新型冠狀病毒核酸熒光型RT-RAA檢測方法的建立及其評價

高 越，劉伯玉，任翠平，高 勇，朱 禹，楊 莉，溫 萌，錢 振，蘆寶靜，柳 燕

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 19，COVID-19)是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)引起的急性傳染病。此次疫情在全球范圍內(nèi)快速蔓延，WHO已將其認定為國際公共衛(wèi)生緊急事件。冠狀病毒(coronavirus，CoVs)是一種有包膜的單鏈正鏈RNA病毒，隸屬于冠狀病毒科。病毒基因組中16個非結(jié)構蛋白由5′端的開放閱讀框架(ORF)1a/b編碼，而結(jié)構蛋白包括刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)則由3′端的其他ORF編碼。由于潛伏期長，感染者的早期癥狀無特異性，且存在無癥狀感染者，極易造成漏診或誤診，因此，建立更便捷、快速的分子檢測方法，為臨床提供精準診斷具有重要意義。

該研究建立的反轉(zhuǎn)錄重組酶介導核酸擴增(reverse transcription recombinase aided amplification，RT-RAA)技術是一種等溫快速擴增檢測方法，通過是選擇SARS-CoV-2的

S

基因和

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基因，設計特異性等溫擴增引物和探針，建立了SARS-CoV-2快速診斷的分子檢測方法，并進行初步評價。

1 材料與方法

1.1 材料

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樣本 收集2020年1月20日—2月28日的臨床確診感染SARS-CoV-2患者咽拭子標本30例來自于項目合作單位安徽省阜陽市第二人民醫(yī)院，COVID-19的診斷依據(jù)是中國國家衛(wèi)生委員會發(fā)布的新的《冠狀病毒肺炎防治方案(第五版)》；另外臨床呼吸道感染咽拭子標本30份為2019年底前本實驗室收集，經(jīng)核酸檢測分別包括H9N2(3例)、H7N9(2例)、H3N2(5例)、H1N1(6例)、B型流感(6例)、RSV(3例)、RV(5例)。納入研究的所有患者都知情同意，經(jīng)安徽醫(yī)科大學人類生物倫理學委員會批準，批準號為2020H015。

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主要儀器及試劑 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒RiboMAXLarge Scale RNA Production System-T7(美國Promega公司，貨號：P1300)；二級生物安全柜、GENCHECK-1熒光檢測儀(杭州眾測生物科技公司)；實時熒光定量 PCR 儀(美國Bio-Rad公司，型號：CF-X96TM)；RNA核酸提取RNeasy Mini Kit (德國QIAGEN公司，貨號：74106)；磁珠核酸提取試劑(江蘇泰州碩世生物科技有限公司，貨號：SDK60104)；全自動核酸提取儀(蘇州華益美生物科技有限公司，型號：SLAD14800)；新型冠狀病毒 2019-nCoV 核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)(上海伯杰醫(yī)療科技有限公司，貨號：ZC-HX-201-2)；重組質(zhì)粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；質(zhì)粒提取試劑盒(美國AXYGEN公司，貨號：AP-MN-250)；RT-RAA核酸擴增試劑盒熒光型(杭州眾測生物科技有限公司，貨號：S004ZC)。

1.2 方法

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1

引物探針設計及篩選 從GenBank數(shù)據(jù)庫下載SARS-CoV-2病毒全序列，通過Bioedit (v7.0.9.0)軟件進行多重序列比對，根據(jù)對比結(jié)果找出具有高同源性的保守區(qū)域，最終選擇SARS-CoV-2保守性較高的

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基因和

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基因作為靶基因，并與其他冠狀病毒序列進行比較，將GenBank登錄號為MN908947.3的SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1基因組序列作為引物、探針設計的候選序列，用Oligo (v7.56)軟件進行探針和引物設計。依據(jù)恒溫快速擴增技術設計原則對兩個靶基因分別設計上、下游引物各 3條，以及4條探針進行第一輪篩選，為進一步提高其擴增效率，依據(jù)引物篩選策略，在第一輪篩選結(jié)果的基礎上將待選引物堿基位置及數(shù)量做進一步調(diào)整。經(jīng)補充設計

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基因4條上游引物和4條下游引物,

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基因2條上游引物和2條下游引物進行第二輪篩選，確定可良好工作的引物和探針。見表1。

表1 SARS-CoV-2引物和探針序列

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探針修飾 探針的修飾方法包括：熒光標記基團為FAM，熒光淬滅基團為 BHQ1。

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基因的探針熒光報告基團修飾在探針序列距5′端堿基數(shù)31 bp 的位置上；熒光淬滅基團修飾在探針序列距 3′端堿基數(shù) 13 bp 的位置上，熒光報告基團與淬滅基團之間間隔 4 個堿基(TTGA)，其中第2個堿基T用四氫呋喃殘基替換,序列尾部加上C3 spacer修飾。

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基因的探針中熒光報告基團修飾在探針序列距5′端堿基數(shù)31 bp 的位置上，熒光淬滅基團修飾在探針序列距 3′端堿基數(shù) 14 bp 的位置上，熒光報告基團與淬滅基團之間間隔3個堿基(GGG)，其中第2個堿基G用四氫呋喃殘基替換,序列尾部加上C3修飾，經(jīng)過修飾的探針如表2所示。

表2 SARS-CoV-2修飾探針序列

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3

體外轉(zhuǎn)錄RNA 針對SARS-CoV-2的

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基因和

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基因分別設計一對帶有T7啟動子的引物，其序列如表3所示，利用表中引物分別對含有相應

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基因和

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基因序列的質(zhì)粒進行PCR擴增，采用RiboMAXLarge Scale RNA Production System-T7試劑盒對SARS-CoV-2進行體外轉(zhuǎn)錄，分別獲得

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基因和

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基因的 RNA 模板，采用 Nanodrop 2000分光光度計測量純化后RNA產(chǎn)物的質(zhì)量濃度，計算出

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基因

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基因的濃度為3.68×10、4.02×10拷貝數(shù)/μl。

表3 質(zhì)粒PCR擴增引物序列

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4

Real-time PCR檢測SARS-CoV-2 采用磁珠核酸提取試劑盒提取樣本核酸，將提取的核酸模板液20 μl轉(zhuǎn)移至已分裝擴增混合液的PCR反應管中，蓋上管蓋，混勻，離心后放入多通道核酸檢測儀。根據(jù)試劑說明書,用FAM通道檢測

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基因，HEX/VIC通道檢測N基因，ROX通道檢測內(nèi)參基因；陽性和陰性的判斷標準參照試劑盒說明書，在內(nèi)參基因Ct值≤38的情況下：①兩種基因Ct值均≤38，樣本為陽性； ②兩種基因均無Ct值或Ct值>38，樣本為陰性； ③單個基因為陽性時，為可疑標本。

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5

RT

-

RAA反應體系的建立及優(yōu)化 商品化熒光RAA試劑盒包含A、B緩沖液。每反應管總體積為50 μl， RT-RAA等溫擴增試劑的反應體系如表4所示。

表4 RT-RAA反應體系

如上配置好反應體系后，蓋上管蓋，上下顛倒充分混勻5～6次，低速離心10 s，將檢測單元管放入恒溫擴增熒光檢測儀，選用經(jīng)過優(yōu)化的RT-RAA程序:40.5 ℃，每 30 s讀取一次熒光值，循環(huán)40次，共20 min。啟動儀器。陽性和陰性的判斷標準：陽性結(jié)果一般以顯示典型的擴增曲線判定，陰性結(jié)果和對照一般顯示為水平直線(即未采集到熒光信號)或輕微斜線。

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6

靈敏性檢測 將SARS-CoV-2體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋為10、10、10、10、1 拷貝數(shù)/μl共5個濃度梯度，并使用無核酸酶的水作為陰性對照，用已優(yōu)化好的反應體系進行等溫擴增，測試方法的靈敏度。

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2

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7

特異性檢測 將COVID-19疫情之前，經(jīng)核酸檢測驗證為其他呼吸道病毒感染的流感的30例咽拭子標本提取RNA，分別將

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基因和

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基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA 模板作為陽性對照，使用無核酸酶的水作為陰性空白對照，對 RT-RAA等溫快速擴增技術進行特異性評價，通過收集熒光信號判斷其他病毒是否有擴增。

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2

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重復性檢測 用已優(yōu)化好的反應體系分別將

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基因引物和

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基因引物的最低檢出限2 拷貝數(shù)/反應管的SARS-CoV-2體外轉(zhuǎn)錄RNA模板進行3次重復實驗，并使用無核酸酶的水作為陰性對照，測試該方法的重復性。

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臨床標本驗證 提取本次研究檢測的60例臨床樣本中RNA，用建立的RT-RAA等溫快速擴增方法對臨床標本進行檢測，并與Real-time PCR的檢測結(jié)果進行比較，計算Kappa值(采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件)，分析兩種檢測方法檢測結(jié)果的一致性，并計算出各引物的陽性符合率和陰性符合率，以此判斷本研究建立的SARS-CoV-2 RT-RAA方法的臨床檢測效果。

1

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3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，兩組間的一致性比較采用Kappa檢驗，α=0.05檢驗水準下，Kappa值越接近1，說明兩組間的一致性越好。

2 結(jié)果

2.1 SARS-CoV-2 RT-RAA方法的建立及優(yōu)化

本研究根據(jù)

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和

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基因設計多對引物和探針，為了確定最合適的引物、探針和反應溫度，分別對

S

基因和

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基因的引物和探針進行了一系列的排列組合，并用濃度為10拷貝數(shù)/μl的體外轉(zhuǎn)錄的SARS-CoV-2 RNA模板在39～42 ℃之間做溫度梯度探索，結(jié)果顯示在40.5 ℃時，表1所列的引物探針能在最短的時間熒光強度達到最高，因此確定本研究建立的RAA方法的最佳反應溫度為40.5 ℃。RAA熒光法最佳反應條件為40.9 μl A緩沖液、上游引物、下游引物(10 μmol/L)各2 μl，0.6 μl探針(10 μmol/L)，2 μl模板至47.5 μl，最后向檢測單元管蓋上加入2.5 μl的B緩沖液,并混勻。

2.2 RT-RAA方法的靈敏性

對于所稀釋的各濃度的體外轉(zhuǎn)錄RNA，其

S

基因和

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基因均可檢出，且2種基因的最低檢出限均可達到2 拷貝數(shù)/反應管。

S

基因檢出最低檢測線的用時為11 min,

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基因檢出最低檢測線的用時為9 min。見圖1。以上表明，本研究建立的RT-RAA 檢測方法靈敏性好，且檢測速度快。

圖1 RT-RAA等溫擴增技術靈敏性檢測A：S基因；B：orf1ab基因

2.3 RT-RAA方法的特異性

僅有SARS-CoV-2陽性對照有擴增曲線，為陽性，其他病毒及陰性對照均無擴增，顯示本研究建立的RT-RAA等溫擴增技術具有良好的特異性。見圖2。

圖2 RT-RAA等溫擴增技術特異性評價A:S基因；B:orf1ab基因

2.4 RT-RAA方法的重復性

S

基因引物和

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基因引物的SARS-CoV-2體外轉(zhuǎn)錄RNA模板進行3次重復實驗的結(jié)果如圖3所示，結(jié)果顯示2種引物擴增反應起峰時間一致，曲線形態(tài)接近，陰性對照無擴增，具有良好的重復性。

圖3 RT-RAA等溫擴增技術重復性評價A：S基因；B:orf1ab基因

2.5 RT-RAA方法檢測臨床標本的符合率

本次研究檢測的共60例臨床樣本，結(jié)果如表5與表6所示。與Real-time PCR結(jié)果相比，

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基因的陽性總符合率為96.66%,陰性總符合率為100%;

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基因的陽性總符合率為100%，陰性總符合率為100%。經(jīng)SPSS13.0軟件進行Kappa檢驗，

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基因的Kappa值為 0.967，

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基因的Kappa值為1，提示本研究建立的RT-RAA等溫快速擴增技術與Real-time PCR檢測結(jié)果的一致性極好，兩種引物均有較好的臨床檢測效果。

表5 RT-RAA等溫擴增技術檢測臨床標本S基因結(jié)果驗證情況

表6 RT-RAA等溫擴增技術檢測臨床標本orf1ab基因結(jié)果驗證

3 討論

SARS-CoV-2疫情的爆發(fā)對國際衛(wèi)生構成重大威脅。當前全球六大洲、200多個國家和地區(qū)受到新型冠狀病毒肺炎疫情不同程度的影響。目前，尚未有針對該病毒的特異治療方法且相關疫苗正在研發(fā)中。因此，建立一種針對SARS-CoV-2的現(xiàn)場便攜式快速檢測方法，彌補一些昂貴的檢測設備帶來的檢測能力不足的缺陷，對SARS-CoV-2的防控具有重大價值。

該病毒最初是通過RT-PCR和咽拭子測序確認。后來，檢測SARS-CoV-2的Real-time PCR方法迅速建立，并在國內(nèi)外得到廣泛應用。但該方法需要昂貴的實驗儀器，且大多數(shù)的Real-time PCR試劑盒的靈敏度較低(10拷貝數(shù)/μl)，有報道稱患者出院后一段時間又出現(xiàn)核酸復檢陽性，這可能由多種原因造成，如患者出院時核酸濃度未達到Real-time PCR檢出限導致陰性誤判、標本采集及運輸過程的不規(guī)范操作、擴增儀孔內(nèi)溫度差異、核酸提取過程中的損耗等影響檢測結(jié)果。因此，需要現(xiàn)場開展更高的核酸靈敏度檢測以有效解決上述問題帶來的不利影響。

已有報道建立了RPA擴增方法用于檢測新型冠狀病毒的特異性

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基因以及

N

基因。但目前國內(nèi)使用的RPA試劑均需進口，經(jīng)濟成本高、不穩(wěn)定等因素多，而RAA技術是一種具有我國自主知識產(chǎn)權的等溫核酸擴增技術，不受國外專利限制，且試劑成本低廉，不需昂貴的儀器。并且，相對于RPA使用的噬菌體T4uvsX重組酶，RAA使用的細菌或真菌中獲得的重組酶不僅來源更為廣泛，而且在37 ℃恒溫下便可與引物緊密結(jié)合形成酶-引物聚合體，反應的溫度適應性更強。本研究建立的RT-RAA 檢測方法通過熒光探針實現(xiàn)檢測，以

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基因和

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基因作為靶標，通過對反應體系的優(yōu)化，對于SARS-CoV-2 RNA的模板，其兩種引物均可穩(wěn)定檢出,靈敏性達到2拷貝數(shù)/反應管，且重復性較好。同時與其他相關病毒無交叉反應，特異性好，與Real-time PCR方法相比，臨床樣本

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、

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基因的陽性符合率為96%、100%，陰性符合率為100%；通過Kappa檢驗表明與Real-time PCR檢測結(jié)果有較好的一致性。

S

基因的陽性符合率沒有達到100%，其靈敏度未達到理論值的1拷貝數(shù)/μl,可能是由于該研究所用的體外轉(zhuǎn)錄RNA中的RNA純度較高，因此未能完全模擬出對于Real-time PCR檢出33該研究建立的RT-RAA等溫擴增的檢測時間可控制在20 min以內(nèi)且無需復雜的變溫裝置和專業(yè)的技術人員指導，可發(fā)展為一種適用于現(xiàn)場的快速高效的SARS-CoV-2核酸檢測方法，具有一定的應用場景和實用價值，利于相關檢測機構推廣使用。

安徽醫(yī)科大學學報2021年6期

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