紅霉素軟膏微生物限度試驗方法的驗證

劉玲 薛建國

摘 要 目的：建立紅霉素軟膏的微生物限度檢查方法。方法：用3個批號的紅霉素軟膏進行微生物限度試驗的驗證，確定適合紅霉素軟膏的微生物限度檢查方法。結(jié)果：所采用的方法能有效消除紅霉素的抑菌成分，使實驗結(jié)果能真實反映產(chǎn)品微生物污染的情況。結(jié)論：可采用薄膜過濾法對紅霉素軟膏進行微生物限度試驗。

關(guān)鍵詞 紅霉素軟膏 微生物限度 薄膜過濾法

中圖分類號：R986； R927.1 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2021）07-0078-03

Verification of microbial limit test method for erythromycin ointment

LIU Ling1*， XUE Jianguo2

（1. Xinyang Institute for Food and Drug Control， Henan Xinyang 464000， China； 2. Xinyang Food Supervision Office， Henan Xinyang 464000， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for microbial limit test in erythromycin ointment. Methods： According to the microbial limit standard of the test product， the verification test was conducted with three batches of erythromycin ointment to investigate the test method for determining microbial limit of erythromycin ointment. Results： The method used could effectively remove the bacteriostatic components in erythromycin ointment， so that the experimental results could truly reflect the situation of contaminated bacteria. Conclusion： The microbial limit of erythromycin ointment can be examined by membrane filtration.

KEy WORDS erythromycin ointment； microbial limit； membrane filtration

紅霉素軟膏為白色至黃色軟膏，為皮膚科用藥類非處方藥。本品每克含主要成分紅霉素1萬單位[1]。用于膿皰瘡等化膿性皮膚病、小面積燒傷、潰瘍面的感染和尋常痤瘡。微生物限度檢查是評價非終端滅菌制劑受微生物污染程度的有效方法[2]，是藥品安全性檢查的重要項目[3]。根據(jù)中華人民共和國藥典2015年版四部要求，供試品檢查時，應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇合適的方法檢查，所選方法須經(jīng)驗證[4]，為此，作者對紅霉素軟膏的微生物限度檢查方法進行了驗證試驗。

1 材料與方法

1.1 儀器

BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；250B 型數(shù)顯生化培養(yǎng)箱（江蘇金壇榮華儀器制造有限公司）；LRH-250型智能生化培養(yǎng)箱（鄭州生元儀器有限公司）；SPX-150型生化培養(yǎng)箱（揚州惠科電子有限公司）；Htysteritest 601集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）。

1.2 樣品及集菌器

紅霉素軟膏（批號：170301、160412、161102，新鄉(xiāng)華青藥業(yè)有限公司）；FY220一次性使用集菌過濾培養(yǎng)器（生產(chǎn)批號：FY2181108，濾膜孔徑0.45 μm，溫州維科生物實驗設(shè)備有限公司）。

1.3 培養(yǎng)基及稀釋液

pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中（TSB）、沙氏葡萄糖液體（SDB）培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基，均購自北京三藥科技開發(fā)公司，他們均通過培養(yǎng)基適用性檢查。0.9%無菌氯化鈉溶液（NS），由信合援生制藥股份有限公司提供。

1.4 菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、白色假絲酵母（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，均來源于中國食品藥品檢定研究院。

1.5 試驗菌液的制備

按照《中華人民共和國藥典2015年版四部》通則1105要求制備[4]。

1.6 供試液的制備

從4支軟膏中取樣品10 g，置含無菌玻璃珠的輸液瓶中，加入20 ml無菌十四烷酸異丙酯，振搖使溶解。再加入45 ℃ pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml，振搖10 min，靜置，取下面水層作為1∶10的供試液。

1.7 需氧菌總數(shù)計數(shù)法的驗證

1）試驗組[4-7] 取1∶10的供試液2 ml，加入適量的NS中，混勻，過濾，用NS沖洗，每次沖洗量100 ml，總沖洗量：900 ml/膜，在最后一次沖洗液中分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌懸液各2 ml，濾干，立即貼膜于TSA平板上。

2）供試品對照組 取上述制備好的供試液，以稀釋液代替菌液，同試驗組操作，測定供試品本底菌數(shù)。

3）菌液對照組 取相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。

用于細(xì)菌檢測的平皿于35 ℃培養(yǎng)3～5 d，逐日觀察結(jié)果。

1.8 霉菌和酵母總數(shù)計數(shù)法的驗證

驗證方法[4-7]同需氧菌總數(shù)計數(shù)法的驗證，總沖洗量為：500 ml/膜。貼膜于SDA平板上，于25 ℃培養(yǎng)5～7 d，逐日觀察結(jié)果。

1.9 控制菌檢查方法的驗證

1）試驗組[8] 取1∶10供試液20 ml，加入100 ml NS中，濾過，再用NS沖洗3次，每次100 ml，在最后一次沖洗液中加入50～100 cfu的金黃色葡萄球菌（或銅綠假單胞菌），濾過后，灌注100 ml的TSB，32 ℃培養(yǎng)18～24 h后，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基）的平板上，按照金黃色葡萄球菌（或銅綠假單胞菌）的檢查方法進行檢查。

2）陽性對照組 取相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液，平板上應(yīng)有控制菌典型菌落生長。

3）供試品對照組 取上述制備好的供試液，以稀釋液代替菌液，同試驗組操作。

4）陰性對照組 以相應(yīng)稀釋液替代菌液和供試液，同試驗組操作。

培養(yǎng)物于35 ℃培養(yǎng)至規(guī)定時間，逐日觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 需氧菌、酵母和霉菌總數(shù)計數(shù)法的驗證

各需氧菌、酵母和霉菌的加菌回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)（表1～2），表明采用薄膜過濾法，能有效地消除紅霉素軟膏對這些試驗微生物菌株的抑制作用。

2.2 控制菌檢查方法適用性試驗

按照驗證方案的要求進行試驗，發(fā)現(xiàn)試驗組與陽性對照組均檢出金黃色葡萄球菌的（或銅綠假單胞菌）典型陽性菌落，陰性對照組未見菌生長（表3），則可確認(rèn)本法適用于金黃色葡萄球菌的（或銅綠假單胞菌）檢查。紅霉素軟膏可照此驗證過的供試液制備方法及金黃色葡萄球菌的（或銅綠假單胞菌）檢查方法進行檢查。

驗證過程中若存在和發(fā)現(xiàn)任何的偏差和漏項，都應(yīng)詳細(xì)記錄，并按規(guī)定進行調(diào)查和處理。

3 討論

藥品檢驗是目前保證藥物質(zhì)量和安全性的一個有效手段，其中，藥品的微生物檢驗和控制是藥品安全性保障的一項重要措施[9]。紅霉素具有很強的抑菌效果，為了消除其抑菌作用，筆者按照中國藥典2015年版四部要求，采取先用十四烷酸異丙酯充分溶解樣品，然后再用萃取、多次沖洗的辦法才能有效地消除其抑菌作用，而不影響樣品中微生物污染的檢測。

根據(jù)樣品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)均為100 cfu/g）以及供試液的稀釋倍數(shù)及沖洗量較大，供試液的取樣量可以適當(dāng)加大倍數(shù)，以免產(chǎn)生誤差過大。

供試液制備時，樣品中加入20 ml無菌十四烷酸異丙酯后，應(yīng)當(dāng)充分振搖使溶解。再加入45 ℃ pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml后，振搖時幅度不要太大，否則會乳化，難分層。

參考文獻

[1] 胡昌勤， 劉煒. 抗生素微生物檢定法及其標(biāo)準(zhǔn)操作[M]. 北京： 氣象出版社， 2004： 27-36.

[2] 李玉芹. 淺談目前無菌檢查和微生物限度檢查存在的問題[J]. 中國藥事， 2007， 21（12）： 1011-1012.

[3] 許華玉， 杜鵑， 湯楊. 藥品中微生物污染檢測方法驗證的必要性[J]. 中國藥品標(biāo)準(zhǔn)， 2005， 6（4）： 46-48.

[4] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2015年版四部[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2015： 140-151.

[5] 中國藥品生物制品檢定所. 中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010： 1-65.

[6] 楊曉莉， 李輝， 馬英英， 等. 中國藥典2015 年版非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查： 微生物計數(shù)法解讀[J]. 藥物分析雜志， 2016， 36（6）： 1101-1107.

[7] 國家藥典委員會. 中國藥典分析檢測技術(shù)指南[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社， 2015： 564-573.

[8] 楊曉莉， 李輝， 馬英英. 中華人民共和國藥典2015 年版非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查： 控制菌檢查法解讀與對策法解讀[J]. 中國藥師， 2016， 19（4）： 748-752.

[9] 胡昌勤. 藥品微生物控制現(xiàn)狀與展望[J]. 中國藥學(xué)雜志， 2015， 50（20） ： 1747-1751.