生酮飲食對小鼠骨骼肌力量及運動耐力的影響

袁瑞 李帆 胡桂霖 孫曉明 舒秋嬡 李卓群 弓浩宇 胡浩

1 西安交通大學醫(yī)學部2016級侯宗濂實驗班（西安710061）2 西安交通大學醫(yī)學部基礎(chǔ)醫(yī)學實驗教學中心（西安710061）

1921年Wilder首先提出“生酮飲食”(高脂肪、低碳水化合物飲食)用以治療兒童難治性癲癇[1]。20 世紀70年代，由于這種飲食方法減少體重而被廣泛知曉，其中最為著名的就是“阿特金斯飲食法”，其控制體重的有效性已被大量研究所證實[2，3]。近些年來，生酮飲食被廣泛應用于涉及體重級別的體育運動項目(如柔道、摔跤等)，許多運動員希望能通過這種飲食方法在短時間內(nèi)迅速減輕體重，從而獲得更好的運動成績。有研究顯示[4，5]，一段時間的生酮飲食能夠改變機體利用能量的方式，從以利用碳水化合物為中心轉(zhuǎn)變?yōu)槔弥井a(chǎn)能為主，即“脂肪適應”。但有多項人體干預實驗顯示，受試者在接受生酮飲食后出現(xiàn)體能下降、疲勞等不良癥狀[4，5]。生酮飲食作為一種特殊的飲食模式，是否會影響機體骨骼肌力量及運動耐力，目前仍沒有明確的研究報道。本研究分別以生酮飼料和標準飼料喂養(yǎng)小鼠4 周，觀察并測定小鼠運動耐力以及腓腸肌力量，以探究生酮飲食對骨骼肌力量及運動耐力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性ICR小鼠20只，體重18～22 g，購于西安交通大學實驗動物中心。生酮飼料(D12358)購于北京博泰宏達生物有限公司，標準飼料(D12450B)購于西安交通大學實驗動物中心。血酮儀購于美國雅培公司，血糖儀購于三諾生物傳感股份有限公司，BL-420F生物信號采集與處理系統(tǒng)購于成都泰盟軟件有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。

表1 生酮飼料與標準飼料的營養(yǎng)成分

1.2 動物分組及喂養(yǎng)

適應性喂養(yǎng)1 周后，小鼠隨機分為標準飲食(standard diet，SD)組和生酮飲食(ketogenic diet，KD)組，每組10 只。所有動物單籠喂養(yǎng)，自由飲水，每天記錄體重和進食量。SD 組動物自由進食標準飼料，KD 組根據(jù)SD 組前24 h 內(nèi)進食量的平均值給予等能量的生酮飼料，共喂養(yǎng)4周。

1.3 血糖和血酮的測定

生酮飲食4 周后，小鼠尾靜脈采血，檢測血糖、血酮水平。負重游泳前以及負重游泳后3 min 內(nèi)檢測小鼠血糖、血酮水平。

1.4 負重游泳實驗

實驗第4 周末，小鼠進行負重游泳實驗。將均質(zhì)鐵環(huán)負于離鼠尾尖2 cm 處，有效負重為體重的10%(已扣除鐵環(huán)產(chǎn)生的浮力)。將小鼠從離水面30 cm處，頭朝下釋放入水中，水深50 cm，水槽四壁光滑，水溫控制在25℃± 1℃。觀察小鼠游泳情況，記錄小鼠從釋放到沉入水中5 s內(nèi)不能浮出水面的時間。

1.5 在體腓腸肌收縮實驗

動物手術(shù)：動物飼養(yǎng)4 周后，待血糖、血酮測定及負重游泳實驗結(jié)束后，次日對小鼠進行麻醉，俯臥位固定于手術(shù)板上，剃去后肢及軀干后背部的毛，剪開皮膚，游離右側(cè)腓腸肌，跟腱處用手術(shù)線結(jié)扎后離斷。分離坐骨神經(jīng)并切斷脛神經(jīng)外的其他分支。將腓腸肌結(jié)扎線與張力換能器相連，并給予4 g前負荷。

單收縮和強直收縮最大收縮幅度：將刺激電極與坐骨神經(jīng)干接觸。選擇刺激參數(shù)：波寬0.2 ms，延遲0.05 ms，從0.2 V開始尋找閾刺激強度，逐步增加刺激強度至引起單收縮最大幅度的最小刺激強度(Umin)。在2Umin(最小刺激強度的2倍)條件下觀察并記錄腓腸肌單收縮的最大收縮幅度。在2Umin的條件下，從30 Hz開始連續(xù)刺激，尋找引起完全強直收縮的最小頻率，在最小頻率下刺激坐骨神經(jīng)，觀察并記錄肌肉完全強直收縮的最大收縮幅度。

連續(xù)串刺激至最大收縮幅度后下降至最大幅度50%所用時間(T50)：在2Umin的條件下，以2 Hz 的頻率給予坐骨神經(jīng)連續(xù)單刺激，觀察并記錄T50。

1.6 腓腸肌質(zhì)量和總蛋白含量測定

在體腓腸肌收縮實驗后處死小鼠，取右側(cè)腓腸肌稱重。準確稱取0.02 g腓腸肌肌肉組織，加入300 μL裂解液，制成組織勻漿，12000 rpm/min，4℃下離心20 min，取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0進行數(shù)據(jù)處理，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準誤(Mean±SEM)表示。兩組小鼠體重、血酮水平、血糖水平、負重游泳時間、腓腸肌單收縮和強直收縮的最大收縮幅度、腓腸肌質(zhì)量和總蛋白含量的比較采用獨立樣本t檢驗。T50比較采用Mann-WhitneyU檢驗。負重游泳前后血糖、血酮水平比較采用配對樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 生酮飲食對小鼠體重的影響

實驗過程中，兩組小鼠對飼料的接受程度良好，未出現(xiàn)明顯異常。小鼠體重變化趨勢如表2所示，分組喂養(yǎng)前小鼠體重無顯著性差異(t=0.438，P=0.667)，但從第3 周開始，生酮飲食組小鼠的體重顯著低于標準飲食組(t=2.445，P=0.024＜0.05)。這提示在等能量飼養(yǎng)的情況下，生酮飲食可降低小鼠體重。

表2 兩組小鼠體重比較(g)

2.2 生酮飲食對小鼠血糖和血酮水平的影響

如表3所示，分組喂養(yǎng)4 周后，兩組小鼠的血糖水平無顯著性差異(t=0.674，P=0.509)。而生酮飲食組的血酮水平顯著高于標準飲食組(t=4.674，P=0.001＜0.05)，提示生酮飲食升高小鼠血酮水平，但對血糖水平無顯著影響。

表3 兩組小鼠血糖和血酮水平比較

2.3 生酮飲食對小鼠負重游泳時間的影響

如表4所示，兩組小鼠負重游泳時間無顯著差異(t=0.424，P=0.676＞0.05)，且表5顯示，兩組小鼠負重游泳前后，血糖水平均無顯著變化(標準飲食組：t=1.071，P=0.312＞0.05；生酮飲食組：t=0.897，P=0.393＞0.05)，提示生酮飲食對小鼠的運動耐力無顯著影響，運動前后血糖水平始終維持在相對穩(wěn)定的狀態(tài)。標準飲食組小鼠負重游泳后血酮水平高于游泳前(t=2.631，P=0.027＜0.05)，提示標準飲食組小鼠運動前酮體較少參與供能，運動促進了酮體的生成和機體對酮體的利用；而生酮飲食組負重游泳后血酮水平無明顯變化(t=0.432，P=0.676＞0.05)，提示酮體可能在運動前后均為生酮飲食組小鼠的主要供能物質(zhì)。以上結(jié)果說明生酮飲食改變了小鼠對能量物質(zhì)的利用方式或代謝方式。

表4 兩組小鼠負重游泳時間比較

表5 生酮飲食對小鼠負重游泳的影響

2.4 生酮飲食對小鼠在體腓腸肌收縮的影響

如表6所示，兩組小鼠腓腸肌單收縮和強直收縮最大收縮幅度均無顯著差異(單收縮：t=1.999，P=0.061＞0.05；強直收縮：t=1.141，P=0.269＞0.05)。兩組小鼠腓腸肌連續(xù)串刺激的T50無顯著性差異(Z=I0.529，P=0.597＞0.05)，提示生酮飲食對小鼠腓腸肌收縮無顯著影響。

表6 兩組小鼠在體腓腸肌收縮幅度及T50值比較

2.5 生酮飲食對小鼠腓腸肌質(zhì)量和總蛋白含量的影響

由表7可知，兩組小鼠腓腸肌質(zhì)量和總蛋白含量均無顯著性差異(質(zhì)量：t=0.334，P=0.743；總蛋白含量：t=1.614，P=0.126＞0.05)，提示生酮飲食對小鼠腓腸肌質(zhì)量和總蛋白含量無顯著影響。

表7 兩組小鼠腓腸肌質(zhì)量和總蛋白含量比較

3 討論

生酮飲食是指低碳水化合物且脂肪相對增加的飲食。已有大量研究顯示，生酮飲食能夠在為機體提供足夠能量的前提下控制體重，因此生酮飲食在涉及體重級別的運動項目(如柔道、摔跤等)中可能具有一定的應用價值。但對于生酮飲食和運動之間關(guān)系的研究仍十分有限。本研究以小鼠為研究對象，經(jīng)過4 周的分組喂養(yǎng)后，結(jié)果顯示生酮飲食降低了小鼠體重，這與其他研究結(jié)果一致[6，7]。生酮飲食可使小鼠血液血酮水平增高，但血糖水平?jīng)]有明顯變化。這一結(jié)果提示，4周的低碳水化合物、高脂肪飲食不會對小鼠血糖造成影響，而作為供能物質(zhì)的酮體增高是生酮飲食動物模型的主要表現(xiàn)之一[8]。酮體是脂肪酸在肝臟氧化的中間產(chǎn)物，血液酮體的變化可能會對機體能量代謝方式產(chǎn)生影響，有相關(guān)研究指出，正常飲食的小鼠運動后肝外組織器官對酮體的利用水平明顯低于酮體的產(chǎn)生水平，因此會出現(xiàn)運動后血酮水平升高[9]。而在本研究中，標準飲食組小鼠游泳后的血酮水平顯著高于游泳前，符合運動后血酮水平升高的情況，而生酮飲食組小鼠游泳前后的血酮水平并無顯著性差異，說明4 周生酮飼料的喂養(yǎng)改變了生酮飲食組小鼠機體利用酮體的能力，即“脂肪適應”。

負重游泳是評價小鼠運動耐力的重要指標[10]，在本研究中，生酮飲食組和標準飲食組小鼠的負重游泳時間并無顯著性差異，說明生酮飲食對運動耐力并無顯著影響。小鼠在體實驗中，連續(xù)串刺激誘發(fā)小鼠腓腸肌持續(xù)收縮，隨著時間的推移，肌肉疲勞會導致收縮幅度逐漸下降，通過比較從肌肉最大收縮幅度到降至50%最大收縮幅度所用時間(T50)，可以看出兩組小鼠的T50無明顯差異，也同樣說明生酮飲食對小鼠肌肉耐力沒有明顯影響。在負重游泳過程中，心臟功能起著重要作用，當心功能受損，如心衰發(fā)生時，心肌細胞供能會以脂肪酸為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐云咸烟菫橹鱗11]，屬于心肌細胞代謝異常。研究顯示[12]，生酮飲食可改變心肌細胞能量代謝方式，維持脂肪酸供能可以更好地保護心肌細胞。單收縮與強直收縮幅度能夠反映骨骼肌力量的大小，而兩組小鼠腓腸肌單收縮和強直收縮的最大收縮幅度均無顯著性差異，說明生酮飲食對骨骼肌力量無顯著性影響。生酮飲食小鼠運動耐力及骨骼肌力量的相對穩(wěn)定，可能與血糖的相對穩(wěn)定以及酮體代謝利用的改變有關(guān)。有研究報道[13]，生酮飲食增強了小鼠脂肪的運輸與代謝能力，其運動能力不會減弱。此外，生酮飲食誘導的酮體升高可上調(diào)骨骼肌細胞線粒體多種蛋白的表達，增加線粒體生物活性，這些均與維持運動能力的穩(wěn)定有關(guān)。本研究中所使用的生酮飼料蛋白含量低于普通飼料，在等能量喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，生酮飲食組小鼠的進食量為標準飲食組小鼠的60%左右，因此生酮飲食組小鼠的蛋白攝入量遠低于標準飲食組，但兩組小鼠的腓腸肌質(zhì)量和總蛋白含量均無顯著性差異，說明低蛋白含量的生酮飲食并不會導致骨骼肌質(zhì)量和總蛋白含量降低。研究顯示，大量酮體的產(chǎn)生能夠抑制糖異生，從而減少了肌肉中蛋白質(zhì)的分解[14，15]，這也是生酮飲食小鼠運動能力保持不變的可能原因。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明：(1)為期4周的生酮飲食降低小鼠體重，升高血酮水平，該飲食模式增加了生酮飲食小鼠在運動過程中對酮體的利用，但對血糖水平無明顯影響；(2)生酮飲食對小鼠的負重游泳時間、T50時間、腓腸肌單收縮和強直收縮最大幅度以及腓腸肌重量和蛋白含量均沒有顯著影響，該飲食模式不會影響小鼠的運動耐力和肌肉收縮力。

本研究為生酮飲食減輕體重、保持肌肉力量與運動能力的飲食模式提供了參考依據(jù)，但更長期的生酮飲食是否會對骨骼肌力量等方面造成影響仍有待進一步研究。