遠隔缺血預(yù)處理防治急性腎損傷的機制研究

崔 茜，裴漢軍

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，內(nèi)蒙古包頭 014010)

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是一組以急性腎功能損害為臨床表現(xiàn)的綜合癥，具有高發(fā)病率、高死亡率的特點。通常以血肌酐升高25.0 %或50.0 %，或血肌酐絕對水平上升0.5 mg/dL為標準，表現(xiàn)為氮質(zhì)血癥、水電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂以及全身各系統(tǒng)并發(fā)癥，可伴有少尿(<400 mL/24 h或17 mL/h)或無尿(<100 mL/24 h)。AKI發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多種病理過程，包括炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細胞損傷、小管上皮細胞損傷等。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)病理過程均與線粒體功能障礙有關(guān)[1-3]，因此線粒體功能保護、選擇性清除受損的線粒體可能成為新的治療方向[4-5]。

自噬是一種降解和回收利用細胞中大分子和受損細胞器的過程，它能夠有效的清除受損的細胞器，是細胞在多種病理情況下維持細胞活力的自我保護機制之一。遠隔缺血預(yù)處理(remote ischemic preconditioning，RIPC)是一種應(yīng)用最為廣泛的新型內(nèi)源性保護措施，可發(fā)揮多種器官保護作用[6-8]。RIPC可誘導(dǎo)預(yù)處理組織發(fā)生適應(yīng)性改變，包括能量代謝改變、電解質(zhì)和酸堿平衡改善、氧自由基生成減少、炎癥反應(yīng)和細胞凋亡減少、微循環(huán)灌注改善等[9-10]。所有這些變化都有助于增加預(yù)處理組織對持續(xù)缺血和再灌注后的耐受性，但能否對AKI后的自噬發(fā)揮調(diào)節(jié)作用仍不明確，本研究通過體內(nèi)實驗研究RIPC對AKI的保護作用及對自噬的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 采用10周齡雄性C57BL/6小鼠(20～25 g)，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，質(zhì)量合格證號[SCXK(京)2019-0010]。動物飼養(yǎng)于明暗交替(12 h:12 h)的清潔級動物飼養(yǎng)室中，環(huán)境溫度24～26 ℃，相對濕度50.0 %，自由進食飲水，術(shù)前12 h禁食水。動物實驗遵循包頭醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會規(guī)定。取45只小鼠，隨機分為3組，腹腔注射10.0 %水合氯醛(10 mg/kg)，待夾尾反射消失后，進行如下操作。(1)假手術(shù)組(Sham)：后背部脊柱兩側(cè)腎區(qū)開口，游離雙側(cè)腎臟30 min后縫合創(chuàng)口，正常飼養(yǎng)23 h。(2)缺血/再灌注組(ischemia/reperfusion,I/R):后背部脊柱兩側(cè)腎區(qū)開口，游離雙側(cè)腎蒂，上動脈夾30 min撤離，維持1 h后縫合創(chuàng)口，正常飼養(yǎng)23 h。(3)遠隔缺血預(yù)處理組(remote ischemic preconditioning,RIPC)：小鼠無創(chuàng)袖帶套住右后肢根部5 min，放松5 min，循環(huán)4次后撤離；2 h后背部脊柱兩側(cè)腎區(qū)開口，游離雙側(cè)腎蒂，上動脈夾30 min撤離，維持1 h后縫合創(chuàng)口，正常飼養(yǎng)23 h。

1.2動物模型制備 腎臟I/R模型制備以10.0 %水合氯醛(10 mg/kg)腹腔注射，待夾尾反射消失后，脊柱兩側(cè)腎區(qū)開口，游離雙側(cè)腎蒂，微型動脈夾阻斷雙側(cè)腎蒂30 min后恢復(fù)灌注1 h建立小鼠腎I/R模型。模型建立成功的判定標準為，夾閉腎蒂后腎臟變?yōu)榘导t色，松開動脈夾后顏色逐漸恢復(fù)為鮮紅，表明缺血/再灌注成功。RIPC組用小鼠無創(chuàng)袖帶套住小鼠右后肢根部，持續(xù)充氣，觀察到皮膚發(fā)紺為股動脈阻斷標志，5 min后釋放袖帶壓力，如此3個循環(huán)，2 h后按照I/R組操作進行，建立小鼠RIPC模型。

1.3樣本采集和處理 Sham組、I/R組以及RIPC組小鼠，再灌注24 h后再次麻醉，經(jīng)心臟采血，置于真空采血管，以4 000 r/min離心，分離血清，置于-4 ℃冰箱保存，24 h內(nèi)檢測。后背部開口分離腎臟，迅速置于液氮中保存，用于Western blot檢測。

1.4血清肌酐和尿素氮檢測 使用全自動生化分析儀(美國雅培C16000)，檢測每組小鼠血清中尿素氮和血肌酐的水平。

1.5Western blot法檢測Beclin-1及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平 取腎臟組織，提取蛋白，應(yīng)用BCA法(美國Pierce BCA蛋白檢測試劑盒,貨號:23227)檢測蛋白濃度，采用Western blot檢測腎臟組織中Beclin 1蛋白表達水平及線粒體蛋白中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平。

2 結(jié)果

2.1RIPC對小鼠腎I/R的保護作用 為分析RIPC對小鼠腎臟的保護作用，對3組小鼠腎功能進行了分析(圖1)。與假手術(shù)組相比，腎I/R組小鼠的尿素氮及血清肌酐水平均升高(P<0.01)；與I/R組相比，RIPC組可降低I/R小鼠的尿素氮及血清肌酐水平(P<0.01)。

圖1 RIPC對小鼠腎I/R的保護作用

2.2RIPC對I/R小鼠腎臟保護的作用機制 為進一步分析RIPC的腎保護作用機制，應(yīng)用Western blot對小鼠腎組織中LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin 1蛋白的表達進行檢測，以β-actin為內(nèi)參(圖2A)。結(jié)果顯示：與I/R組相比，RIPC組LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表達量升高(P<0.05)(圖2B)；與I/R組相比，RIPC組Beclin 1蛋白的表達量升高(P<0.01)(圖2C)。以上結(jié)果說明，RIRC可上調(diào)小鼠I/R損傷中的自噬水平，從而發(fā)揮腎保護作用。

圖2 RIPC對LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin 1表達水平的影響

3 討論

本研究應(yīng)用小鼠腎I/R模型，發(fā)現(xiàn)RIPC可明顯下調(diào)尿素氮和血清肌酐水平，驗證了RIPC在AKI中的腎臟保護作用，此外，發(fā)現(xiàn)RIPC可增加小鼠腎I/R模型中LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin 1的表達，表明RIPC可能通過上調(diào)腎I/R中的自噬發(fā)揮腎保護作用。

I/R是臨床常見的病理狀態(tài)，是造成AKI的重要病因之一。腎臟I/R的發(fā)生機制復(fù)雜，與腎臟微循環(huán)損傷、氧化應(yīng)激、炎癥及凋亡等密切相關(guān)[11]。自噬作為細胞自我保護的一種防御性反應(yīng)，在腎I/R損傷中發(fā)揮重要的保護作用。有實驗發(fā)現(xiàn)，通過抑制近端小管內(nèi)的自噬反應(yīng)可加劇腎I/R損傷[12]，此外，一些研究顯示，通過上調(diào)自噬可明顯抑制腎I/R損傷[13]，證明自噬是抑制腎I/R損傷、保護腎臟的有效途徑。

缺血預(yù)處理是預(yù)防I/R損傷的有效手段，在多項實驗中證明其具有明顯的器官保護作用[14-15]。近期研究發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理可明顯促進自噬的發(fā)生，并且對腎臟保護產(chǎn)生積極的作用[16]，而自噬在腎I/R中主要通過維持腎小管細胞的穩(wěn)定狀態(tài)來發(fā)揮保護作用[17]。在本研究中采用了RIPC干預(yù)手段，RIPC是對遠隔組織進行缺血預(yù)處理后，從而對靶器官發(fā)揮保護作用。由于腎臟的結(jié)構(gòu)及功能的特異性，使得RIPC較缺血預(yù)處理更為有效。結(jié)果顯示，RIPC與缺血預(yù)處理結(jié)果相似，同樣可減輕腎I/R損傷，且RIPC的腎保護作用機制與自噬密切相關(guān)。與缺血預(yù)處理相比，RIPC更具臨床可操作性，可減少或避免直接處理靶器官造成的損傷，因此RIPC可作為臨床治療AKI的新的較為安全有效的手段。