水環(huán)境中胞內(nèi)外抗生素抗性基因分析的DNA提取方法及污染現(xiàn)狀研究進(jìn)展

王敏妍，李亞麗，鄒世春，楊 穎

(中山大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

1 水體中的胞內(nèi)及胞外抗生素抗性基因

抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes,ARGs)是使細(xì)菌產(chǎn)生抗生素耐藥性的功能基因，可通過產(chǎn)生滲透壁壘、促進(jìn)藥物排出、修飾作用位點(diǎn)和產(chǎn)生破壞藥物分子有效結(jié)構(gòu)的酶等機(jī)制發(fā)揮作用[1]。微生物耐藥性的出現(xiàn)被認(rèn)為是微生物應(yīng)對抗生素選擇壓力、爭取更高生存機(jī)會的自然進(jìn)化反應(yīng)，而抗生素在醫(yī)療行為和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廣泛使用和濫用是環(huán)境中ARGs不斷增多的主要驅(qū)動力。據(jù)統(tǒng)計，2013年中國抗生素的總使用量達(dá)到了162 000噸[2]。約50%的人畜用抗生素會以原藥的形式隨尿液排出[3]，增加了抗生素在自然環(huán)境中的含量，促進(jìn)了ARGs的產(chǎn)生及擴(kuò)散傳播。

按照ARGs在水環(huán)境中的存在形態(tài)，即其是否存在于結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞的內(nèi)部或外部，可將ARGs分為胞內(nèi)ARGs(Intracellular ARGs,iARGs)和胞外ARGs(Extracellular ARGs,eARGs)。不同存在形態(tài)的ARGs在環(huán)境持續(xù)性、遷移能力和傳播方式上有所差異。由于細(xì)胞膜的保護(hù)，存在于細(xì)胞內(nèi)部的iARGs抵抗核酸酶降解的能力較強(qiáng)，但iARGs更容易在水處理等過程中隨細(xì)胞一同被去除[4]，因此其在水環(huán)境中的遷移能力有限。iARGs可以通過細(xì)胞間的接觸結(jié)合或經(jīng)由噬菌體感染的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制在不同微生物間進(jìn)行傳播[3]。eARGs主要來源于死細(xì)胞的裂解和活細(xì)胞的分泌，其可分為吸附型eARGs(Adsorbed eARGs,a-eARGs)和游離型eARGs(Free eARGs,f-eARGs)。a-eARGs可通過吸附在細(xì)胞表面避免核酸酶的攻擊，所以更能抵御環(huán)境壓力的干擾。而水處理對f-eARGs的去除效果十分有限[4]，因此f-eARGs擁有更強(qiáng)的遷移能力。eARGs可以通過轉(zhuǎn)化被自然環(huán)境中的感受態(tài)細(xì)菌吸收[3]，其中a-eARGs比f-eARGs更容易與感受態(tài)細(xì)胞膜進(jìn)行偶聯(lián)，從而具有更高的轉(zhuǎn)化幾率[5]。

ARGs在水環(huán)境中的長期存在和傳播導(dǎo)致致病菌耐藥性的增長與擴(kuò)散，現(xiàn)已成為公共健康安全的潛在威脅。因此，需加強(qiáng)對水環(huán)境中不同存在形態(tài)ARGs種類和含量的分析檢測，以評估水環(huán)境中ARGs的污染水平及影響。從水樣中提取出高質(zhì)量的胞內(nèi)DNA(Intracellular DNA,iDNA)及胞外DNA(Extracellular DNA,eDNA)是對水環(huán)境中ARGs污染進(jìn)行深入分析的前提。本文介紹了目前水環(huán)境微生物iDNA和eDNA提取的常用方法，并分析了它們在ARGs研究中的應(yīng)用狀況；同時比較了不同水環(huán)境中iARGs和eARGs的污染水平，并探討了它們在水環(huán)境中的傳播與環(huán)境歸趨。

2 水樣中iDNA與eDNA的提取方法

2.1 乙醇沉淀法

乙醇沉淀法是常用的水環(huán)境微生物DNA提取方法。Ficetola等[6]將水樣與無水乙醇和乙酸鈉溶液(3 mol·L-1)以10∶22∶1的體積比混合并置于-20 ℃過夜保存后，以5 500 ×g離心35 min，收集沉淀并棄去上清液，再使用DNA純化試劑盒對沉淀進(jìn)行提純。乙醇可以消除核酸的水化層，使帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)暴露出來；而乙酸鈉中的Na+能與帶電基團(tuán)結(jié)合，降低核苷酸鏈間的排斥作用，有利于沉淀的形成。由于環(huán)境水樣中DNA含量較低而雜質(zhì)較多，乙醇沉淀法通常只作為DNA的初步提取手段，后續(xù)還需通過DNA純化試劑盒等處理去除雜質(zhì)，獲得純度更高的DNA。

乙醇沉淀法常用于水樣總DNA或iDNA提取，Eichmiller等[7]利用乙醇沉淀法提取了井水和湖水水樣的總DNA，F(xiàn)oote等[8]利用乙醇沉淀法提取了海水水樣中的總DNA，Lekunberri等[9]利用乙醇沉淀法提取了排污口河水水樣的細(xì)菌質(zhì)粒DNA，發(fā)現(xiàn)在污水水樣和排污口附近淡水水樣中提取的iDNA在純度和質(zhì)量上可滿足ARGs分析要求[9]。

乙醇沉淀法也被應(yīng)用于eDNA的提取，如Zhang等[10]利用乙醇沉淀法提取污水處理廠水樣中的f-eARGs。但乙醇沉淀法提取的eDNA純度有限，如Yuan等[4]從污水水樣中提取出eDNA的A260/A280為2.1，表明樣品存在RNA污染，且乙醇沉淀法的eDNA產(chǎn)率不高，遠(yuǎn)低于磁珠法。

乙醇沉淀法通常適用于水樣體積較小的情況。如Ficetola等[6]和Eichmiller等[7]提取淡水水樣中DNA時使用的水樣體積為15 mL；Zhang等[10]提取污水處理廠水樣中f-eDNA時使用的水樣體積為330 mL；Yuan等[4]提取污水處理廠水樣中eDNA使用的體積為200 mL。環(huán)境水樣中eDNA的濃度通常較低，為了獲取足夠的DNA供后續(xù)分析，需使用更大體積的水樣。但使用乙醇沉淀法對大體積水樣進(jìn)行處理，容易造成試劑的大量浪費(fèi)。

綜上，乙醇沉淀法試劑簡單，操作便利，是常用的水樣總DNA提取方法，適用于微生物含量較為豐富的污水處理廠水樣或靠近排污口的環(huán)境水樣的總DNA提取或iDNA提取。由于環(huán)境水體中的eDNA含量較低，該方法較難獲得滿足后續(xù)ARGs分析所需的DNA質(zhì)量與純度。因此，不建議使用乙醇沉淀法提取清潔水體微生物DNA或環(huán)境水樣中的eDNA。

2.2 十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB法)

CTAB法也是較為經(jīng)典的DNA提取方法。CTAB具有可從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性；而在高離子強(qiáng)度溶液中，CTAB能與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物。CTAB法基于CTAB結(jié)合蛋白質(zhì)和多聚糖的特性，先通過有機(jī)溶劑抽提去除蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)，再利用乙醇或異丙醇沉淀分離核酸。

CTAB法最常用于植物DNA的提取，也有部分研究將其應(yīng)用于水樣中DNA的提取[11-13]。利用CTAB法提取水樣中的iDNA時，需用含有CTAB的裂解液裂解細(xì)胞，依次用苯酚-氯仿-異戊醇(體積比25∶24∶1)混合液和氯仿-異戊醇(體積比24∶1)混合液抽提后，再用異丙醇或乙醇沉淀DNA[11]。苯酚-氯仿-異戊醇混合溶液抽提，可去除蛋白和多糖等雜質(zhì)。苯酚使蛋白質(zhì)變性的能力最強(qiáng)，但室溫下可溶于水，氯仿不溶于水而與苯酚互溶，因而可在二次抽提中用于去除殘留的苯酚。Wang等[11]應(yīng)用改良的CTAB法從湖水水樣中提取iDNA，分析了洪湖ARGs的相對豐度。

利用CTAB提取水樣中的eDNA時，先用CTAB和異丙醇初步去除蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)，依次用苯酚-氯仿-異戊醇(體積比25∶24∶1)混合液和氯仿-異戊醇(體積比24∶1)混合液抽提后，再用乙醇沉淀DNA[4]。CTAB法對水樣中iDNA的提取效果較好；但對eDNA的提取在質(zhì)量和產(chǎn)量上均不理想。在ARGs的分析研究上，CTAB法較適用于污水處理廠水樣或靠近排污口的環(huán)境水樣中微生物的總DNA及iDNA提取，不適用于處理體積較大水樣以及eDNA的提取。

2.3 DNA提取試劑盒

DNA提取試劑盒是較為成熟的水樣DNA提取方法。對比乙醇沉淀法與CTAB法，商業(yè)化的DNA提取試劑盒往往具有毒性小、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。DNA試劑盒的使用通常包括細(xì)胞裂解、DNA吸附、雜質(zhì)去除及DNA洗脫等步驟，不同試劑盒的差異主要體現(xiàn)在細(xì)胞裂解方式的選擇上。如QIAamp DNA Mini Kit、QIAamp DNA Stool Mini Kit與DNeasy Blood and Tissue Kit使用蛋白酶裂解細(xì)胞；Power Water Kit與Power Soil DNA Isolation Kit通過微珠機(jī)械碰撞和十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液共同作用裂解細(xì)胞；FastDNA SPIN Kit for Soil使用磁珠機(jī)械裂解細(xì)胞[14]。被釋放至溶液中的DNA通常使用離心柱膜或硅膠基質(zhì)吸附，經(jīng)洗滌、純化后，通過洗脫緩沖液洗脫并收集。

不同DNA提取試劑盒對不同類型環(huán)境水樣DNA的提取效果具有差異性。Walden等[15]對比了4種DNA提取試劑盒對微生物iDNA的提取效果，認(rèn)為QIAamp DNA Mini Kit和Power Soil DNA Isolation Kit更適于湖水和污水樣品的iDNA提取。Eichmiller等[7]對比了6種DNA提取試劑盒對湖水和井水總DNA的提取效果，發(fā)現(xiàn)Power Soil DNA Isolation Kit在湖水和井水中均顯示出較高的提取效率；FastDNA SPIN Kit、DNeasy Blood and Tissue Kit和QIAamp Stool Mini Kit在不同水源水樣中的提取效果差異較大；而Power Water DNA Isolation Kit和FastDNA SPIN Kit for Soil對水樣中微生物DNA的提取效率并不理想。Yang等[16]使用FastDNA SPIN Kit for Soil有效提取并檢測了污水處理廠水樣的總ARGs；而Yuan等[4]嘗試使用該試劑盒提取污水處理廠水樣中的eDNA時，并未獲得滿足ARGs分析需求的樣品。

總體來說，需根據(jù)不同的水樣類型和目標(biāo)DNA選擇適合的DNA提取試劑盒。但就目前的研究而言，DNA提取試劑盒對eARGs的提取效果較差，不能滿足后續(xù)分析需求。

2.4 二氧化硅固相萃取

在針對DNA提取的固相萃取方法中，常使用二氧化硅顆粒作為萃取相載體。在高鹽度溶液中，二氧化硅表面豐富的羥基能與DNA上的磷酸鹽通過陽離子橋鍵反應(yīng)結(jié)合[17]，且二氧化硅顆粒巨大的比表面積提供了大量的結(jié)合位點(diǎn)，更有利于DNA與萃取相的吸附。此外，二氧化硅顆粒表面易于改性，可通過引入不同的官能團(tuán)提高載體表面對DNA的吸附能力，其中氨基修飾的二氧化硅顆粒對水樣DNA的吸附效果最好[18]。但使用二氧化硅固相萃取法提取環(huán)境水樣中iDNA前，需進(jìn)行裂解細(xì)胞前處理，將iDNA從細(xì)胞中釋放。萃取完成后，可根據(jù)二氧化硅顆粒表面改性情況選擇Tris-HCl、PBS緩沖溶液或有機(jī)洗脫液將DNA洗脫并收集[19-20]。

二氧化硅顆?？捎糜诃h(huán)境水樣中eDNA的提取。Wang等[20]提出了一種利用新型核酸吸附顆粒(NAAPs)從大量水樣中富集、提取eDNA的方法，NAAPs由含有Al(OH)3涂層的硅膠組成，主要利用靜電吸附進(jìn)行提取，eDNA回收率在95%以上。Hao等[14]使用NAAPs提取自來水中的eDNA，并通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測出了其中eARGs的濃度。

二氧化硅固相萃取在水樣DNA提取中的應(yīng)用潛力巨大，其易于改性的特性為提取效果的提升提供了更多的可能。研究結(jié)果顯示，該方法可從大量環(huán)境水樣中有效提取eDNA，用于后續(xù)eARGs的分析檢測[20]。二氧化硅固相萃取無有機(jī)溶劑污染，可應(yīng)用于低DNA濃度水樣，易于改性，提取效率高，在自然水體中ARGs的檢測方面有較高的可用性和發(fā)展前景。

2.5 磁珠法

磁珠法是分散固相萃取的一種方法，將微米或納米尺度的磁珠分散在溶液中，其巨大的比表面積有助于結(jié)合水樣中游離的DNA。磁珠一般由最內(nèi)層的聚苯乙烯核、中間的磁性物質(zhì)和最外的涂覆層組成。磁性物質(zhì)一般為Fe3O4或γ-Fe2O3，比較常用的涂覆層材料為二氧化硅和聚乙烯亞胺(PEI)[21-22]。磁珠可通過氫鍵、疏水或靜電作用結(jié)合DNA[23]。如二氧化硅涂層上的羥基可與DNA上的磷酸鹽骨架通過鈉陽離子橋鍵反應(yīng)結(jié)合[4]。而且，DNA的負(fù)電荷比水中蛋白質(zhì)或腐殖質(zhì)等雜質(zhì)高，更易與磁珠二氧化硅涂層上的羥基結(jié)合。因此使用二氧化硅涂覆磁珠對水樣中DNA進(jìn)行提取更有利于雜質(zhì)的去除，提高DNA的純度[24]。此外，磁珠表面易于修飾，可以根據(jù)不同的提取需求進(jìn)行羧基和氨基的改性[25-26]。羧基修飾磁珠通過陽離子橋鍵結(jié)合DNA，氨基修飾的磁珠則被認(rèn)為主要通過靜電作用吸附DNA[27-29]。除了改性外，還可通過羧基-氨基結(jié)合或生物素-親和素結(jié)合連接引物，進(jìn)行特異性的DNA提取[23]。研究認(rèn)為，與羧基磁珠和羥基磁珠相比，氨基磁珠吸附水樣中DNA的能力更強(qiáng)[26,30]。而利用磁珠的磁性可方便有效地將吸附了DNA的磁珠從水溶液中分離，進(jìn)行后續(xù)的洗脫收集。

相對于以上提及的DNA提取方法，磁珠法具有十分顯著的優(yōu)點(diǎn)：一是以磁性顆粒作為吸附載體，對有機(jī)溶劑的使用需求較小，避免了有機(jī)試劑排放對環(huán)境造成的影響；二是微米和納米尺度的磁珠擁有較大的比表面積，且能均勻地分散到溶液中，相比于其他的固相萃取方法具有更高的DNA吸附效率；三是通過外部磁力吸引可直接分離吸附DNA的磁珠，省去了離心、沉淀和過濾等耗時較長的步驟[23]，操作簡單。但冷凍、干燥、離心和其他導(dǎo)致局部磁珠濃度過高的操作可能會造成磁珠團(tuán)聚無法再分散，降低其DNA提取效率，導(dǎo)致提取失敗。

磁珠法十分適用于水樣中eDNA的提取。Sheng等[30]發(fā)現(xiàn)氨基化的磁性介孔二氧化硅納米粒子對eDNA的吸附能力達(dá)210.22 μg·mg-1。對于污水樣品中eDNA的提取，磁珠法的提取質(zhì)量和產(chǎn)量均優(yōu)于乙醇沉淀法、CTAB法和DNA提取試劑盒(FastDNA SPIN Kit for Soil)[4]。Wen等[23]還提出了一種利用引物進(jìn)行特異性DNA吸附的磁珠法，其提取效率達(dá)80%。暫未見使用磁珠法提取eDNA研究環(huán)境水體中eARGs污染水平的報道。磁珠法在eDNA含量更低的自然水體的適用性有待于更多的研究。但磁珠法高提取效率和可改性的特性，顯示了其在自然水體eDNA研究中的可觀應(yīng)用潛力。

綜上所述，針對不同類型的環(huán)境水樣中的目標(biāo)DNA，需選擇合適的DNA提取方法。乙醇沉淀法、CTAB法和DNA提取試劑盒較適用于環(huán)境水體中總DNA及iDNA的提取，而二氧化硅固相萃取和磁珠法對eDNA的提取效果較好。若水樣中微生物含量較高，可以使用乙醇沉淀法或CTAB法對較小體積的水樣進(jìn)行處理，而DNA提取試劑盒的使用則需根據(jù)環(huán)境水樣的特征進(jìn)行選擇。二氧化硅固相萃取和磁珠法更適用于處理大體積樣品，可對微生物含量較低的水樣進(jìn)行eDNA提取。其中二氧化硅固相萃取和磁珠法在低核酸含量水樣DNA的提取方面發(fā)展前景較大。

3 特征水體中iARGs與eARGs的檢出情況與遷移傳播

通過選用有效的DNA提取方法獲得環(huán)境水樣中的iDNA及eDNA后，可使用多種分析方法分析樣品中iARGs及eARGs的污染水平及特征[31]。本文在此基礎(chǔ)上對污水系統(tǒng)、淡水系統(tǒng)及海水系統(tǒng)中iARGs與eARGs的污染水平與遷移傳播特征進(jìn)行了評述。

3.1 污水系統(tǒng)

污水處理廠是含有大量抗生素、抗生素耐藥菌(Antibiotic resistant bacteria,ARB)及ARGs的醫(yī)療、生活和生產(chǎn)廢水的集中處理地，是自然水體中ARGs的重要污染源[32]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，城市污水處理廠中iARGs和eARGs的濃度范圍分別為105～1011、107～109copies·L-1[4,33]。進(jìn)水中的iARGs含量略高于eARGs，但出水中eARGs的含量明顯高于iARGs[4]。

ARGs在污水處理廠中的遷移轉(zhuǎn)化主要體現(xiàn)在ARGs形態(tài)和含量的轉(zhuǎn)變?；钚晕勰嘀性飳RB的捕食、紫外線消毒對ARB的滅活可促使iARGs轉(zhuǎn)變?yōu)閑ARGs；eARGs對細(xì)胞的吸附和解吸造成了f-eARGs和a-eARGs的互相轉(zhuǎn)化；核酸酶降解、水解和光解可小幅降低eARGs的含量[34]；沉降池能使iARGs和a-eARGs轉(zhuǎn)移到污泥中?？傮w上，與iARGs相比，eARGs遷移到自然水體的能力更強(qiáng)。污水處理廠中ARGs的水平基因轉(zhuǎn)移也十分活躍。污水中的ARGs含量遠(yuǎn)高于自然水體[4-5]，而活性污泥中豐富的生理活動、活躍的細(xì)胞以及污水與活性污泥的充分混合，使污水系統(tǒng)成為ARGs傳播的重要場所。此外，污水系統(tǒng)中的Hg和Ag等重金屬的存在也會通過抗重金屬基因和ARGs的共選作用促進(jìn)ARGs的水平基因轉(zhuǎn)移[35]。因此，污水中的ARGs水平基因轉(zhuǎn)移發(fā)生率遠(yuǎn)高于自然水體。

3.2 淡水系統(tǒng)

淡水系統(tǒng)是污水處理廠出水的主要接收場所和重要飲用水源，河流和湖泊中ARGs的存在情況與公共安全息息相關(guān)。我國河水普遍存在ARGs污染，且所檢出的ARGs種類十分豐富[36-42]。河水中的iARGs和eARGs的豐度范圍分別為101～104、101～103copies·L-1[5]。iARGs是河水中ARGs的主要形態(tài)，占總ARGs的38.7%～97.0%；f-eARGs含量最低，僅占0.03%～30.4%[5]。湖泊是淡水水體的重要組成部分，全球液態(tài)地表淡水的90%為湖水[43]。湖水的較長更新周期和豐富的營養(yǎng)物質(zhì)使湖泊比河流更具ARGs積累潛力，其ARGs豐度約在10-6～10-2copies·16S rRNA copy-1范圍內(nèi)，其中磺胺類和四環(huán)素類ARGs是其主要類別(表1)。相比于河水，湖水環(huán)境與ARGs污染的相關(guān)研究較少。對eARGs的研究主要集中在湖泊沉積物，湖水中eARGs的研究暫未見報道。

表1 湖泊中的ARGs含量Table 1 Concentration of ARGs in lakes

ARGs在河流和湖泊中的遷移轉(zhuǎn)化主要受稀釋作用、長距離輸送、生物降解、非生物降解和吸附等機(jī)制的影響[44]。稀釋作用的大小取決于輸入水體的水量和流速[45]。相比于稀釋作用和各種ARGs損失機(jī)制，長距離輸送對ARGs在河流中的遷移影響并不大，離排污口較遠(yuǎn)的下游和排污口上游的ARGs含量差別不大[46]。紫外線輻射和原生生物捕食等會降低iARGs的濃度。脫氧核糖核酸酶導(dǎo)致的生物降解是eARGs的主要降解模式，a-eARGs比f-eARGs更能抵御核酸酶的攻擊[47]。Strickler等[48]研究發(fā)現(xiàn)，適溫、中性pH值和適度UV-B照射更有利于eARGs在淡水環(huán)境中的降解。f-eARGs可能會吸附到細(xì)胞上轉(zhuǎn)變?yōu)閍-eARGs，而f-eARGs和細(xì)菌也可能吸附到顆粒物上，隨著顆粒物的沉降進(jìn)入沉積物中。淡水環(huán)境中的ARGs含量不高，故其水平基因轉(zhuǎn)移的效率相對較低。但淡水系統(tǒng)中的常見污染物，如重金屬、農(nóng)藥和納米材料等可促進(jìn)水平基因轉(zhuǎn)移的發(fā)生。Wang等[49]研究發(fā)現(xiàn)，淡水系統(tǒng)中的Cu2+能通過對細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)胞損傷效應(yīng)促進(jìn)質(zhì)粒RP4的共軛轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)ARGs的水平基因轉(zhuǎn)移。

3.3 海水系統(tǒng)

海洋環(huán)境是水體中ARGs的最終匯入地，受人類活動影響較大的河口和近岸海域中ARGs的污染引起了人們的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，qnr基因是我國沿岸海域的主要ARGs類型，占全部檢測ARGs的50%以上[55]；tet基因占總ARGs的30.4%～60.3%[55]，sul基因也有著較高的檢出率[55-58]，而erm基因則不足總檢出ARGs的7%[55]。但也有研究發(fā)現(xiàn)我國渤海萊州灣海水中qnr基因的檢出率和濃度均較低，說明不同海域中的ARGs污染具有不同的組成特征。我國海域中總ARGs水平地區(qū)差異較大，范圍在103～1011copies·L-1，但在黃海和煙臺四十里灣均檢出過1011copies·L-1的高豐度ARGs[55-59]。

稀釋作用是ARGs在海水中遷移的主要機(jī)制，河口海域與遠(yuǎn)離大陸海域的海水中ARGs豐度近4個數(shù)量級的巨大差異證明了稀釋作用的主導(dǎo)地位[59]。與河流和湖泊相同，輸送作用對ARGs在海水中的遷移貢獻(xiàn)較小。沒有細(xì)胞保護(hù)的f-eARGs最易被核酸酶降解、光解以及水解等機(jī)制降解，在營養(yǎng)鹽含量比較豐富的河口和近岸海域，f-eDNA的更新周期小于6.5 h[60]。ARGs在海水中的水平基因轉(zhuǎn)移傳播通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合3種方式進(jìn)行。海水中eARGs發(fā)生轉(zhuǎn)化的頻率約為10-8～10-10[61]。由于海水中eDNA的濃度[61]和分子量[62-63]隨離岸距離和水深的增加而降低，故轉(zhuǎn)化頻率也隨之降低。有研究認(rèn)為，較高的鹽度會抑制eDNA與細(xì)胞的結(jié)合，因此海水中eARGs的轉(zhuǎn)化潛力可能低于淡水和河口環(huán)境[61]。海水中iARGs的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率為10-7～10-9[64]，而接合頻率約為10-7[65]。海洋病毒中ARGs的含量為0.004%～0.22%，部分病毒可攜帶多種ARGs，其中印度洋的病毒顯示出相對較高的ARGs豐度[66]。由噬菌體主導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)是海水系統(tǒng)ARGs水平基因轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制之一。

4 總結(jié)與展望

獲得高質(zhì)量的DNA是分析研究水環(huán)境中iARGs及eARGs污染情況的前提條件。水環(huán)境中ARGs的含量較低但多樣性高，因此需要開發(fā)更有效率或選擇性更強(qiáng)的DNA提取方法，才能全面分析水環(huán)境中多種iARGs及eARGs的污染特征。目前提取水樣中微生物iDNA的技術(shù)已經(jīng)較為成熟，DNA提取試劑盒是最常用的提取方法，未來可根據(jù)不同的水樣特征和目標(biāo)DNA研發(fā)更具有針對性的DNA提取試劑盒；而乙醇沉淀法也可通過共沉淀機(jī)制等改良處理進(jìn)一步提升DNA提取效率?，F(xiàn)有方法對水樣中eDNA的提取效率和提取質(zhì)量有待進(jìn)一步提升，今后的研究可以基于二氧化硅和磁珠等固相萃取方法，通過表面改性等手段，開發(fā)適用于低核酸含量水樣或選擇性更強(qiáng)的eDNA提取方法。

通常來說，受人類活動擾動越大的水環(huán)境的ARGs含量越高。除污水處理廠出水外，iARGs在各種水環(huán)境中均占主導(dǎo)地位。目前污水系統(tǒng)是亟待開展ARGs治理的場所，有必要進(jìn)一步研究不同污水處理技術(shù)對ARGs水平和傳播的影響，并開發(fā)有效降低污水ARGs水平的處理技術(shù)?，F(xiàn)有研究表明自然水體中的總ARGs水平相對較低，但還需要更多關(guān)于其eARGs含量和傳播效率的研究，從而更全面地評估ARGs的環(huán)境風(fēng)險并加強(qiáng)對其在水環(huán)境中傳播的控制。