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    基于電感耦合等離子體質(zhì)譜的腫瘤標志物檢測

    2021-07-02 09:31:56王超群
    分析測試學報 2021年6期
    關(guān)鍵詞:分析方法特異性標志物

    王超群,劉 睿,周 靜,呂 弋*

    (1.四川大學 分析測試中心,四川 成都 610064;2.四川大學 化學學院,四川 成都 610064)

    癌癥具有發(fā)病率高且生存率低的特點,是導(dǎo)致70歲之前死亡的首要原因。2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,全球估計有1 930萬例新病例和1 000萬例癌癥死亡病例[1]。除遺傳因素外,環(huán)境污染物、化學致癌物和不健康生活方式等多種因素也會導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。早期診斷和治療可以減少醫(yī)療成本,減輕患者痛苦,是提高患者治愈率最有效的途徑。因此,對惡性腫瘤的早期診斷具有重要意義。

    腫瘤標志物主要包括腫瘤細胞產(chǎn)生的分子以及與腫瘤相關(guān)正常組織產(chǎn)生的代謝和免疫產(chǎn)物[2]。在正常人體內(nèi),腫瘤標志物通常以低水平存在,當腫瘤形成、組織轉(zhuǎn)移或治療干預(yù)后其濃度會發(fā)生變化[3]。因此,腫瘤標志物的臨床分析有助于癌癥的早期診斷和治療進展監(jiān)測。結(jié)直腸癌是除肺癌外死亡率最高的癌癥,通過篩查檢測出癌癥的前體腺瘤息肉進行清除,即可預(yù)防癌癥的發(fā)生[4]。數(shù)據(jù)顯示,90年代中期,大多數(shù)高收入國家引入前列腺特異性抗原(PSA)檢測后,前列腺癌的死亡率有所下降[1]。因此,發(fā)展檢測臨床樣品(血液和血清等)中腫瘤標志物的高靈敏方法對疾病的診斷、預(yù)防與治療具有重要意義。

    目前,生物標志物的檢測方法主要包括放射免疫分析法[5]、電泳免疫法[6]、酶聯(lián)免疫吸附法[7]、熒光光譜法[8-9]、電化學法[10]和質(zhì)譜法[11]等。其中,質(zhì)譜法主要是基于穩(wěn)定同位素標記策略和電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)發(fā)展的生物分析方法[12]。ICP-MS具有分辨率高、靈敏度高、動態(tài)范圍寬(9個數(shù)量級)以及可多元素同時檢測的優(yōu)勢[13]。近二十年來,基于ICP-MS的分析方法已廣泛應(yīng)用于金屬離子[14]、核酸[15]、肽鏈[16]、蛋白質(zhì)[17-18]、酶分子[19-21]、其他小分子[22-23]以及單個細胞[24-25]的檢測?;诮饘僭仳衔?、包含金屬元素的聚合物以及金屬納米顆粒等金屬同位素標記的質(zhì)譜分析法也已被廣泛用于生物標志物的檢測[11]。本文總結(jié)了常見腫瘤標志物和相關(guān)癌癥類型,并詳細介紹了癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)和甲胎蛋白(AFP) 3種最常見的腫瘤標志物及其ICP-MS檢測方法。由于僅對一種腫瘤標志物檢測可能會導(dǎo)致假陽性結(jié)果,采用多組分檢測可有效降低假陽性率,提高診斷特異性。多組分檢測具有樣品消耗少、分析時間短、測試成本低和診斷準確性高的優(yōu)勢。因此,生物標志物的多組分檢測受到了越來越多的關(guān)注[26]。結(jié)合激光燒蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜(LA-ICP-MS)和流式細胞質(zhì)譜儀可以實現(xiàn)對單個微陣列點、細胞以及癌癥組織上多種蛋白的同時測量。本文也簡要總結(jié)了ICP-MS在多組分生物標志物同時檢測中的應(yīng)用,并對多組分分析方法構(gòu)建所面臨的挑戰(zhàn)進行了探討。

    1 基于ICP-MS檢測的生物分析方法

    質(zhì)譜方法的主要構(gòu)建機制包括以下步驟:首先以堿基互補配對、適體與目標物特異性結(jié)合及抗原抗體的特異性反應(yīng)等生物相互作用實現(xiàn)對目標物的精確識別,其次,通過修飾穩(wěn)定同位素標簽產(chǎn)生ICP-MS信號?;驹硎菍⑸镄盘栟D(zhuǎn)化為ICP-MS信號從而實現(xiàn)對目標分子的定量分析。目前,該方法所涉及的穩(wěn)定同位素標簽包括金屬元素螯合物、金屬元素的聚合物以及金屬納米顆粒等[13,27]。根據(jù)生物相互作用的不同,可以將質(zhì)譜分析方法分為免疫分析法和基于核酸的分析方法兩類。

    1.1 免疫分析方法

    免疫分析方法是基于抗原抗體的特異性結(jié)合而建立的,其分析對象主要是蛋白質(zhì)類的生物標志物[28]。1959年,放射性免疫分析方法首次被用于檢測胰島素[5],該法具有較高的特異性和靈敏度,但放射性污染阻礙了其進一步的廣泛應(yīng)用。采用穩(wěn)定同位素標簽替換放射性標簽,結(jié)合ICP-MS檢測,不僅可以成功避免放射性污染,而且具有靈敏度高、準確性高和可多組分檢測的優(yōu)勢。2001年,張新榮教授課題組[29]首次報道了以Eu的金屬螯合物(DTTA-Eu3+)為標簽的質(zhì)譜免疫分析方法,實現(xiàn)了促甲狀腺激素(TSH)的定量檢測。除金屬螯合物外,常用的標簽還有含金屬的聚合物和金屬納米顆粒等。如圖1所示,一種具有多個金屬螯合配體的水溶性聚合物標簽[30],在該聚合物的末端設(shè)計有馬來酰亞胺基團,使其可成功地與抗體上的—SH偶聯(lián)。通過改變與配體螯合的鑭系元素種類,即可獲得具有不同ICP-MS信號的標簽。每個金屬納米顆粒和含金屬聚合物標簽中都具有大量的金屬原子[31],這在很大程度上提高了檢測方法的靈敏度。金屬納米顆粒的懸浮液與離子溶液在ICP炬中具有相同的霧化效率[32],表明ICP-MS具有較好的原子化效率,能夠滿足對各種標簽的定量檢測。通常在ICP-MS采集數(shù)據(jù)之前會對待測樣品進行消解,以獲得更準確的檢測結(jié)果。

    圖1 金屬螯合聚合物標記抗體的實驗示意圖[30]Fig.1 Schematic diagram of metal chelating polymer labeling antibody experiment[30]

    1.2 基于核酸的分析方法

    基于核酸的分析方法主要可分為兩類,第一類是以適體與目標物特異性結(jié)合為基礎(chǔ)建立的方法,主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)類疾病標志物的檢測;第二類是以堿基互補配對原則為基礎(chǔ)建立的方法,主要應(yīng)用于核酸類疾病標志物的檢測。目前,已發(fā)展了大量基于核酸的分析方法用于腫瘤標志物的單組分[33-37]或多組分[38]檢測。適體是通過指數(shù)富集(SELEX)程序為目標物篩選出的人工RNA或單鏈DNA。復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)使其與目標物具有高度適配性和極高的親和力。如圖2所示,樂曉春課題組[39]分別在磁珠和金納顆粒上修飾適配體,模擬免疫反應(yīng)形成三明治結(jié)構(gòu),建立了基于適體特異性檢測凝血酶的分析方法。同理,分別將磁珠和標簽與目標物部分互補的兩段DNA鏈偶聯(lián),以堿基互補配對原則形成磁珠-目標物-標簽復(fù)合物,即可實現(xiàn)對目標鏈的定量檢測[40]。

    圖2 基于適配體的ICP-MS生物分析方法示意圖[39]Fig.2 Schematic diagram of aptamer-based ICP-MS bioassay[39]

    2 腫瘤標志物的檢測

    腫瘤標志物主要包括腫瘤細胞釋放的分子以及與腫瘤相關(guān)正常組織產(chǎn)生的代謝和免疫產(chǎn)物。腫瘤標志物可以提供癌癥種類、腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后情況等相關(guān)信息。通過非侵入式方法檢測腫瘤標志物,可減少患者痛苦,減輕醫(yī)療負擔,擴大篩查對象范圍,為癌癥的早期診斷提供有力幫助。常見的腫瘤標志物和相關(guān)的癌癥類型見表1[41]。

    表1 常見的腫瘤標志物和最相關(guān)的癌癥類型Table 1 Common tumor markers and relevant cancer types

    2.1 癌胚抗原

    癌胚抗原(CEA)是胚胎發(fā)育過程中由胃腸道細胞產(chǎn)生的一種分子量約180 kDa的糖蛋白,在健康成年人血液中的表達水平相對較低,它是一種廣譜型腫瘤標志物,濃度異常升高與大腸癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌有關(guān)。盡管它不能作為檢測早期某種惡性腫瘤的特異性標志物,但在監(jiān)測和預(yù)后方面具有重要的臨床價值,特別是通過連續(xù)CEA測量來檢測復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌[42]。

    迄今為止,已經(jīng)建立了許多基于ICP-MS檢測CEA的免疫分析方法,這些方法大多是結(jié)合穩(wěn)定同位素標簽策略構(gòu)建。為了控制元素標簽與抗體的標記效率,標記過程中會加入過量的標簽進行反應(yīng),因此必須通過分離多余的標簽來降低背景信號。胡斌教授課題組[62]通過尺寸排阻色譜(SEC)法有效地分離了過量的汞和汞標記的抗體。另外,選擇合適的基底材料,將抗體固定到磁珠[63]或微孔板[64]表面,待免疫反應(yīng)結(jié)束后采用磁分離等手段將過量標簽去除,再通過洗滌可進一步降低背景信號??紤]到分離、洗滌等步驟操作繁瑣,基于單顆粒模式ICP-MS檢測的均相免疫方法具有無需分離,操作簡單,檢測速度快的優(yōu)勢,故也被用于CEA分析。ICP-MS的單顆粒模式可以記錄由等離子體火炬中的離子閃爍引起的瞬態(tài)信號,該瞬態(tài)信號的頻率與標記在抗體上的納米粒子數(shù)量相關(guān)。如鄧必陽教授課題組[65]通過記錄ZnSe量子點電離引起的瞬態(tài)信號頻率成功測定了血清樣品中CEA濃度。單顆粒模式ICP-MS的兩種分析模式(頻率和強度)相互之間具有很好的相關(guān)性,從而為準確的免疫測定提供了一種自驗證機制[66]。同時記錄單個金納米顆粒的頻率和強度來進行自我驗證的均質(zhì)免疫測定方法,可以實現(xiàn)更準確的定量檢測。

    2.2 前列腺特異性抗原與前列腺特異性膜抗原

    前列腺特異性抗原(PSA)是一種分子量為33 kDa的糖蛋白酶[43],是前列腺癌的特異性標志物。生化復(fù)發(fā)(BCR)往往早于臨床癥狀出現(xiàn),被認為是最好的前列腺癌復(fù)發(fā)預(yù)測因子,BCR的早期檢測又取決于PSA分析的靈敏度。臨床實踐表明,監(jiān)測血清中PSA對判斷前列腺癌患者術(shù)后是否復(fù)發(fā)非常有效。因此,發(fā)展高靈敏的PSA檢測方法具有重要意義。

    近年來,納米顆粒(NPs)被廣泛應(yīng)用于生物分析領(lǐng)域,多種類型的納米顆粒也在質(zhì)譜分析中被用作標簽,包括貴金屬納米顆粒,納米團簇(NCs)和量子點(QD)等[31]。基于納米顆粒(例如TiO2NPs[67])標記的ICP-MS檢測方法也被用于PSA檢測。為進一步提高檢測方法的靈敏度,Sanz-Medel課題組[68]報道了一種基于金屬離子沉積的信號擴增方法。如圖3所示,待PSA夾心型免疫后,Mn摻雜的ZnS量子點作為成核位點,將溶液中的金離子催化還原為單質(zhì)金,檢測擴增后的納米標簽即可實現(xiàn)信號放大。與直接標記大粒徑的金屬納米顆粒相比,該方法可成功規(guī)避免疫反應(yīng)時由大粒徑引起的位阻效應(yīng)。

    圖3 基于Mn摻雜的ZnS QDs標簽結(jié)合金增強檢測PSA的原理示意圖[68]Fig.3 Schematic diagram of PSA detection based on Mn-doped ZnS QDs tag combined with gold enhancement[68]

    前列腺特異性膜抗原(PSMA)是一種細胞表面蛋白,在侵襲性前列腺癌腫瘤中高度表達[69],其水平升高與腫瘤體積增加和生存期縮短有關(guān)。王秋泉教授課題組[44]設(shè)計了一種近紅外和電感耦合等離子體質(zhì)譜雙功能探針,采用兩種模式分別成像和定量了PSMA及其剪接變體。

    圖4 基于金納米顆粒和銀納米顆粒標簽檢測總AFP和AFP-L3的原理示意圖[72]Fig.4 Schematic diagram of total AFP and AFP-L3 detection with gold nanoparticles and silver nanoparticles labeling[72]

    2.3 甲胎蛋白

    甲胎蛋白(AFP)是分子量約70 kDa的糖蛋白,在胎兒發(fā)育早期由肝臟和卵黃囊產(chǎn)生,出生后其表達水平降低。AFP濃度的升高通常與肝細胞再生、肝癌和胚胎癌有關(guān)。肝細胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一,生存率很低。在臨床上,血清中AFP的檢測可結(jié)合肝超聲檢查對高?;颊哌M行HCC篩查和診斷,監(jiān)測部分HCC患者腫瘤進展和協(xié)助腫瘤分期等[45]。

    張新榮教授課題組[70]和胡斌教授課題組[71]分別報道了基于金納米顆粒和鑭系元素摻雜的上轉(zhuǎn)換納米顆粒[71]為標簽的AFP免疫分析方法。臨床分析表明,AFP具有AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3三種亞型,血清中AFP-L1主要來自于良性肝病,AFP-L2主要來自孕婦,AFP-L3主要與HCC相關(guān),當AFP-L3占總AFP的10%以上時,肝癌的發(fā)生率大于95%。因此,對AFP-L3占總AFP的比值檢測具有重要意義。最近,本課題組[72]以膠體金納米顆粒(AuNP)和膠體銀納米顆粒(AgNP)作為標記(圖4),通過不同的識別方法同時檢測了總AFP和AFP-L3,檢出限(LOD)分別為0.1 ng·mL-1和0.2 ng·mL-1。

    3 腫瘤標志物的多組分同時檢測

    上述生物分析方法大多每次只檢測一種腫瘤標志物,但大多數(shù)腫瘤標志物不止對應(yīng)一種癌癥(如CEA與多種癌癥相關(guān)),且大多數(shù)癌癥也不止對應(yīng)一種腫瘤標志物,僅檢測一種腫瘤標志物可能會導(dǎo)致假陽性結(jié)果。采用多組分檢測可有效降低假陽性率,提高診斷特異性。與單組分檢測相比,多組分檢測具有樣品消耗少、分析時間短、測試成本低和診斷準確性高的優(yōu)勢。因此,生物標志物的多組分檢測受到了越來越多的關(guān)注[26]。

    多組分分析方法的設(shè)計需考慮兩個要素:①設(shè)計可區(qū)分的標記探針;②提高方法的靈敏度,補償因待測物增加而降低的信噪比。目前,基于不同鑭系元素或納米顆粒為標記的方法已被大量用于同時檢測多組分miRNA類[73-75]和蛋白質(zhì)類[47]腫瘤標志物。如Lobinski課題組[76]利用高分辨率尺寸排阻色譜法結(jié)合5種不同鑭系元素實現(xiàn)了對5個癌癥生物標志物(AFP、hCG、CEA、CA125和CA19-9)的檢測。本課題組[77]以3種納米顆粒(AuNP、AgNP和PtNP)為標記,采用單顆粒ICP-MS的同時檢測了3種胰腺癌標記物(CA125、CEA和CA199)。在此基礎(chǔ)上,結(jié)合激光燒蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜(LA-ICP-MS)檢測手段可實現(xiàn)在單個微陣列點[78]、蛋白質(zhì)印跡膜[79-80]、細胞[81]以及癌癥組織上[61]的蛋白質(zhì)多組分分析;結(jié)合流式細胞質(zhì)譜儀可實現(xiàn)對單個細胞上多種蛋白的同時檢測[25,82]。結(jié)合信號放大手段可進一步提高方法靈敏度,如RCA[18,83]、PCR、DNA核酶催化[84]和雙鏈特異性核酸酶擴增[38]等。張新榮教授課題組[85]將疊氮修飾的鑭系金屬螯合物與具有大量炔烴DNA支架(PCR技術(shù)合成)發(fā)生點擊反應(yīng)實現(xiàn)了信號放大,與單元素標簽相比,該方法檢出限大約降低了2個數(shù)量級。

    4 結(jié)論與展望

    ICP-MS具有分辨率高、靈敏度高、動態(tài)范圍寬以及可多元素同時檢測的優(yōu)勢。基于金屬元素螯合物、包含金屬元素的聚合物以及金屬納米顆粒等標記策略,結(jié)合ICP-MS的生物分析方法已廣泛應(yīng)用于腫瘤標記物的檢測。將其用于多組分標志物檢測,可提高疾病診斷的準確率,同時節(jié)約測量成本和減輕患者痛苦。但這些方法仍然存在一定的局限性,例如:基于鑭系元素螯合物標記的方法靈敏度低;基于金屬納米顆粒標記的方法非特異性吸附高,往往需要復(fù)雜的封閉程序來減少背景信號;多組分檢測方法還存在交叉反應(yīng)及待測物數(shù)量增加導(dǎo)致靈敏度降低的缺點。盡管如此,基于元素標記的ICP-MS檢測生物分析方法仍然具有非??捎^的發(fā)展前景,在未來我們可以:①發(fā)展基于ICP-MS檢測的新型創(chuàng)新策略;②將ICP-MS與其他技術(shù)(例如大數(shù)據(jù)分析)相結(jié)合,獲得更準確的檢測結(jié)果;③發(fā)展靈敏度更高和更可靠的定量分析方法,將實驗室研究成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用技術(shù)。

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