1-萘酚誘導(dǎo)人血清白蛋白和牛血清白蛋白構(gòu)象的變化

李夢(mèng)碩，朱亞先，張 勇*

(1.近海海洋環(huán)境科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門(mén)大學(xué) 環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361102；2.廈門(mén)大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 化學(xué)系，福建 廈門(mén) 361005)

環(huán)境中的中低分子量多環(huán)芳烴(PAHs)可經(jīng)呼吸或飲食攝入人體，一部分PAHs在循環(huán)系統(tǒng)中被血液中的酶迅速代謝并激活，生成環(huán)氧化合物、羥基化PAHs等代謝產(chǎn)物，而這些代謝產(chǎn)物與生物大分子的相互作用可對(duì)人體健康產(chǎn)生危害[1-3]。血清白蛋白是人體循環(huán)系統(tǒng)中含量最豐富的運(yùn)輸?shù)鞍?，其與PAHs代謝產(chǎn)物的相互作用可調(diào)節(jié)后者的分布和運(yùn)輸。因此，血清白蛋白與PAHs代謝產(chǎn)物相互作用的研究備受關(guān)注[4-6]。牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)因生產(chǎn)成本低、易于獲取的優(yōu)點(diǎn)被廣泛用作模式蛋白研究血清白蛋白和外源小分子的相互作用。BSA與人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)晶體結(jié)構(gòu)中的氨基酸序列表現(xiàn)出76%的相似性，但Maity等[7]的研究表明碳納米點(diǎn)-BSA復(fù)合物的穩(wěn)定性較碳納米點(diǎn)-HSA更高，而B(niǎo)ourassa等[8]的研究表明，葉酸-BSA的結(jié)合常數(shù)較葉酸-HSA的結(jié)合常數(shù)更高，同一污染物與BSA、HSA的結(jié)合作用也存在差異。本課題組對(duì)BSA與1-羥基芘(1-Hydroxylpyrene，1-OHPyr)相互作用的研究結(jié)果顯示[9]，1-OHPyr-BSA的熒光特征峰與Carmona等[10]的研究結(jié)果差異明顯；并利用芘(Pyrene，Pyr)的微環(huán)境極性探針性質(zhì)證實(shí)Pyr在HSA、BSA中結(jié)合位點(diǎn)的微極性存在差異[4]。Sun等[11]在吸煙人群血液中檢測(cè)到大量1-羥基萘(1-Naphthol，1-OHNap)，該物質(zhì)可嵌入BSA的疏水空腔并形成復(fù)合物[5]，但其與HSA、BSA的相互作用與1-OHPyr間的異同尚未見(jiàn)報(bào)道。

本文采用穩(wěn)態(tài)熒光光譜、同步熒光光譜、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)結(jié)合分子對(duì)接法，考察了1-OHNap與HSA、BSA相互作用的異同。嘗試進(jìn)一步闡明不能用BSA代替HSA開(kāi)展相關(guān)工作，并藉此為吸煙對(duì)人體健康的影響研究提供分子水平的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

BSA(>96%)和三羥甲基氨基甲烷(分析純)均購(gòu)于阿拉丁試劑公司；HSA(≥97%)和1-OHNap(分析純)購(gòu)自Sigma試劑公司；無(wú)水乙醇等其余藥品均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

QM 8000光譜儀(日本Horiba公司)；J-810圓二色光譜儀(日本Jasco公司)；Five Easy Plus臺(tái)式pH計(jì)(美國(guó)Mettler Toledo公司)；DF-101S恒溫水浴鍋(中國(guó)華美公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1熒光發(fā)射、同步熒光光譜的測(cè)定依次向兩組10 mL棕色比色管中，分別加入100 μL 1.0×10-4mol/L 的HSA、BSA，然后加入不同量的1.0×10-3mol/L 1-OHNap，使其終濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5×10-5mol/L，以0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液定容，搖勻后靜置30 min，待體系達(dá)到平衡后分別進(jìn)行熒光發(fā)射、同步熒光光譜測(cè)定。熒光光譜儀參數(shù)設(shè)定：激發(fā)、發(fā)射狹縫均為5 nm，掃描停留時(shí)間為0.05 s，步距為1 nm；測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，上述體系在290～550 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜；以及Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時(shí)，體系在290～360 nm和300～420 nm范圍內(nèi)的同步熒光光譜。

1.2.2CD光譜室溫(T=291 K)下，掃描190～250 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)不同濃度1-OHNap與HSA、BSA混合體系中HSA、BSA的CD光譜。CD光譜儀參數(shù)設(shè)定：掃描速度100 nm/min；響應(yīng)時(shí)間0.2 s；響應(yīng)波長(zhǎng)寬度1 nm。將樣品CD光譜值輸入CDPro軟件，通過(guò)SELCON3方法，計(jì)算獲得結(jié)合1-OHNap后HSA、BSA中各自α-螺旋的占比。

1.2.3分子對(duì)接模擬采用Auto Dock4.2.1和 Auto Dock Tools軟件計(jì)算1-OHNap分別在HSA、BSA中對(duì)接能量最低的構(gòu)型。對(duì)接過(guò)程、參數(shù)均參考文獻(xiàn)方法[12]。分子對(duì)接時(shí)選擇的HSA(PDB編號(hào)：1AO6)和BSA(PDB編號(hào)：4F5S)的晶體結(jié)構(gòu)均由PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載。利用Pymol軟件進(jìn)行可視化研究并計(jì)算最優(yōu)構(gòu)型結(jié)合口袋處1-OHNap周?chē)??范圍內(nèi)氨基酸的極性和與色氨酸(Tryptophan，Trp)殘基之間的距離。

2 結(jié)果與討論

2.1 1-OHNap誘導(dǎo)HSA、BSA構(gòu)象變化的差異

2.1.1熒光猝滅光譜熒光法是在低濃度、非破壞生理?xiàng)l件下，評(píng)估蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的有效檢測(cè)手段[13]。如圖1所示，當(dāng)λex=280 nm時(shí)，HSA(335 nm)、BSA(340 nm)的熒光發(fā)射強(qiáng)度主要由Trp、酪氨酸(Tyrosine，Tyr)熒光團(tuán)貢獻(xiàn)，此外，在330～340 nm范圍內(nèi)的熒光信號(hào)均不受1-OHNap(476 nm)熒光信號(hào)的干擾。如圖2A所示，當(dāng)HSA溶液中加入1-OHNap后，HSA在λem=335 nm處的峰由1個(gè)變成3個(gè)，其位置分別為λem=315 nm、328 nm和340 nm。Bobone等[14]的研究結(jié)果表明磷酸鹽緩沖溶液中單獨(dú)Trp、Tyr殘基的特征熒光發(fā)射峰分別在λem=305 nm和360 nm處。文獻(xiàn)指出BSA特征熒光發(fā)射峰的位置、強(qiáng)度與其Trp、Tyr殘基微環(huán)境的極性有關(guān)[15]。Abou-Zied等[16]的研究表明HSA的構(gòu)象展開(kāi)后，其特征熒光發(fā)射峰可由1個(gè)峰變成位于λem=308 nm和355 nm的兩個(gè)。由此可知，HSA與1-OHNap結(jié)合后會(huì)導(dǎo)致HSA中熒光團(tuán)Trp、Tyr殘基周?chē)h(huán)境的極性發(fā)生改變，且與1-OHNap的結(jié)合作用可誘導(dǎo)HSA構(gòu)象的變化。Wu等[5]的研究結(jié)果表明,1-OHNap以π-π堆積或與BSA分子內(nèi)氨基酸殘基形成復(fù)合物。如圖2B所示，當(dāng)向BSA體系中加入梯度濃度的1-OHNap后，BSA在340 nm的熒光發(fā)射峰呈現(xiàn)出4 nm的紅移，說(shuō)明BSA中熒光團(tuán)周?chē)臉O性增加，疏水性減弱。顯然，結(jié)合1-OHNap后，HSA的特征熒光光譜較BSA有明顯變化，且1-OHNap誘導(dǎo)HSA構(gòu)象的變化更顯著。

圖1 HSA(A)、BSA(B)和1-OHNap(C)的熒光發(fā)射光譜Fig.1 Fluorescence emission spectra of HSA(A),BSA(B) and 1-OHNap(C)λex=280 nm,Ex./Em.slit=5/5 nm(for 1-OHNap and HSA,BSA);c1-OHNap=5.0×10-6 mol/L;cHSA=cBSA=1.0×10-6 mol/L

2.1.2同步熒光光譜利用同步熒光光譜考察了1-OHNap對(duì)1-OHNap-HSA、1-OHNap-BSA體系中HSA、BSA的Trp(Δλ=60 nm)和Tyr(Δλ=15 nm)殘基微環(huán)境極性的影響[17]。如圖3A所示，隨著1-OHNap濃度的增加，1-OHNap-HSA體系中HSA Tyr殘基的熒光強(qiáng)度降低,Trp殘基的熒光特征峰紅移。文獻(xiàn)[14]的工作表明,Trp、Tyr殘基特征熒光發(fā)射峰的位置會(huì)隨溶劑極性的不同而變化。由此可知，加入1-OHNap后，1-OHNap-HSA體系中Trp、Tyr殘基周?chē)h(huán)境的極性改變。如圖3B所示，隨著1-OHNap濃度的增加，1-OHNap-BSA體系中BSA Tyr、Trp殘基的熒光強(qiáng)度均降低，Trp殘基的熒光特征峰紅移2 nm。因此，加入1-OHNap后，1-OHNap與BSA形成復(fù)合物，1-OHNap-BSA體系中Trp殘基周?chē)h(huán)境的極性增加，疏水性減弱。

2.1.3CD光譜利用CD光譜法定量考察了不同濃度1-OHNap對(duì)HSA、BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響[17]。如圖4A、B所示，210 nm和220 nm兩個(gè)負(fù)峰表示血清白蛋白中的α-螺旋結(jié)構(gòu)[18]。當(dāng)向HSA、BSA中各加入等濃度的1-OHNap時(shí)，HSA中α-螺旋含量的占比由50.5%降至44.3%，BSA中α-螺旋含量的占比由50.4%降至48.7%。HSA中α-螺旋占比的降幅較BSA更大，說(shuō)明1-OHNap誘導(dǎo)HSA構(gòu)象的變化更顯著 。當(dāng)混合體系中1-OHNap的濃度增至HSA、BSA濃度的2倍和10倍時(shí)，HSA、BSA中α-螺旋含量的占比分別為48.7%、45.8%和46.0%、50.3%。由此可見(jiàn)，1-OHNap的加入可改變HSA、BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這是由1-OHNap與HSA、BSA形成復(fù)合物引起的[5]。

2.2 1-OHNap與HSA、BSA結(jié)合常數(shù)的差異

研究表明，1-OHNap與血清白蛋白的結(jié)合作用力以范德華力和氫鍵作用為主[5]。當(dāng)1-OHNap與HSA、BSA以1∶1結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)，利用雙對(duì)數(shù)方程擬合[19]得到1-OHNap分別與HSA、BSA作用的結(jié)合平衡常數(shù)(Kb)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)。如表1所示，1-OHNap-HSA和1-OHNap-BSA體系的Kb值分別為1.49×104L/mol和8.76×103L/mol，有一個(gè)數(shù)量級(jí)的差異。

表1 不同體系的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Table 1 Binding constants and number of binding sites of different systemsT=291 K

2.3 1-OHNap與HSA、BSA結(jié)合位點(diǎn)的差異

為進(jìn)一步從分子水平探究1-OHNap與HSA、BSA形成穩(wěn)定復(fù)合物時(shí)結(jié)合位點(diǎn)的差異，分別進(jìn)行HSA、BSA與1-OHNap的分子對(duì)接研究。經(jīng)計(jì)算，1-OHNap在HSA、BSA中的最優(yōu)結(jié)合位點(diǎn)分別是ⅡA子域和ⅠB子域，結(jié)合自由能分別為-5.47 kJ/mol和-5.61 kJ/mol，表明1-OHNap與HSA、BSA的結(jié)合過(guò)程均可自發(fā)形成。如圖5所示，利用Pymol軟件獲得最優(yōu)結(jié)合位點(diǎn)處1-OHNap與HSA中Trp214(1.26 nm)，BSA中Trp134(1.24 nm)和Trp213(2.77 nm)的距離。結(jié)合態(tài)1-OHNap在HSA作用位點(diǎn)4?范圍內(nèi)的非極性氨基酸有Ile264、Ala291、Ala261和Leu238，極性氨基酸有Tyr150，帶正電荷的極性氨基酸有Arg257和His242，帶負(fù)電荷的極性氨基酸有Glu292；而1-OHNap在BSA作用位點(diǎn)4?范圍內(nèi)的非極性氨基酸有Ile141、Pro117、Met184、Ile181，極性氨基酸有Tyr137、Tyr160和Asn 267，帶正電荷的極性氨基酸有Arg185，帶負(fù)電荷的極性氨基酸有Glu182，表明ⅠB子域因其不完全疏水而表現(xiàn)出一定極性，與Zhang等[9]發(fā)現(xiàn)的1-OHPyr可進(jìn)入BSA中ⅠB子域的結(jié)合位點(diǎn)并導(dǎo)致其周?chē)被釟埢杷越档偷慕Y(jié)果一致。

圖5 1-OHNap在HSA(A)和BSA(B)中不同結(jié)合位點(diǎn)的分子對(duì)接圖像Fig.5 Molecular docking images of HSA(A) and BSA(B) with 1-OHNap at different binding sites

2.4 1-OHNap與HSA、BSA中Trp作用距離的差異

為進(jìn)一步明確1-OHNap分別與HSA、BSA結(jié)合位點(diǎn)的差異，根據(jù)F?rster能量轉(zhuǎn)移理論[20]，采用Felix GX 4.1.2軟件計(jì)算了1-OHNap分別與HSA、BSA的能量轉(zhuǎn)移效率(E)和表觀距離(R0)。如圖6所示，1-OHNap的最大吸收峰位于295 nm左右，與HSA、BSA的熒光發(fā)射光譜有一定程度的重疊，受體1-OHNap滿(mǎn)足與供體HSA、BSA發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的要求。當(dāng)1-OHNap與HSA、BSA等濃度混合時(shí)，1-OHNap與HSA、BSA的E分別為8.7 %和4.7 %，結(jié)合位點(diǎn)處的1-OHNap與HSA和BSA中Trp殘基的R0分別為1.53 nm和1.42 nm，與“2.3”中1-OHNap分別與HSA中Trp214(1.26 nm)、BSA中Trp134(1.24 nm)的距離接近，該結(jié)論與分子對(duì)接的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖6 HSA(A)、BSA(B)的熒光發(fā)射光譜與1-OHNap(C)的UV-Vis吸收光譜Fig.6 Fluorescence emission spectra of HSA(A),BSA(B) and UV-Vis spectrum of 1-OHNap(C)

3 結(jié) 論

本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1-OHNap與HSA、BSA相互作用時(shí)的結(jié)合位點(diǎn)及微環(huán)境極性存在差異，且造成的HSA構(gòu)象的變化更為顯著；低分子量1-OHNap通過(guò)π-π堆積或形成復(fù)合物作用，對(duì)HSA構(gòu)象的影響高于BSA。進(jìn)一步說(shuō)明用BSA代替HSA開(kāi)展有關(guān)PAHs代謝產(chǎn)物與血清白蛋白相互作用機(jī)制研究時(shí)，血液中的1-OHNap對(duì)HSA轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響被低估。同時(shí)，利用時(shí)間分辨熒光光譜和熒光壽命顯微成像技術(shù)等方法有望更好地從分子水平全面了解PAHs代謝產(chǎn)物分別與HSA和BSA作用機(jī)制的差異。