(biāo)記HRP的DNA序列,以及標(biāo)記FAM的DNA序列均為自行設(shè)計(jì)并由大連寶生物公司合成,合成的DNA均為HPLC純級(jí),序列設(shè)計(jì)如下:HIV-DNA:5′-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3′;P1:5′-ATGTGGAAAATCTCTGAGTCTTCCAGTGTGAAAA-3′;P2:5′-TTTTTTTTCACACTGGAAGACTC-3′;2-HRP:HRP-DNA-GAGTCTTCCAGTGTGTGGGTTTTGGATTTT-3′;FAM-DNA:5′-FAM-GAGTCTTCCAGTGTGTGGGTTTT GGATTTT-3′;T1:5′-ACTGCTAGAGATTTTCCAGAT-3′;T2:5′-ACTGCTAGAGATTTTCCTGAT-3′;T4:5′-ACTGCTAG AGTTTATCCTGAT-3′;Tn:5′-CAGTAGCTGTCGGCGATAAGC-3′。

    MCE-CL檢測(cè)系統(tǒng)為實(shí)驗(yàn)室自制[22-23],微流控芯片購(gòu)自大連拓微芯片技術(shù)有限公司,為玻璃/玻璃雙T型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)芯片,其結(jié)構(gòu)如圖1所示。芯片面積為8.5 cm×2.6 cm,通道頂部寬為70 μm(柱后氧化試劑傳輸通道和檢測(cè)通道為250 μm),深度為25 μm,截面為弧形,有效分離通道長(zhǎng)為5.0 cm。S為樣品池,SW為樣品廢液池,S與SW兩池距離分離通道均為5 mm,B為電泳緩沖液池,距離雙T交叉點(diǎn)為5.0 mm,雙T型交叉處的間隔為60 μm。

    圖1 玻璃/玻璃雙T型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)芯片的構(gòu)造示意圖Fig.1 Structure of glass/glass double T chemiluminescence detection chipS:sample reservoir(樣品池),B:electrophoresis buffer solution reservoir(電泳緩沖液池),SW:sample waste reservoir(樣品廢液池),BW:buffer waste reservoir(緩沖廢液池),R:post-column oxidizer reservoir(柱后氧化劑池)

    1.2 溶液配制

    DNA儲(chǔ)備液:將裝有DNA凍干粉的離心管置于離心機(jī)中,以12 000 r/min離心5 min。離心結(jié)束后將DNA鏈溶于1.0×10-2mol/L Tris-EDTA(pH 8.0)中制備終濃度為5.0×10-5mol/L的儲(chǔ)備液,于冰箱內(nèi)在4 ℃環(huán)境下靜置24 h后分裝到各小離心管中,于-20 ℃冷凍儲(chǔ)存。

    Tris-HCl緩沖溶液:2.5×10-2mol/L Tris-HCl溶液(pH 7.4),含2×10-2mol/L KCl及0.2 mol/L NaCl。

    電泳緩沖溶液:3×10-2mol/L的Na2B4O7溶液(pH 9.3),含2×10-2mol/L十二烷基硫酸鈉(SDS)和1.2×10-3mol/L魯米諾。

    柱后氧化試劑溶液:3.5×10-2mol/L NaHCO3緩沖溶液(pH 9.5),含0.12 mol/L H2O2和1.0×10-3mol/L 對(duì)碘苯酚(PIP)。

    1.3 信號(hào)放大反應(yīng)

    在反應(yīng)管中加入2 μL P1/P2復(fù)合物(1.0×10-7mol/L)、1 μL HIV-DNA、1 μL 10×Buffer4 和6 μL H2O,于37 ℃恒溫振蕩水浴鍋中反應(yīng)1 h,隨后加入2 μL HRP-DNA(2.0×10-7mol/L)和3 μL T7Exo(10 U/μL)。混合均勻后,將其于37 ℃恒溫振蕩水浴鍋中反應(yīng)1 h后繼續(xù)反應(yīng)80 min。酶切輔助靶標(biāo)雙循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后,加入35 μL Tris-HCl緩沖溶液定容至50 μL,供MCE-CL分析。

    1.4 血清樣品制備

    正常人血清樣品取自桂林市第五人民醫(yī)院。檢測(cè)HIV-DNA時(shí),將溶于水的HIV-DNA加至血清中作為陽(yáng)性樣品,然后按“1.3”方法進(jìn)行信號(hào)放大反應(yīng)。

    1.5 微流控芯片電泳化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

    電泳芯片首次使用前依次用1 mol/L NaOH溶液和去離子水沖洗30 min,每次實(shí)驗(yàn)前需對(duì)芯片進(jìn)行活化處理,兩次電泳之間分別用0.1 mol/L NaOH溶液清洗8 min,去離子水清洗5 min。采用夾流方式進(jìn)樣,進(jìn)樣階段在S池上施加500 V電壓,SW池接地,B池和BW池分別施加250 V和400 V電壓,R池懸空,進(jìn)樣時(shí)間20 s;隨后進(jìn)入分離階段切換各路電壓,B池施加2 400 V作為分離電壓,S和SW各施加1 500 V電壓作為反拉電壓,而B(niǎo)W池接地,同時(shí)R池中施加500 V電壓。利用電壓驅(qū)動(dòng)進(jìn)樣,再通過(guò)電滲流的作用使得樣品組分在分離通道中以不同的速率遷移至Y型交叉處,與發(fā)光試劑混合產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光,利用PMT收集化學(xué)發(fā)光信號(hào),最終光信號(hào)經(jīng)光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換后由計(jì)算機(jī)記錄。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 方法的設(shè)計(jì)與原理

    基于微芯片電泳的在線分離功能,可在極其短時(shí)間內(nèi)有效分離待測(cè)物的特點(diǎn),將HRP催化魯米諾-H2O2化學(xué)發(fā)光,PIP增敏和T7Exo輔助信號(hào)放大技術(shù)聯(lián)用,設(shè)計(jì)了一種基于MCE-CL平臺(tái)的T7Exo輔助雙循環(huán)化學(xué)發(fā)光信號(hào)放大方法,原理如圖2所示。

    首先將P1、P2兩條DNA單鏈按照1∶1的比例在95 ℃下加熱5 min,再自然冷卻至室溫形成穩(wěn)定的P1/P2雙鏈復(fù)合物。當(dāng)靶標(biāo)不存在時(shí),由于P1/P2雙鏈復(fù)合物的熔鏈溫度設(shè)計(jì)高于P2與HRP-DNA雜交的熔鏈溫度,HRP-DNA不能將P1置換下來(lái),因此,此時(shí)不能形成P2/HRP-DNA雙鏈,即使加入T7Exo酶后體系中也不存在HRP標(biāo)記的單核苷酸片段。但當(dāng)靶標(biāo)HIV-DNA存在時(shí),可形成P1/P2/HIV-DNA三元復(fù)合物,此時(shí)P1的5′末端(綠色部分)形成平末端,加入T7Exo可以特異性地沿5′→3′方向降解P1/P2/HRP-DNA三元復(fù)合物雙鏈,釋放的HIV-DNA序列則重新與P1/P2雙鏈復(fù)合物雜交,T7Exo繼續(xù)降解切割三元復(fù)合物,并釋放P2單鏈(藍(lán)色部分)。P2單鏈與HRP-DNA可以部分雜交形成P2/HRP-DNA雙鏈,加入T7Exo后,探針DNA(HRP-DNA)鏈被降解,而與其雜交的P2序列重新與HRP-DNA雜交,T7Exo繼續(xù)降解。如此循環(huán),靶標(biāo)HIV-DNA可產(chǎn)生大量信號(hào)分子,經(jīng)過(guò)雙循環(huán)過(guò)程可實(shí)現(xiàn)超靈敏的目標(biāo)信號(hào)放大。由于加入的HRP-DNA過(guò)量,因此整個(gè)循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后,體系中存在大量HRP標(biāo)記的單核苷酸片段和過(guò)量的HRP-DNA,兩者均可催化H2O2氧化魯米諾反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。為實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的信號(hào)放大,利用MCE-CL對(duì)HRP標(biāo)記的單核苷酸片段和過(guò)量的HRP-DNA進(jìn)行分離。由于兩者分子量不同,在電泳圖中產(chǎn)生一前一后兩個(gè)峰,根據(jù)HRP標(biāo)記的單核苷酸片段峰高的變化,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)HIV-DNA的定量分析。

    為了驗(yàn)證方法原理的可行性,實(shí)驗(yàn)對(duì)3種含有不同組分的試樣進(jìn)行了MCE-CL分析。結(jié)果顯示:當(dāng)樣品溶液中不含靶標(biāo)HIV-DNA時(shí),電泳圖中僅出現(xiàn)一個(gè)電泳峰。存在靶標(biāo)HIV-DNA時(shí),電泳圖中出現(xiàn)了兩個(gè)電泳峰。隨著HIV-DNA濃度的增加,切割并釋放HRP標(biāo)記的單核苷酸片段的量也隨之增多,其HRP標(biāo)記的單核苷酸片段的相應(yīng)峰高也隨著增加。由此證明了出現(xiàn)在上游的峰為HRP標(biāo)記的單核苷酸片段的電泳峰,根據(jù)該峰的峰高或峰面積可實(shí)現(xiàn)HIV-DNA的定量分析。

    2.2 凝膠電泳分析

    為了進(jìn)一步考察方法可行性,證實(shí)P1/P2雙鏈復(fù)合物與HIV-DNA的結(jié)合以及加入T7 Exo后所引發(fā)的鏈剪切反應(yīng),設(shè)計(jì)了相應(yīng)的凝膠電泳實(shí)驗(yàn)(圖3)。通道1和2中的樣品分別為HIV-DNA和HRP-DNA。由于HRP標(biāo)記DNA改變了DNA的凝膠遷移速率,因此通道2出現(xiàn)了HRP-DNA停留在點(diǎn)樣孔的拖尾色帶。通道3中樣品為P1/P2的反應(yīng)產(chǎn)物,亮度較亮是因?yàn)閮烧呓Y(jié)合形成新的復(fù)合物,而熒光染料SYBR Green I與雙鏈DNA的親和力非常高導(dǎo)致染色效果明顯。由于HRP分子量比P1/P2雙鏈復(fù)合物大,條帶移動(dòng)較慢,所以HRP-DNA的條帶位置比該復(fù)合物滯后。通道4中的樣品為P1/P2復(fù)合物和HRP-DNA的混合溶液,條帶的移動(dòng)情況與通道3基本一致,表明HRP-DNA并不能把P1從P1/P2中置換出來(lái)。通道5中的樣品為P1/P2/HIV-DNA復(fù)合物,發(fā)現(xiàn)其條帶位置稍微后移。由于兩者分子質(zhì)量相差不大,所以條帶的位置和亮度變化并不大。通道6中的樣品為T(mén)7Exo、HRP-DNA和P1/P2雙鏈復(fù)合物的混合溶液,由于HRP-DNA滯留在點(diǎn)樣孔,未觀察到明顯條帶,P1/P2雙鏈復(fù)合物條帶仍然存在說(shuō)明T7Exo不能與P1/P2復(fù)合物作用。通道7中為HIV-DNA存在的情況下,T7Exo、HRP-DNA、P1/P2 和HIV-DNA的反應(yīng)混合物的條帶,發(fā)現(xiàn)T7Exo不能與P1/P2作用,而能與P1/P2/HIV-DNA復(fù)合物作用,即HIV-DNA觸發(fā)了整個(gè)循環(huán)放大反應(yīng),但反應(yīng)后的HIV-DNA與P1都不能呈現(xiàn)明顯的色帶。

    圖3 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis1.HIV-DNA;2.HRP-DNA;3.P1/P2 double-stranded complex(P1/P2雙鏈復(fù)合物);4.HRP-DNA+P1/P2 double-stranded complex;5.P1/P2 double-stranded complex+HIV-DNA;6.T7Exo+HRP-DNA+P1/P2 double-stranded complex;7.T7Exo+HRP-DNA+P1/P2 double-stranded complex+HIV-DNA;8.HIV-DNA;9.FAM-DNA;10.P1/P2 double-stranded complex;11.FAM-DNA+P1/P2 double-stranded complex;12.P1/P2 double-stranded complex+HIV-DNA;13.T7Exo+HRP-DNA+P1/P2 double-stranded complex;14.T7Exo+HRP-DNA+P1/P2 double-stranded complex+HIV-DNA;concentrations of HIV-DNA,HRP-DNA,P1,P2 and AM-DNA were 3.0×10-6 mol/L,the amount of T7 Exo was 80 U(HIV-DNA、HRP-DNA、P1、P2和FAM-DNA濃度均為3.0×10-6 mol/L,T7 Exo用量為80 U)

    為進(jìn)一步驗(yàn)證整個(gè)體系的鏈結(jié)合和酶切循環(huán)情況,將HRP-DNA的HRP換成FAM,即FAM-DNA。通道8中的樣品為HIV-DNA,通道9中的樣品為FAM-DNA,兩通道的電泳結(jié)果與通道1相同,均未呈現(xiàn)明顯的色帶。通道10為P1/P2雙鏈復(fù)合物,通道11為FAM-DNA和P1/P2雙鏈復(fù)合物的混合樣品,兩者的電泳結(jié)果基本相同,均為P1/P2雙鏈復(fù)合物的色帶。通道12為P1/P2雙鏈復(fù)合物與HIV-DNA的混合樣品,由于形成了P1/P2/HIV-DNA復(fù)合物,導(dǎo)致色帶位置稍微后移。通道13為T(mén)7Exo、FAM-DNA和P1/P2的混合物,電泳圖中也僅呈現(xiàn)P1/P2雙鏈復(fù)合物的條帶,說(shuō)明T7Exo不與P1/P2復(fù)合物作用。這是由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的P1/P2復(fù)合物中P2的5′端是伸出的末端,不能被T7Exo切割。通道14為HIV-DNA、T7Exo、FAM-DNA、P1/P2和HIV-DNA混合物,通道中未呈現(xiàn)明顯的色帶說(shuō)明T7Exo不與P1/P2復(fù)合物作用,但可與P1/P2/HIV-DNA復(fù)合物作用,即HIV-DNA觸發(fā)了整個(gè)循環(huán)放大反應(yīng),而反應(yīng)后的HIV-DNA與P1均未見(jiàn)明顯的色帶。凝膠電泳分析結(jié)果進(jìn)一步證明了本研究方法原理的可行性。

    2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

    為了實(shí)現(xiàn)基于MCE-CL平臺(tái)對(duì)HIV-DNA的高靈敏準(zhǔn)確定量,對(duì)影響電泳分離和化學(xué)發(fā)光的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,電泳分離電壓對(duì)于MCE的分離影響較大,分離電壓過(guò)大時(shí),會(huì)產(chǎn)生焦耳熱,溶液出現(xiàn)大量氣泡而呈現(xiàn)干擾峰,且基線不平穩(wěn)。但如果電壓過(guò)小,分離時(shí)間變長(zhǎng),且電泳峰展寬嚴(yán)重。為獲得最佳的分離度(Rs),同時(shí)避免產(chǎn)生基線噪音和峰展寬及干擾峰等現(xiàn)象,優(yōu)化后的分離電壓為2 400 V。

    羥丙基甲基纖維素(HPMC)、吐溫-80和SDS等可作為添加劑改善MCE的分離效果。在本實(shí)驗(yàn)中,雖然HPMC分離效果更佳,但因HPMC粘度較大,清洗不完全易堵塞芯片通道,而使用吐溫-80作為添加劑時(shí),出現(xiàn)出峰時(shí)間不穩(wěn)定的現(xiàn)象,因此采用SDS為添加劑以改善分離效果,優(yōu)化的SDS濃度為2×10-2mol/L。另外,采用硼砂溶液為電泳緩沖劑溶液時(shí),其濃度和pH值分別為3×10-2mol/L和9.3時(shí),可獲得最佳分離效果。

    實(shí)驗(yàn)還考察了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)和信號(hào)放大反應(yīng)的反應(yīng)條件。結(jié)果表明,在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中,魯米諾、H2O2和PIP的濃度分別為1.2×10-3、0.12、1.0×10-3mol/L,柱后氧化劑溶液pH值為9.5時(shí),體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最大。在信號(hào)放大反應(yīng)中,HRP-DNA 的濃度和T7Exo的用量分別為8×10-8mol/L和30 U,反應(yīng)時(shí)間為140 min時(shí),放大反應(yīng)的效果最好,靈敏度最高。

    2.4 HIV-DNA檢測(cè)的校準(zhǔn)曲線、線性范圍及靈敏度

    優(yōu)化條件下對(duì)一系列不同濃度的HIV-DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,HIV-DNA的信號(hào)峰強(qiáng)度(Y)與HIV-DNA濃度的對(duì)數(shù)值(X)在1.0×10-14~5.0×10-9mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性,線性方程為Y=2.191 5X+12.693 2,相關(guān)系數(shù)(r2)為0.997 5。以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算得HIV-DNA的檢出限(LOD)為1.6 ×10-15mol/L。

    2.5 特異性考察

    分別對(duì)單堿基錯(cuò)配的DNA(T1)、雙堿基錯(cuò)配的DNA(T2)、四堿基錯(cuò)配的DNA(T4)、全部堿基錯(cuò)配的DNA(Tn)(濃度均為5×10-10mol/L)和靶標(biāo)HIV-DNA(8×10-8mol/L)序列進(jìn)行檢測(cè),以評(píng)估方法的選擇性。結(jié)果顯示,僅靶標(biāo)HIV-DNA存在時(shí),HRP標(biāo)記的單核苷酸峰高(化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度)才顯著增強(qiáng),而在相同實(shí)驗(yàn)條件下,全部堿基錯(cuò)配的DNA未能引起HRP標(biāo)記單核苷酸的峰高發(fā)生明顯變化,其余堿基錯(cuò)配DNA的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨錯(cuò)配堿基數(shù)的增多而降低,表明本方法具有較高的特異性。

    2.6 血清樣品分析

    采用本方法對(duì)采集自桂林市第五醫(yī)院的正常人血清樣品進(jìn)行HIV-DNA測(cè)定,并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(圖4)。結(jié)果顯示,正常人血清樣品的電泳圖(曲線a)中僅出現(xiàn)一個(gè)電泳峰,表明樣品中不含有HIV-DNA;添加一定量HIV-DNA后,電泳圖中出現(xiàn)一個(gè)新的信號(hào)峰(曲線b),且隨著HIV-DNA濃度的增大而增高(曲線c)。在0.10、0.25、1.0、10(×10-12mol/L) 4個(gè)加標(biāo)濃度下,HIV-DNA的回收率為93.0%~103%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.50%~3.7%,表明本方法具有良好的準(zhǔn)確度,具有應(yīng)用于艾滋病早期診斷的潛力。

    圖4 正常人血清中HIV-DNA加標(biāo)測(cè)定的電泳圖Fig.4 Electropherograms for the detection of added HIV-DNA in normal human serum1:HRP-DNA;2:electrophoretic peak for HRP labeled single nucleotide fragment(HRP標(biāo)記的單核苷酸片段的電泳峰);a:electropherogram for normal human serum(正常人血清電泳圖);b:electropherogram for normal human serum added 1×10-13 mol/L HIV-DNA(正常人血清添加1×10-13 mol/L HIV-DNA電泳圖);c:electropherogram for normal human serum added 1×10-11 mol/L HIV-DNA(正常人血清加入1×10-11 mol/L HIV-DNA電泳圖)

    3 結(jié) 論

    本研究建立了一種基于微芯片電泳平臺(tái)的級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光信號(hào)放大策略用于HIV-DNA高靈敏檢測(cè)的分析方法。通過(guò)對(duì)靶標(biāo)HIV-DNA的信號(hào)進(jìn)行雙循環(huán)放大,實(shí)現(xiàn)了對(duì)HIV-DNA的超靈敏檢測(cè)。將信號(hào)放大反應(yīng)體系引入MCE-CL平臺(tái)可在短時(shí)間(60 s)內(nèi)對(duì)反應(yīng)后的混合物進(jìn)行快速有效分離。本方法具有儀器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、靈敏度高、特異性好和操作方便等優(yōu)點(diǎn),可用于復(fù)雜生物樣品中微量HIV-DNA的檢測(cè),為發(fā)展高靈敏度的MCE-CL方法提供了一種新途徑,并具有應(yīng)用于艾滋病早期診斷的潛力。

    猜你喜歡
    雙鏈化學(xué)發(fā)光靶標(biāo)
    “百靈”一號(hào)超音速大機(jī)動(dòng)靶標(biāo)
    昆蟲(chóng)共生細(xì)菌活體制造雙鏈RNA
    海外星云 (2021年21期)2021-01-19 14:17:31
    納米除草劑和靶標(biāo)生物的相互作用
    復(fù)雜場(chǎng)景中航天器靶標(biāo)的快速識(shí)別
    高新區(qū)科技企業(yè)孵化網(wǎng)絡(luò)“雙層雙鏈”結(jié)構(gòu)研究
    納米金催化Luminol-AgNO3化學(xué)發(fā)光體系測(cè)定鹽酸阿米替林
    殼聚糖印跡樹(shù)脂固相微萃取/化學(xué)發(fā)光法在線測(cè)定廢水中Cr3+
    前列腺特異性膜抗原為靶標(biāo)的放射免疫治療進(jìn)展
    BECKMAN DxI800全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)泌乳素的性能驗(yàn)證
    淺析TTT雙鏈刮板輸送機(jī)驅(qū)動(dòng)運(yùn)行與故障排除
    河南科技(2014年12期)2014-02-27 14:10:34
    国产精品女同一区二区软件| 中文字幕久久专区| 99热全是精品| 丰满少妇做爰视频| 久久久久久久精品精品| 精品国产一区二区久久| 婷婷色麻豆天堂久久| 在线天堂最新版资源| 日韩成人伦理影院| 内地一区二区视频在线| 国产精品人妻久久久影院| 最黄视频免费看| 天堂中文最新版在线下载| 五月开心婷婷网| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 18禁动态无遮挡网站| 51国产日韩欧美| 国产在视频线精品| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产成人91sexporn| 亚洲av成人精品一二三区| a级毛片在线看网站| 全区人妻精品视频| 国产欧美亚洲国产| 欧美激情国产日韩精品一区| 性高湖久久久久久久久免费观看| 午夜视频国产福利| 亚洲av在线观看美女高潮| 日韩一区二区三区影片| av不卡在线播放| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲情色 制服丝袜| 一边亲一边摸免费视频| 美女国产视频在线观看| 欧美bdsm另类| 日本与韩国留学比较| 男女免费视频国产| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲在久久综合| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 在线观看免费视频网站a站| 久久久a久久爽久久v久久| 免费黄网站久久成人精品| 日韩一区二区三区影片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 老司机亚洲免费影院| 一级毛片我不卡| 国产成人a∨麻豆精品| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 毛片一级片免费看久久久久| 一区二区三区四区激情视频| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 在线观看www视频免费| 黄色视频在线播放观看不卡| 精品少妇内射三级| av国产精品久久久久影院| 一级毛片电影观看| 精品久久久久久久久av| 最黄视频免费看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 永久网站在线| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 国产精品一区www在线观看| av国产久精品久网站免费入址| 多毛熟女@视频| 大码成人一级视频| 五月玫瑰六月丁香| 极品人妻少妇av视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲精品自拍成人| 永久免费av网站大全| 永久网站在线| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 免费观看在线日韩| 色网站视频免费| 免费av不卡在线播放| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲成色77777| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 九草在线视频观看| 欧美+日韩+精品| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 久久这里有精品视频免费| 精品视频人人做人人爽| 免费人成在线观看视频色| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 91成人精品电影| 丁香六月天网| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲精品国产av蜜桃| 久热久热在线精品观看| 麻豆乱淫一区二区| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产永久视频网站| 国产黄色免费在线视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 一级,二级,三级黄色视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 色5月婷婷丁香| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产成人freesex在线| 成人免费观看视频高清| 黄色日韩在线| 欧美日韩综合久久久久久| av.在线天堂| 国产精品一区二区性色av| 成人毛片a级毛片在线播放| 男女免费视频国产| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲精品,欧美精品| 中文欧美无线码| 亚洲精品日韩av片在线观看| 精品久久久久久久久亚洲| 国产精品国产av在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 91成人精品电影| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 丰满人妻一区二区三区视频av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 九九爱精品视频在线观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 乱人伦中国视频| 国产成人精品一,二区| 亚洲第一av免费看| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 成年女人在线观看亚洲视频| a级片在线免费高清观看视频| 尾随美女入室| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲真实伦在线观看| 街头女战士在线观看网站| 国产精品无大码| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | av卡一久久| 国产亚洲精品久久久com| 精品一区二区三区视频在线| 韩国av在线不卡| 秋霞在线观看毛片| 国产精品久久久久久精品电影小说| 少妇熟女欧美另类| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲人与动物交配视频| 在线观看www视频免费| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 亚洲自偷自拍三级| 多毛熟女@视频| 天堂8中文在线网| 亚洲情色 制服丝袜| 好男人视频免费观看在线| a 毛片基地| 亚洲精品456在线播放app| 一个人免费看片子| 久久久精品免费免费高清| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产日韩欧美亚洲二区| 99热全是精品| 春色校园在线视频观看| 能在线免费看毛片的网站| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲成人一二三区av| 精品人妻一区二区三区麻豆| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 不卡视频在线观看欧美| 99视频精品全部免费 在线| 日韩人妻高清精品专区| 一区二区三区精品91| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产亚洲91精品色在线| av天堂久久9| 人人澡人人妻人| 六月丁香七月| 欧美xxxx性猛交bbbb| 内地一区二区视频在线| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲成色77777| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| av免费观看日本| 九色成人免费人妻av| 天美传媒精品一区二区| 99久国产av精品国产电影| 亚洲欧美一区二区三区国产| 九九爱精品视频在线观看| 成人综合一区亚洲| 看免费成人av毛片| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲av中文av极速乱| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲精品乱久久久久久| 丰满迷人的少妇在线观看| 精品久久久精品久久久| 欧美xxxx性猛交bbbb| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 一级毛片aaaaaa免费看小| 大香蕉久久网| 99视频精品全部免费 在线| 日本与韩国留学比较| 亚洲精品乱久久久久久| 久久青草综合色| 一本大道久久a久久精品| 国产精品伦人一区二区| 国产免费又黄又爽又色| www.av在线官网国产| av网站免费在线观看视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 最近手机中文字幕大全| 少妇熟女欧美另类| 久久久a久久爽久久v久久| 国产毛片在线视频| 国产成人精品无人区| 一区二区三区精品91| 又大又黄又爽视频免费| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 午夜老司机福利剧场| 超碰97精品在线观看| 久久狼人影院| 成人免费观看视频高清| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| www.色视频.com| 色视频在线一区二区三区| 国产亚洲精品久久久com| 特大巨黑吊av在线直播| a级一级毛片免费在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| av在线播放精品| 水蜜桃什么品种好| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲欧美日韩东京热| 久久久亚洲精品成人影院| 国产一区二区在线观看av| 综合色丁香网| 国产 精品1| 久久久a久久爽久久v久久| 九草在线视频观看| 日日啪夜夜撸| www.色视频.com| 久久精品久久精品一区二区三区| 女性被躁到高潮视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产成人午夜福利电影在线观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲四区av| 99热这里只有精品一区| 亚洲国产精品999| 我的老师免费观看完整版| 亚洲综合色惰| 最近中文字幕高清免费大全6| 水蜜桃什么品种好| 高清在线视频一区二区三区| 午夜福利,免费看| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲国产av新网站| 色视频在线一区二区三区| 国产乱来视频区| 日韩精品免费视频一区二区三区 | av免费在线看不卡| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产精品一区www在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产精品成人在线| 国产高清国产精品国产三级| 老司机亚洲免费影院| 丁香六月天网| av福利片在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 国产精品福利在线免费观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 日韩大片免费观看网站| 亚洲色图综合在线观看| 精品少妇久久久久久888优播| 人妻系列 视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 我的老师免费观看完整版| 亚洲精品乱久久久久久| 性色avwww在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 国产成人一区二区在线| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| xxx大片免费视频| 大片免费播放器 马上看| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美日本中文国产一区发布| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产一区亚洲一区在线观看| videossex国产| 乱人伦中国视频| 国产黄片美女视频| 成人国产麻豆网| 免费观看无遮挡的男女| 特大巨黑吊av在线直播| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产精品成人在线| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲精品日本国产第一区| 日本欧美视频一区| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲精品乱久久久久久| 2021少妇久久久久久久久久久| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| av天堂中文字幕网| 色视频在线一区二区三区| 日韩视频在线欧美| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 女性被躁到高潮视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| 青春草视频在线免费观看| 边亲边吃奶的免费视频| 国产精品人妻久久久影院| 在线 av 中文字幕| 精品久久久噜噜| 日本-黄色视频高清免费观看| 一级毛片 在线播放| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 一区二区三区乱码不卡18| 一个人免费看片子| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲内射少妇av| 久久精品夜色国产| 日韩成人伦理影院| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲不卡免费看| 熟女电影av网| 久久久国产一区二区| 五月开心婷婷网| 日本wwww免费看| 天堂8中文在线网| 国产91av在线免费观看| 国产男女超爽视频在线观看| 在线看a的网站| 一本大道久久a久久精品| av黄色大香蕉| 九九在线视频观看精品| 日韩大片免费观看网站| 色婷婷久久久亚洲欧美| 一区二区三区乱码不卡18| 一个人免费看片子| 日韩欧美 国产精品| 97在线视频观看| 日本黄色片子视频| 看免费成人av毛片| www.色视频.com| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久这里有精品视频免费| 蜜臀久久99精品久久宅男| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲第一av免费看| av网站免费在线观看视频| 亚洲国产精品一区三区| 国产精品久久久久久精品古装| 国产精品.久久久| 中国三级夫妇交换| 人妻少妇偷人精品九色| 国产毛片在线视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲不卡免费看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 午夜久久久在线观看| 一级黄片播放器| 精品少妇黑人巨大在线播放| 99久久精品热视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲,欧美,日韩| 精品一区二区免费观看| 老司机影院成人| 中文资源天堂在线| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久这里有精品视频免费| 欧美日韩在线观看h| 国产av国产精品国产| 伊人久久国产一区二区| 在线看a的网站| 18禁在线播放成人免费| 99热这里只有精品一区| 亚洲欧美精品自产自拍| 中国国产av一级| 老熟女久久久| 日韩欧美 国产精品| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| av线在线观看网站| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| av一本久久久久| 中文字幕免费在线视频6| av天堂中文字幕网| 午夜久久久在线观看| 久热久热在线精品观看| 亚洲电影在线观看av| 男女边吃奶边做爰视频| 国产精品蜜桃在线观看| 高清午夜精品一区二区三区| 伦理电影免费视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 晚上一个人看的免费电影| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲内射少妇av| 成人二区视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 偷拍熟女少妇极品色| 国产成人freesex在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 免费观看的影片在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久久久网色| 黄色配什么色好看| 亚洲精品色激情综合| 免费看av在线观看网站| 日本免费在线观看一区| 国产黄片视频在线免费观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美日韩在线观看h| 大香蕉97超碰在线| 国产伦理片在线播放av一区| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲精品成人av观看孕妇| 性高湖久久久久久久久免费观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 校园人妻丝袜中文字幕| 久久久久久久亚洲中文字幕| 欧美日韩在线观看h| 国产精品熟女久久久久浪| 99re6热这里在线精品视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 高清午夜精品一区二区三区| 9色porny在线观看| tube8黄色片| 日本午夜av视频| 女性被躁到高潮视频| av有码第一页| 国产亚洲最大av| 老女人水多毛片| 26uuu在线亚洲综合色| 韩国高清视频一区二区三区| 国产精品国产三级专区第一集| 国产精品久久久久成人av| 99视频精品全部免费 在线| 一级毛片 在线播放| 另类精品久久| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产高清有码在线观看视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 精品国产一区二区久久| 日韩一区二区三区影片| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲色图综合在线观看| 久久久精品免费免费高清| 99热网站在线观看| 亚洲成人一二三区av| 欧美精品一区二区大全| 国模一区二区三区四区视频| 人妻一区二区av| 日韩av免费高清视频| 伊人久久国产一区二区| 日本av免费视频播放| 简卡轻食公司| 黄色配什么色好看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 男女无遮挡免费网站观看| 少妇人妻 视频| 国产69精品久久久久777片| 国产成人精品久久久久久| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲国产精品999| 九色成人免费人妻av| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美精品一区二区免费开放| a 毛片基地| av.在线天堂| 卡戴珊不雅视频在线播放| 午夜福利,免费看| 国产精品三级大全| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日韩精品有码人妻一区| 人妻系列 视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 在线观看国产h片| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲综合色惰| 中文字幕亚洲精品专区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 热99国产精品久久久久久7| 国产精品一区二区在线观看99| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产精品人妻久久久久久| 午夜激情久久久久久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲自偷自拍三级| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久精品国产自在天天线| 日本黄色片子视频| 国产黄色免费在线视频| 简卡轻食公司| 我的老师免费观看完整版| 婷婷色综合www| 国产高清不卡午夜福利| 久久6这里有精品| 在线精品无人区一区二区三| 国产高清国产精品国产三级| 久久这里有精品视频免费| 精品午夜福利在线看| 日本91视频免费播放| 亚洲国产精品专区欧美| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美丝袜亚洲另类| 只有这里有精品99| 99热全是精品| 亚洲精品视频女| 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 老司机亚洲免费影院| 欧美xxⅹ黑人| 大香蕉97超碰在线| 国产精品久久久久久久电影| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美日本中文国产一区发布| 视频中文字幕在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲,欧美,日韩| 青青草视频在线视频观看| 尾随美女入室| 成人漫画全彩无遮挡| 中文资源天堂在线| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 成人影院久久| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产男女内射视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 一个人免费看片子| 各种免费的搞黄视频| 国产高清三级在线| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲第一av免费看| 欧美精品国产亚洲| 日韩电影二区| 日韩三级伦理在线观看| 一级爰片在线观看| 国产亚洲91精品色在线| 欧美97在线视频| 色哟哟·www| 国产精品国产av在线观看| av天堂久久9| 色5月婷婷丁香| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 国产精品一区www在线观看| 伊人亚洲综合成人网| 国产成人aa在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 99热6这里只有精品| 国产黄频视频在线观看| 超碰97精品在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 熟妇人妻不卡中文字幕| 人人妻人人澡人人看| 日本黄色片子视频| 69精品国产乱码久久久| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产在线一区二区三区精| 成人国产av品久久久| 99久久精品一区二区三区| a级毛片免费高清观看在线播放| 午夜视频国产福利| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 麻豆成人av视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 女性生殖器流出的白浆| 一区二区三区乱码不卡18| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 老司机影院成人| 亚洲精品自拍成人| 久久99热6这里只有精品| 日本色播在线视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 一区二区av电影网| 免费黄频网站在线观看国产| 久久久国产一区二区| 国产精品人妻久久久久久| 青青草视频在线视频观看| 大香蕉久久网| 性色avwww在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 午夜激情福利司机影院|