sICAM-1和IL-36在兒童支原體肺炎中的臨床研究

李 丹，高淑青，曲艷杰，王冬梅

(1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060;2.包頭市第四醫(yī)院)

肺炎支原體感染是社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)最常見的原因之一，占10.0 %～40.0 %[1]。肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)是兒童常見的呼吸系統(tǒng)疾病。一項(xiàng)研究表明，5歲以上兒童肺炎支原體肺炎約占CAP的70.0 %。我國北方地區(qū)肺炎患兒MPP檢出率達(dá)37.5 %[2]。MPP患兒可出現(xiàn)胸腔積液、多器官損害或嚴(yán)重的長期后遺癥。由于目前還沒有可靠和快速的診斷試驗(yàn)來檢測肺炎支原體，治療在大多數(shù)情況下是經(jīng)驗(yàn)性的。目前的實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)，包括上呼吸道咽拭子標(biāo)本的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和血清學(xué)，并不能區(qū)分肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae，MP)感染和攜帶者[3]，有研究表明攜帶MP的健康兒童可高達(dá)56.0 %[4]，因此能夠早期快速確認(rèn)MP感染者在臨床工作中至關(guān)重要。目前大多數(shù)中心仍采用恢復(fù)期和急性期IgG水平增加≥4倍來確認(rèn)MP感染，但敏感性低[5]。近年來有研究表明IL-36和sICAM-1與肺炎支原體肺炎相關(guān)[6-7]。本研究探討可溶性細(xì)胞間粘附分子-1(soluble intercellular adhesion molecule-1,sICAM-1)和白介素(interleukin-36，IL-36)在MPP表達(dá)水平及臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 選取2019年3月至2020年1月于內(nèi)蒙古包頭市第四醫(yī)院兒科住院治療并確診肺炎的66例患兒為研究對(duì)象，選取同期支氣管異物患兒16例為正常對(duì)照組。MPP組28例，男12例,女16例,年齡(5.51±1.70)歲；非MPP組38例,男20例,女18例,年齡(4.60±2.28)歲；對(duì)照組16例,男8例,女8例,年齡(4.43±1.84)歲。3個(gè)組患兒年齡,性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有入選患兒均符合第八版《諸福堂實(shí)用兒科學(xué)》社區(qū)獲得性肺炎(CAP)及MPP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。CAP的診斷要點(diǎn)：指醫(yī)院外，即社區(qū)內(nèi)獲得的病原體引起的兒童肺實(shí)質(zhì)急性感染，臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、胸痛、缺氧等感染癥狀。MPP的診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)發(fā)熱、持續(xù)劇烈咳嗽和其他呼吸道感染等臨床癥狀，肺炎，甚至胸腔積液等影像學(xué)改變，X線所見遠(yuǎn)較體征顯著；(2)白細(xì)胞數(shù)大多正常或稍增高，重癥患兒可有白細(xì)胞降低，肺炎支原體分離培養(yǎng)是金標(biāo)準(zhǔn)；(3)青霉素、頭孢類抗生素?zé)o效；(4)單次MP-IgM抗體≥1:160或恢復(fù)期和急性期雙份血清MP-IgG抗體滴度呈4倍或4倍以上增高或減低時(shí)，可診斷MP感染；(5)MP核酸檢測陽性。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合第八版《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》肺炎及MPP的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡≤14周歲；(3)病程≤15 d；(4)所有患兒均經(jīng)家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)病原診斷不明確；(2)患有肺結(jié)核、支氣管哮喘、過敏性鼻炎等其他呼吸系統(tǒng)疾?。?3)呼吸系統(tǒng)發(fā)育不良及畸形；(4)既往患有免疫性疾病以及近期或長期服用糖皮激素史；(5)近2個(gè)月內(nèi)應(yīng)用免疫球蛋白、干擾素等免疫制劑等患兒。本研究經(jīng)包頭市第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有研究對(duì)象監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 于入院第1 d或次日清晨采集患兒咽拭子標(biāo)本進(jìn)行患兒呼吸道病原基因檢測，同時(shí)采集患兒外周靜脈血進(jìn)行病原檢測(MP-IgM、MP-IgM等)。于入院后7～10 d內(nèi)患兒病情穩(wěn)定時(shí)行支氣管鏡介入治療取肺泡灌洗液標(biāo)本，正常對(duì)照組于就診當(dāng)天收集肺泡灌洗液標(biāo)本，均保存于無酶無菌的EP管中置于-80 ℃冰箱保存待測。MP及相關(guān)病原檢測均由包頭市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科提供檢測。

1.2.2肺泡灌洗液中IL-36、sICAM-1的檢測 采用ELISA法檢測所有研究對(duì)象肺泡灌洗液中sICAM-1和IL-36的水平，試劑盒由上海江萊生物有限公司提供。IL-36的檢測：(1)標(biāo)本于室溫下，離心20 min左右(2 000～3 000 r/min)，分離上清液，保存于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?2)提前20 min從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫；(3)從冰箱中取出濃縮洗滌液放置室溫，輕搖均勻，結(jié)晶完全溶解后配置洗滌液，將20 mL濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋配置成400 mL工作濃度的洗滌液，未用完的放回4 ℃的冰箱保存；(4)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度(將IL-36標(biāo)準(zhǔn)品稀釋濃度依次為：400、200、100、50、25、12.5 pg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，樣本孔中加入待測樣本50 μL；空白孔不加；(5)除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱溫育60 min；(6)棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液(350 μL)，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次；(7)每孔加入顯色劑A、B各50 μL，輕輕震蕩均勻37 ℃避光孵育15 min；(8)每孔加入終止液50 μL，由藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色，15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔的OD值。sICAM-1的檢測方法同IL-36。

2 結(jié)果

2.13組患兒肺泡灌洗液中sICAM-1及IL-36水平比較 3組患兒間肺泡灌洗液中sICAM-1表達(dá)水平比較及差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.359,P=0.000),IL-36相對(duì)表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=70.849,P=0.000)。見表1。

表1 3組患兒sICAM-1和IL-36水平比較

2.2肺泡灌洗液IL-36、sICAM-1對(duì)診斷MPP的分析 sICAM-1診斷肺炎支原體肺炎的AUC為0.818(95 %可信區(qū)間為0.703-0.902)，最佳臨界點(diǎn)為305.95 ng/mL，其敏感度為71.43 %，特異度為84.21 %。；IL-36對(duì)診斷MPP的AUC為0.875(95 %可信區(qū)間為0.770-0.944)，最佳臨界點(diǎn)為22.435 pg/mL，其敏感度為75.00 %，特異度為89.47 %。

圖1 IL-36、sICAM-1診斷MPP的ROC曲線圖

3 討論

有研究指出MPP的發(fā)病在5歲以上兒童中最為普遍[9]，其并發(fā)癥嚴(yán)重威脅患兒的生命健康，在臨床上能夠快速檢測且準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對(duì)于診治MPP至關(guān)重要。sICAM-1屬于免疫球蛋白基因家族，是一種粘附分子，可介導(dǎo)炎癥細(xì)胞的聚集和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的募集和局部病變炎癥反應(yīng)的激活[10]，主要在I型肺泡上皮細(xì)胞(Type I alveolar epithelium cell,AECs-I)中表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞之間的相互作用，增強(qiáng)慢性炎癥反應(yīng)，具有調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間黏附的作用。當(dāng)氣道上皮細(xì)胞受到病原體刺激時(shí),sICAM-1與β2整合素、淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-1(lymphocyte functional antigen-1,LFA-1)/巨噬細(xì)胞分化抗原-1(macrophage antigen-1,Mac-1)結(jié)合，參與炎癥細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及活化，使炎癥細(xì)胞向肺部的募集并粘附于內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致炎性因子釋放及炎性滲出,使氣道發(fā)生炎癥反應(yīng)[11]。杜莉等[12]研究發(fā)現(xiàn)sICAM-1在支原體肺炎患兒中升高，可作為臨床診斷、評(píng)估和治療支原體肺炎的有效指標(biāo)。IL-36是一種炎癥細(xì)胞因子，是IL-1家族的新成員。IL-36由IL-36α、IL-36β和IL-36γ三種激動(dòng)劑和IL-36受體拮抗劑(IL-36Ra)組成[13]。IL-36在支氣管上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD4+T等細(xì)胞中均有表達(dá)[14]。IL-36激動(dòng)劑與受體輔助蛋白(Interleukin-1 Receptor Accessory Protein，IL-1RAcP)結(jié)合，然后激活髓樣細(xì)胞分化蛋白88(myeloid differentiation protein，MyD88)、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(nuclear factor-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)炎癥信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[15]。潘莉等[16]研究發(fā)現(xiàn)IL-36在急性期MPP患兒中明顯增高，表明IL-36對(duì)MPP診斷具有一定臨床價(jià)值，也有研究提出IL-36是MPP的一個(gè)有用的預(yù)測因子或生物標(biāo)志物[17]。

本研究結(jié)果顯示，sICAM-1、IL-36在肺炎支原體肺炎中的表達(dá)水平高于非MPP組和健康對(duì)照組，非MPP組高于健康對(duì)照組，3個(gè)組患兒之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從IL-36、sICAM-1對(duì)于診斷肺炎支原體肺炎的ROC曲線可見，兩者對(duì)肺炎支原體肺炎具有較高的特異度及靈敏度。IL-36參與T細(xì)胞免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)生極化,其IFN-γ可增強(qiáng)IL-36對(duì)T細(xì)胞的增殖效應(yīng)。此外，IFN-γ還是一種多效性細(xì)胞因子，有研究表明sICAM-1和IFN-γ水平之間密切相關(guān)，IFN-γ可引發(fā)sICAM-1表達(dá)的增加[18]?？梢妔ICAM-1和IL-36在MPP中存在著某種共同的作用機(jī)制，MPP的炎癥反應(yīng)中兩指標(biāo)可能存在相互作用，因此同時(shí)檢測兩指標(biāo)對(duì)MPP的診斷更有意義，兩者在MPP中的共同作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，sICAM-1和IL-36對(duì)肺炎支原體肺炎具有重要的臨床價(jià)值，早期檢測sICAM-1和IL-36在MPP中的表達(dá)水平有助于MPP患兒的臨床診斷。