甲酰肽受體Fpr2在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠新生血管形成中的作用及相關(guān)機(jī)制研究△

薛盛丁 陳輝 劉爽 朱蓉嶸 王詩逸 俞瑩

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)是一種發(fā)生于早產(chǎn)兒尤其是低體質(zhì)量兒的視網(wǎng)膜血管性疾病，是嬰幼兒致盲的最主要原因。ROP的主要特征是視網(wǎng)膜新生血管的形成，其中涉及到多種視網(wǎng)膜細(xì)胞，如視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、色素上皮細(xì)胞等，并受眾多因素的調(diào)控，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。甲酰肽受體(Fpr2)屬于G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體家族，在血管內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞等均有表達(dá)，在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、血管增生中發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用。本研究利用Fpr2-/-小鼠和C57BL/6J小鼠構(gòu)建氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(OIR)模型，通過觀察各組小鼠視網(wǎng)膜中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的改變、新生血管的生成情況，進(jìn)而探討Fpr2在OIR小鼠中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本研究采用的SPF級C57BL/6J (B6)孕鼠、Fpr2-/-孕鼠均由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心飼養(yǎng)繁殖。在模型制作過程中，所有小鼠均由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心統(tǒng)一飼養(yǎng)，室溫控制在20 ℃±5 ℃。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和飼養(yǎng)均符合國家科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.1.2 材料實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國賽默飛科技公司；一抗:抗FPR2 [GM1D6] (ab26316)、抗離子化鈣結(jié)合適配分子1(IBA1) [EPR16589] (ab178847)、抗CD31 [MEC 7.46] (ab7388)、抗神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)(ab7260)、抗波形蛋白(Vimentin)(ab45939)、抗ki67(ab15580)和熒光二抗均購自美國Abcam公司；抗p-P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、抗P38 MAPK、抗細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2、抗p-ERK1/2和Western blot二抗均購自美國細(xì)胞信號技術(shù)公司。冷凍高速離心機(jī)(Eppendorf，德國)，解剖顯微鏡、光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡(Leica，德國)，RT-PCR儀(Applied Biosystems，美國)。

1.2 方法

1.2.1 OIR小鼠模型構(gòu)建分別選取Fpr2-/-孕鼠和C57BL/6J(B6)孕鼠各4只，飼養(yǎng)至產(chǎn)下新生鼠。將C57BL/6J新生鼠(12只，氧誘導(dǎo)組)和Fpr2-/-新生鼠(12只，F(xiàn)pr2-/-氧誘導(dǎo)組)在出生后的第7天和母鼠一同置于密閉氧箱，每隔2 h觀察一次，確保氧箱內(nèi)氧氣體積分?jǐn)?shù)保持在75%±5%，連續(xù)5 d，密閉氧箱中的母鼠每24 h與正常氧氣含量空氣中的母鼠更換一次，確保母鼠能提供足夠的養(yǎng)分給新生鼠。氧箱中的新生鼠在出生后第12天被移至正常氧氣含量的空氣中，連續(xù)5 d。正常對照組(C57BL/6J新生鼠12只)和Fpr2-/-組(Fpr2-/-新生鼠12只)的新生鼠和母鼠一起放置于正常氧氣含量的空氣中飼養(yǎng)。正常對照組、正常Fpr2-/-組、氧誘導(dǎo)組和Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組小鼠均于造模后第17天處死小鼠，并取出眼球備用。

1.2.2 視網(wǎng)膜鋪片免疫熒光染色造模后第17天處死小鼠并摘除眼球，PBS緩沖液漂洗后置于40 g·L-1多聚甲醛溶液中固定10 min，隨后在顯微鏡下取出完整視網(wǎng)膜組織。將取出的視網(wǎng)膜組織浸泡于用PBS配制的一抗稀釋液中，稀釋濃度為1200，4 ℃孵育過夜。次日將視網(wǎng)膜組織洗滌后放在黏附載玻片上，將完整的杯狀視網(wǎng)膜組織切成4瓣，封片，熒光顯微鏡觀察并拍照保存。采用Adobe Photoshop軟件計(jì)算各組小鼠新生血管面積與全視網(wǎng)膜面積的比值和無灌注區(qū)面積與全視網(wǎng)膜面積的比值,計(jì)算均值并分析各組間的差異。

1.2.3 冰凍切片免疫熒光染色冰凍切片復(fù)溫后用30 g·L-1BSA(含5 g·L-1TritonX-100)封閉2 h，加入一抗稀釋液(Vimentin、GFAP、IBA1、CD31、Fpr2)，稀釋濃度均為1200，4 ℃條件下孵育過夜。次日復(fù)溫洗滌后加入二抗稀釋液，稀釋濃度為1200，室溫下在暗盒中孵育2 h。洗滌后滴加稀釋的Hoechst孵育10 min,稀釋濃度為110 000，洗滌后封片，共焦顯微鏡觀察并拍照保存，分析各組小鼠視網(wǎng)膜中各指標(biāo)的差異。

1.2.4 Western blot檢測各組小鼠視網(wǎng)膜中ERK 1/2、p-ERK 1/2、P38、p-P38蛋白表達(dá)取小鼠眼球后剝離視網(wǎng)膜，加入裂解液后冰浴下超聲勻漿，收集蛋白。用BCA法測定各組小鼠視網(wǎng)膜中蛋白濃度，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后封閉3 h，加入抗ERK 1/2、抗p-ERK 1/2、抗P38、抗p-P38抗體稀釋液，稀釋濃度均為1300，4 ℃條件下孵育過夜。次日洗膜3次，室溫下用相應(yīng)的二抗稀釋液在暗盒中孵育2 h，稀釋濃度為1200，洗膜后顯影，掃描并保存。將正常對照組目的基因的表達(dá)量作為1，各標(biāo)本重復(fù)檢測3次后取其平均值。分析各組小鼠視網(wǎng)膜中ERK 1/2、p-ERK 1/2、P38、p-P38蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.5 RT-PCR檢測各組小鼠視網(wǎng)膜中炎癥因子mRNA表達(dá)RT-PCR檢測各組小鼠視網(wǎng)膜中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10) mRNA表達(dá)的變化。按照Trizol試劑盒說明書提取mRNA，使用 Easy-Script First-stand cDNA Synthesis Super Mix試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并測定濃度和純度。以cDNA為模板按照試劑盒說明書進(jìn)行反應(yīng)，收集并分析數(shù)據(jù)。mRNA的相對表達(dá)量使用公式 2-ΔΔCt×103計(jì)算。正常對照組目的基因的相對表達(dá)量作為1，各標(biāo)本重復(fù)檢測3次后取其平均值。相應(yīng)引物序列如下:IL-1β上游引物：5’-GAAGAAGAGCCCATCCTCTGT-3’，下游引物：5’-TGTTCACGGAGCCTGTAG-3’；TNF-α上游引物：5’-CTCCACTTGGTGGTTTGCTAC-3’，下游引物：5’-CTTCCCTCTCATCAGTTCTATGG-3’；IL-6上游引物：5’-ACCACTCCCAACAGACCTGTCT-3’，下游引物：5’-CAGATTGTTTTCTGCAAGTGCAT-3’;IL-10上游引物：5’-ACCTGGTACAAGTGATGCC-3’，下游引物：5’-CAAGGAGTTGTTTCCGTTA-3’;GAPDH上游引物：5’-TGAGCAAGAGAGGCCCTATC-3’，下游引物：5’-AGGCCCCTCCTGTTATTATG-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用Graph Pad Prism Version 7.00進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖，組間比較采用單因素方差分析并進(jìn)行兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Fpr2在各組小鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)冰凍切片免疫熒光染色結(jié)果顯示，在正常對照組和氧誘導(dǎo)組小鼠的視網(wǎng)膜中，F(xiàn)pr2可在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)、內(nèi)叢狀層(IPL)和外叢狀層(OPL)中表達(dá)。Fpr2和CD31雙重免疫熒光染色結(jié)果顯示(圖1)，F(xiàn)pr2在小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，與正常對照組(0.115±0.006)相比，氧誘導(dǎo)組小鼠視網(wǎng)膜中Fpr2表達(dá)(0.252±0.018)明顯增加，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.62,P<0.01)。Fpr2-/-組、Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組小鼠視網(wǎng)膜中均沒有檢測到Fpr2的表達(dá)。

圖1 各組小鼠視網(wǎng)膜組織Fpr2免疫熒光染色結(jié)果

2.2 抑制Fpr2減輕OIR小鼠視網(wǎng)膜中膠質(zhì)細(xì)胞的活化與正常對照組相比，氧誘導(dǎo)組和Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組小鼠視網(wǎng)膜中IBA1陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞均顯著增加，尤其在IPL和OPL，F(xiàn)pr2-/-氧誘導(dǎo)組小鼠視網(wǎng)膜中IBA1的表達(dá)量均低于氧誘導(dǎo)組。氧誘導(dǎo)組與正常對照組比較、Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組與正常對照組比較、Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組與氧誘導(dǎo)組比較，小鼠視網(wǎng)膜中IBA1表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.82、9.18、-2.84，均為P<0.05)(圖2)。Fpr2-/-組與正常對照組比較，IBA1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.84,P>0.05)，表明抑制Fpr2減輕了小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖(圖3A)。Vimentin作為Müller細(xì)胞的標(biāo)記物，冰凍切片免疫熒光染色結(jié)果表明，在神經(jīng)視網(wǎng)膜各層均有表達(dá)。免疫熒光染色結(jié)果表明，與正常對照組相比，氧誘導(dǎo)組和Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組小鼠視網(wǎng)膜中Vimentin表達(dá)均顯著增加，但與氧誘導(dǎo)組相比，F(xiàn)pr2-/-氧誘導(dǎo)組小鼠視網(wǎng)膜中Vimentin受到顯著抑制，氧誘導(dǎo)組與正常對照組比較、Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組與正常對照組比較、Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組與氧誘導(dǎo)組比較，小鼠視網(wǎng)膜中Vimentin表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.92、7.19、-1.86，均為P<0.05)(圖3B)。Fpr2-/-組與正常對照組比較,小鼠視網(wǎng)膜中Vimentin表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.32,P>0.05)。氧誘導(dǎo)組與正常對照組比較、Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組與正常對照組比較、Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組與氧誘導(dǎo)組比較，小鼠視網(wǎng)膜中GFAP表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.00、4.10、-4.75,均為P<0.05)(圖3C)。Fpr2-/-組與正常對照組比較,小鼠視網(wǎng)膜中GFAP表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.97,P>0.05)。

圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜中IBA1(A)、Vimentin(B)、GFAP(C)的熒光強(qiáng)度差異 與正常對照組相比，*P<0.05,與氧誘導(dǎo)組相比,#P<0.05。

圖3 各組小鼠視網(wǎng)膜中IBA1(A)、Vimentin(B)、GFAP(C)的表達(dá)情況

2.3 Fpr2對OIR小鼠視網(wǎng)膜中炎癥因子mRNA表達(dá)的影響RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，氧誘導(dǎo)組和Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組小鼠視網(wǎng)膜中的促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA相對表達(dá)量均顯著升高，而抑炎因子IL-10 mRNA的相對表達(dá)量則降低。與氧誘導(dǎo)組相比，F(xiàn)pr2-/-氧誘導(dǎo)組小鼠視網(wǎng)膜中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA相對表達(dá)量均降低，而IL-10 mRNA的相對表達(dá)量則升高。氧誘導(dǎo)組與正常對照組比較、Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組與正常對照組比較、Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組與氧誘導(dǎo)組比較，小鼠視網(wǎng)膜中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 mRNA相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(TNF-α:t=12.10、7.98、-7.90；IL-1β:t=6.71、5.39、-3.67；IL-6:t=8.38、7.17、-4.59；IL-10:t=-5.60、-4.17、1.74；均為P<0.05)(圖4)。Fpr2-/-組與正常對照組比較，小鼠視網(wǎng)膜中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 mRNA相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.83、2.97、3.45、1.29；均為P>0.05)。表明Fpr2在氧誘導(dǎo)小鼠的視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)中起著重要作用。

圖4 各組小鼠視網(wǎng)膜中IL-1β(A)、TNF-α(B)、IL-6(C)、IL-10(D)mRNA的表達(dá)情況 與正常對照組相比，*P<0.05;與氧誘導(dǎo)組相比,#P<0.05。

2.4 Fpr2對OIR小鼠視網(wǎng)膜中ERK1/2、P38信號通路的影響檢測各組小鼠視網(wǎng)膜中ERK1/2和P38蛋白的磷酸化情況,結(jié)果顯示,在氧誘導(dǎo)組和Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組，小鼠視網(wǎng)膜中ERK1/2和P38 MAPK的磷酸化水平均明顯升高，而與氧誘導(dǎo)組相比，F(xiàn)pr2-/-氧誘導(dǎo)組小鼠視網(wǎng)膜中p-ERK1/2蛋白和p-P38蛋白相對表達(dá)量下降。氧誘導(dǎo)組與正常對照組比較、Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組與正常對照組比較、Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組與氧誘導(dǎo)組比較，小鼠視網(wǎng)膜中p-ERK1/2蛋白和p-P38蛋白相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p-ERK1/2:t=7.60、6.58、-3.36；p-P38：t=8.46、5.79、-3.25；均為P<0.05)(圖5)。Fpr2-/-組與正常對照組比較，小鼠視網(wǎng)膜中p-ERK1/2和p-P38蛋白相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.21、2.35，均為P>0.05)。說明抑制Fpr2能夠抑制缺氧引起的P38蛋白和ERK1/2蛋白的磷酸化表達(dá)，從而抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

圖5 Western blot 檢測各組小鼠視網(wǎng)膜中ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白、P38蛋白、p-P38蛋白的表達(dá)情況 A、C：各蛋白電脈圖；B、D：p-ERK1/2、p-P38蛋白相對表達(dá)量。與正常對照組相比，*P<0.05;與氧誘導(dǎo)組相比，#P<0.05。

2.5 Fpr2對OIR小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成的影響用IB4對小鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行免疫熒光染色，觀察Fpr2對OIR小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成的影響，結(jié)果顯示，在造模后第17天，氧誘導(dǎo)組和Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組小鼠視網(wǎng)膜大血管呈不規(guī)則擴(kuò)張，走形迂曲，后極部可見視網(wǎng)膜有大片無灌注區(qū)，在視盤周圍出現(xiàn)毛細(xì)血管閉塞，血管分支減少，大量的視網(wǎng)膜新生血管出現(xiàn)在視網(wǎng)膜中周部。就視網(wǎng)膜血管形態(tài)而言，與氧誘導(dǎo)組相比，F(xiàn)pr2-/-氧誘導(dǎo)組小鼠的視網(wǎng)膜血管更加接近于正常對照組和Fpr2-/-組小鼠，且新生血管簇和血管閉塞區(qū)域均明顯減少。氧誘導(dǎo)組與正常對照組比較、Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組與正常對照組比較、Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組與氧誘導(dǎo)組比較，小鼠視網(wǎng)膜新生血管面積(t=7.46、 4.38、 -3.24;均為P<0.05)和無灌注區(qū)面積(t=10.14、 6.19、 -7.91;均為P<0.05)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (圖6)。Fpr2-/-組與正常對照組比較，小鼠視網(wǎng)膜新生血管面積和無灌注區(qū)面積差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.21、2.14，均為P>0.05)。

3 討論

本文第一次采用OIR小鼠模型觀察Fpr2在缺氧條件下對視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞的影響和對視網(wǎng)膜新生血管形成的作用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜的缺氧會增加Fpr2在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。與正常對照組小鼠的視網(wǎng)膜相比，氧誘導(dǎo)組和Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組小鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)大量的新生血管及無灌注區(qū)，而Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組小鼠視網(wǎng)膜新生血管面積及無灌注區(qū)的面積均顯著減少，說明Fpr2促進(jìn)了新生血管的發(fā)生發(fā)展。Fpr2是甲酰肽受體中一類重要的促炎、促血管生成的趨化因子受體，在內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞等均有表達(dá)，參與多種生物學(xué)活動(dòng)。MAPK包括ERK1/2(即P44 MAPK和P42 MAPK)和P38 MAPK等，可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞病理生理過程，如細(xì)胞的生長分化、對新環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等。研究表明，IL-1β通過ERK和JNK信號通路誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)Fpr2，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖[1]。有研究發(fā)現(xiàn)[2]，血清淀粉樣蛋白A能夠通過Fpr2促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子內(nèi)流，活化ERK和Akt信號通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管增生。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，氧誘導(dǎo)組和Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組小鼠視網(wǎng)膜中ERK1/2和P38 MAPK的磷酸化水平升高，而在Fpr2-/-氧誘導(dǎo)組小鼠視網(wǎng)膜中ERK1/2和P38 的磷酸化表達(dá)被抑制，說明抑制Fpr2能夠抑制缺氧引起的P38和ERK1/2的磷酸化表達(dá)。Fpr2的激動(dòng)劑WKYMVm在體外能通過Fpr2促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、遷移、管腔形成，從而促進(jìn)血管生成、恢復(fù)血循環(huán)[3]。Fpr2的抑制劑UPARANT能夠顯著抑制增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者中由玻璃體液所造成的血管生成[4]。

視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生發(fā)展除了與視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)外，還與多種視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞息息相關(guān)，如星形膠質(zhì)細(xì)胞、Müller細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞是血管改變的預(yù)定靶標(biāo)，并在疾病進(jìn)展期充當(dāng)血管和神經(jīng)元之間的溝通者[5]。Müller細(xì)胞能釋放多種炎癥因子，破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接。小膠質(zhì)細(xì)胞是視網(wǎng)膜的單核巨噬細(xì)胞，圍繞在視網(wǎng)膜血管的周圍，能夠敏感地感知外界微環(huán)境的變化，在視網(wǎng)膜血管發(fā)育和新生血管的形成過程中發(fā)揮了重要的作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞在離子的穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和視網(wǎng)膜內(nèi)皮屏障的完整性中起著非常重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在OIR小鼠視網(wǎng)膜上，Müller細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增加，并且這些膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增加與深神經(jīng)叢的缺失有關(guān)[6-7]。膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志是定位于視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞和視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的GFAP。缺氧會導(dǎo)致GFAP表達(dá)上調(diào)，并伴有反應(yīng)性細(xì)胞增生，而抑制了Fpr2，視網(wǎng)膜最內(nèi)層GFAP熒光強(qiáng)度降低，說明這種膠質(zhì)細(xì)胞增生反應(yīng)減弱。本研究在OIR模型視網(wǎng)膜切片中發(fā)現(xiàn)，三種膠質(zhì)細(xì)胞熒光標(biāo)志物均有明顯增高，說明視網(wǎng)膜缺氧增加了視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞的活性，抑制Fpr2則顯著抑制了這些膠質(zhì)細(xì)胞的活化，說明Fpr2可能加重促進(jìn)OIR缺血性視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的功能障礙，這與Fpr2在其他神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的作用一致。有研究表明，刺激炎癥反應(yīng)的物質(zhì)能夠提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞中Fpr2的表達(dá)和功能，進(jìn)而協(xié)調(diào)宿主促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的趨化作用和內(nèi)吞作用[8]。

炎癥因子參與了OIR的病理過程，有研究發(fā)現(xiàn)，在ROP患兒與非ROP新生兒之間，IL-1β等炎癥指標(biāo)在患兒體內(nèi)存在著顯著差異[9]。Dammann等[10]發(fā)現(xiàn)，ROP的患兒體內(nèi)IL-10、IL-1β、TNF-α的變化情況與ROP病情相關(guān)。Müller細(xì)胞是釋放炎癥因子中最重要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，有研究表明，在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中，有78個(gè)基因發(fā)生了改變，有1/3與炎癥有關(guān)[11]，而糖尿病視網(wǎng)膜病變也被認(rèn)為是一種視網(wǎng)膜缺血缺氧引起的慢性炎癥病變。在OIR小鼠的動(dòng)物模型中，炎癥不僅阻礙了視網(wǎng)膜血管化的進(jìn)程，而且加重了視網(wǎng)膜無血管區(qū)的面積及視網(wǎng)膜新生血管的數(shù)量[9]。炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 對OIR小鼠視網(wǎng)膜上新生血管的形成有著重要的促進(jìn)作用[12]。經(jīng)炎癥干預(yù)后的新生大鼠，出現(xiàn)了與ROP相似的眼底改變，如視網(wǎng)膜血管化進(jìn)程被抑制，有大片新生血管叢出現(xiàn)在視網(wǎng)膜周邊部，并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤和TNF-α、IL-1β等炎癥因子的表達(dá)量升高[13]。本研究中，抑制Fpr2顯著抑制了OIR小鼠視網(wǎng)膜炎癥因子mRNA的表達(dá)，因此，我們認(rèn)為Fpr2參與了OIR的促炎過程。

總之，F(xiàn)pr2參與了OIR的發(fā)病過程，抑制Fpr2后，視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞的活化、炎癥因子的表達(dá)和視網(wǎng)膜新生血管的形成被顯著抑制，這將為缺血性視網(wǎng)膜病變的治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。