基于網絡藥理學探究黃芪-川芎藥對治療缺血性腦卒中的作用機制*

陳紅陽，楊志華,2，賈壯壯,2，劉 震，郭利平,4△

(1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300381；3.包頭市中心醫(yī)院，內蒙古 包頭，014040；4.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，300120)

缺血性腦卒中以局部腦組織血液循環(huán)障礙為主要病理表現，通常由腦血管阻塞、腦血流灌注不足、氧合受損等引起，進而導致機體多重功能損傷[1]，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點，給家庭及社會經濟帶來沉重負擔[2]。目前，缺血性腦卒中的首選治療策略是血管再通治療，但由于其治療時間窗有限，且易發(fā)生出血轉化、腦缺血再灌注損傷等并發(fā)癥，因而影響其臨床療效[3-4]。

中藥具有多組分、多靶點、多機制等特點，在治療缺血性腦卒中這一發(fā)病機制復雜的疾病中具有獨特優(yōu)勢。缺血性腦卒中屬于中醫(yī)“中風”范疇，氣虛血瘀是其主要病機特點，貫穿于疾病發(fā)生發(fā)展的各個階段[5]。黃芪-川芎作為益氣活血常用藥對，廣泛應用于氣虛血瘀型心腦血管疾病的臨床治療。前期研究表明[6]，黃芪-川芎是近現代名老中醫(yī)治療缺血性腦卒中使用頻率最高的益氣活血藥對。黃芪味甘性溫，歸肺、脾經，具有益氣扶正、利水消腫、升陽固脫等功效，為補氣藥之長；川芎味辛性溫，氣善走竄，既能上行達于巔頂，又能下行至于血海，活血祛瘀作用廣泛。二者配伍共奏益氣活血之功，與缺血性腦卒中氣虛血瘀的主要病機特點相契合。網絡藥理學是系統(tǒng)生物學的重要組成部分，可從多個角度闡釋藥物-靶點-疾病間的系統(tǒng)關聯，與中醫(yī)學整體觀念的基本特點相吻合，為研究作用成分繁多、分子機制復雜的中藥提供可靠的方法[7]。本文基于網絡藥理學研究黃芪-川芎藥治療缺血性腦卒中的作用機制，以期為后續(xù)進一步深入研究提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 黃芪、川芎活性化合物遴選及數據庫構建 通過西北農林科技大學生命科學院研發(fā)的TCMSP數據庫(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)對黃芪、川芎所含的化合物進行查詢匯總，設置參數OB≥30%、DL≥0.18、Caco-2≥-0.4、BBB≥-0.3、HL≥4 h，通過ADME模塊對查詢到的化合物進行遴選，構建黃芪、川芎活性化合物數據庫。

1.2 藥物-靶點網絡構建 通過黃芪、川芎活性化合物成分篩選出對應的作用靶點并剔除重復蛋白，經UniProt數據庫(https：//www.uniprot.org/)將蛋白靶點轉化為基因靶點，進行靶點基因的標準化處理，通過Cytospase 3.8.0構建黃芪、川芎藥物-靶點網絡。

1.3 疾病-靶點網絡與藥物-靶點網絡融合 通過OMIM 數據庫(http：//www.omim.org/)、DisGeNET 數據庫(http：//www.disgenet.org/)、TTD 數據庫(http：//db.idrblab.net/ttd/)及文獻報道收集缺血性腦卒中治療的相關靶點，構建缺血性腦卒中相關靶點數據庫，并與藥物-靶點網絡進行融合，篩選出黃芪-川芎藥對治療缺血性腦卒中的潛在核心靶點。

1.4 潛在核心靶點PPI蛋白互作網絡分析 通過STRING 平臺(https：//string-db.org/)，建立黃芪-川芎藥對治療缺血性腦卒中潛在核心靶點的蛋白互作網絡(protein-protein interaction network，PPI network)，將各個潛在核心靶點之間互相作用可視化。

1.5 GO富集分析及KEGG信號通路富集分析 通過 DAVID 數據庫(https：//david.ncifcrf.gov/)、KEGG數據庫(https：//www.kegg.jp/)及 Cytospase 3.8.0軟件中Glue GO插件及cytoHubba插件，進行Biological Process、Cellular Component、Molecular Function 功能GO富集分析及KEGG通路富集分析，綜合預測黃芪-川芎藥對與缺血性腦卒中靶點的生物學作用及調控通路。

2 結果

2.1 黃芪、川芎活性化合物信息 通過對黃芪、川芎所含化合物進行ADME篩選，剔除重復化合物與缺少靶點的化合物，最終共得出17個活性成分，其中黃芪11個，川芎6個。見表1。

表1 黃芪、川芎活性化合物信息

2.2 藥物-靶點調控網絡 通過對黃芪11個化合物進行分析，刪除單味藥內不同化合物的重復靶點，獲得黃芪對應潛在靶點93個；對川芎6個化合物進行分析，刪除單味藥內不同化合物的重復靶點，獲得川芎對應潛在靶點58個；刪除二味藥物的重復靶點以后，獲得黃芪、川芎藥對潛在治療靶點97個?！八幬?靶點”調控網絡見圖1。

圖1 黃芪、川芎藥物-靶點調控網絡

2.3 黃芪-川芎藥對治療缺血性腦卒中的潛在核心靶點 以“Ischemic Stroke”為關鍵詞在 OMIM、Dis－GeNET、TTD數據庫及文獻報道中收集缺血性腦卒中治療的相關靶點393個，構建“疾病-靶點”調控網絡，見圖2；將“疾病-靶點”調控網絡與“藥物-靶點”調控網絡對應的靶點進行比對，共篩選出18個重合靶點。篩選出的18個重合靶點即可能是黃芪-川芎藥對治療缺血性腦卒中的潛在核心靶點，見表2。

圖2 缺血性腦卒中疾病-靶點調控網絡

表2 黃芪-川芎藥對治療缺血性腦卒中的潛在核心靶點

2.4 潛在核心靶點PPI蛋白互作網絡 將黃芪-川芎藥對治療缺血性腦卒中的潛在核心靶點導入STRING平臺，得到靶點蛋白互作PPI網絡，見圖3。該網絡包括18個節(jié)點、84條邊，平均度值為9.33，其中節(jié)點為靶點蛋白，邊為各蛋白之間相互作用關系，節(jié)點連接邊數越多代表其在網絡中的作用越重要。

圖3 黃芪-川芎藥對治療缺血性腦卒中潛在核心靶點PPI網絡

2.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 黃芪-川芎藥對治療缺血性腦卒中的潛在核心靶點GO功能富集分析結果顯示，主要涉及一氧化氮(nitric oxide，NO)生物合成的正調控、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性的調節(jié)、細胞凋亡的負調控、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信號的正調控、I-κb激酶/NF-κb信號的調節(jié)、雌激素反應、炎癥及免疫反應、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的正調控、血管內皮細胞遷移的正調控、內皮細胞屏障(endothelial cell barrier，ECB)建立的調控、蛋白質磷酸化的正調控、血管生成及器官再生的調控、細胞成熟及老化、蛋白質復合物組裝的正調控、干擾素 γ(interfereon-gama，IFNγ)產生的正調控等生物過程(Biological Process，BP)；參與的細胞組成(Cellular Component，CC)主要涉及細胞外區(qū)、細胞外間隙、細胞質、質膜等有關；涉及的分子功能(Molecular Function，MF)主要包括蛋白質結合、DNA結合、細胞因子(cytokine，CK)活性、類固醇激素受體、類固醇結合、生長因子活性、轉錄因子結合、雌激素受體活性等，見圖4-7。

圖4 核心靶點GO功能富集BP分析

圖5 核心靶點GO功能富集CC分析

圖6 核心靶點GO功能富集MF分析

圖7 核心靶點GO功能富集注釋圖

黃芪-川芎藥對治療缺血性腦卒中的潛在核心靶點KEGG通路富集分析顯示，主要涉及缺氧誘導因子 1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)信號通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶信號通路(phosphatidylinositol-3-kinases/protein kinase B，PI3K/AKT)、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)信號通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、Toll樣受體(Toll-like Receptor，TLR)信號通路、雌激素信號通路、NF-κB信號通路、NOD樣受體(NOD-like Receptor，NLR)信號通路、肥厚型心肌病(lypertrophic cardiomyopathy，HCM)、白細胞介素10(interleukin 10，IL-10)抗炎信號通路、Tie信號通路，見圖8。

圖8 核心靶點KEGG信號通路富集分析

3 討論

中醫(yī)的整體觀念、辨證論治理論及中藥多組分、多靶點、多機制的作用特點，符合網絡藥理學利用大數據資源，建立“藥物-靶點-疾病”相互作用網絡，系統(tǒng)預測藥物與疾病的網絡關系，已被廣泛應用于系統(tǒng)揭示中藥對疾病作用的物質基礎和效應機制。益氣活血法是缺血性腦卒中的重要治療思路，黃芪-川芎作為益氣活血代表藥對，臨床廣泛用于治療氣虛血瘀型腦卒中。本研究采用網絡藥理學方法，初步探討黃芪-川芎藥對治療缺血性腦卒中的潛在物質基礎及治療機制。

通過構建黃芪、川芎活性化學成分數據庫，共篩選出17個活性成分，其中黃芪11個，川芎6個；通過構建“藥物-成分-靶點”網絡，初步發(fā)現黃芪-川芎藥對的活性成分治療缺血性腦卒中主要作用于包括 IL-1B、IL-6、IL-10、TNF、CDKN2A、ANGPT1、ANGPT2、ESR1、ITGA2B、VEGFA、NOS3、CASP3、BCL2A1、F7、AR、ESR2、PPARG、BDNF 在內的 18 個潛在核心靶點；通過對潛在核心靶點進行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析發(fā)現，潛在核心靶點可通過調節(jié)HIF-1信號通路、PI3K/AKT信號通路、IBD信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、TLR信號通路、雌激素信號通路、NF-κB信號通路、NLR信號通路、HCM、IL-10抗炎信號通路、Tie信號通路等多個途徑，參與調節(jié)NO生物合成、NOS活性、細胞凋亡、AKT信號、I-κb激酶/NF-κb信號、雌激素反應、炎癥及免疫反應、VEGF、血管內皮細胞遷移、內皮細胞屏障的建立、蛋白質磷酸化、血管生成及器官再生、細胞成熟及老化、蛋白質復合物組裝、IFNγ生成、CK活性、生長因子活性、雌激素受體活性等多個生物過程、細胞組成及分子功能。

缺血性腦卒中發(fā)病機制復雜，由多種因素共同參與并相互影響，進而引起一系列級聯損傷反應。當腦血管閉塞、腦組織血氧供應不足時，體內的氧自由基、氮自由基等高活性分子過量產生，超過機體內源性抗氧化系統(tǒng)的清除能力，引起氧化/硝化應激反應。NO是體內重要的多態(tài)性、內源性調節(jié)物質，在正常生理狀態(tài)下能夠擴張血管、抑制血小板聚集、參與突觸間信號傳遞，但過度產生的NO則會產生神經毒性作用[8]。NOS是NO的一種合成限速酶，可在一些輔助因子的作用下催化L-精氨酸合成NO，NO能夠與超氧陰離子反應形成ONOO-等神經毒性更強的物質，而內源性SOD清除超氧陰離子的能力不足以抑制ONOO-的產生[9]。ONOO-引發(fā)的一系列氧化損傷是NO導致神經系統(tǒng)破壞的重要因素[10]，ONOO-可直接引起腦組織結構損傷和離子通道破壞，最終導致線粒體酶損傷、DNA鏈斷裂以及脂肪過氧化；另一方面，NO在合成ONOO-的過程中被過度消耗，因此也限制了NO正常生理功能的發(fā)揮[10-11]。此外，NOS還能通過氧化還原反應轉化為ROS生成酶，促進ROS的生成[12]，進一步加重腦組織損傷。NOS有3種亞型，即內皮型(nNOS)、神經元型(eNOS)和誘導型(iNOS)。病理條件下，iNOS和nNOS催化生成過量的NO，產生神經毒性作用，而eNOS主要合成血管內皮中的NO，對腦組織具有保護作用。缺血性腦卒中發(fā)生時，神經細胞中iNOS和nNOS的表達顯著增加，而eNOS活性降低，進一步導致內皮功能障礙、血腦屏障破壞、細胞凋亡等[13]。

腦缺血發(fā)作數小時后，缺血半暗帶區(qū)域由于存在少量血液供應，故該區(qū)域的細胞死亡形式以神經元凋亡為主，神經元凋亡的多少對腦梗死體積大小及神經功能的恢復都有重要影響，氧化/硝化應激反應、炎癥反應、鈣超載等病理過程均可通過不同途徑導致細胞凋亡。PI3K/AKT和MAPK信號通路是細胞內重要的信號轉導通路，具有抗凋亡、促進細胞增殖的作用，在腦缺血損傷中發(fā)揮著重要作用。腦缺血缺氧時，PI3K被激活，PI3K下游許多效應分子，其中AKT是通路的中心環(huán)節(jié)，對細胞存活具有重要意義，它可通過調控下游的多個作用靶點，如Bcl-2蛋白家族、Caspase蛋白家族等，使相關凋亡蛋白磷酸化而失去活性[14]，同時，AKT還可減少線粒體膜內外交界處的蛋白性孔道開放[15]，改善線粒體功能，進而發(fā)揮抗凋亡效應。MAPK在中樞神經系統(tǒng)中廣泛表達，當MAPK磷酸化底物被激活時，可以調節(jié)相關基因的轉錄，從而影響細胞凋亡和存活過程[16]。MAPK信號通路具有抗凋亡和促凋亡的雙重作用，不同的細胞外刺激可以激活不同的MAPK信號傳導通路，其中ERK1/2、JNK以及p38 MAPK信號通路是MAPK最重要的3個亞家族途徑。研究表明[17]，神經細胞中ERK1/2信號通路的激活是針對腦組織缺血缺氧刺激而啟動的一種保護機制，在腦缺血中發(fā)揮抗凋亡的作用，對神經元具有保護作用；但也有研究發(fā)現[18]，ERK1/2信號通路在不同刺激下也可發(fā)揮促凋亡的作用，ERK1/2信號通路在神經元凋亡中的雙重作用可能與不同的細胞種類、不同的刺激干預、MAPK通路間的相互作用等因素有關。而大多數文獻報道，JNK和p38 MAPK信號通路可促進神經細胞的凋亡，加重各器官缺血再灌注損傷[19]，然而也有研究證實，在細胞內JNK和p38 MAPK的活化也可作為保護性因素，抑制細胞凋亡[20]，其不同作用可能由其在不同細胞中的表達以及激活程度所決定。

炎癥免疫反應是缺血性腦卒中發(fā)展過程中的一個關鍵因素，腦缺血后數小時內，炎癥免疫細胞激活，誘導細胞因子、粘附分子和趨化因子等釋放，促使炎癥免疫細胞在損傷部位浸潤，釋放的細胞因子又可進一步激活炎癥免疫細胞，導致腦組織損傷加重。TNF家族是在小鼠癌細胞的血清中發(fā)現的一組細胞因子，在各種炎癥免疫反應中發(fā)揮著重要作用，其中TNF-α是TNF家族中的重要成員，腦缺血早期廣泛存在于神經元內，圍繞缺血組織，并可誘導白細胞聚集、粘附、遷移至損傷腦組織中，是炎癥反應的起始因子[21]；IL-10又被稱為細胞因子合成抑制因子，在機體中主要調節(jié)免疫及炎癥反應，其可在腦缺血時通過抑制TNF-α、IL-1、IFNγ等促炎因子減輕腦組織缺血性損傷[22]，從而發(fā)揮神經保護作用；NF-κB是B淋巴細胞前體細胞中的一種核轉錄因子，其可調節(jié)DNA轉錄、細胞因子的產生以及細胞的存活，參與炎癥、免疫、細胞凋亡等病理過程。腦缺血損傷時，神經細胞中的NF-κB被激活，促使黏附分子、細胞因子等炎癥免疫基因大量轉錄，通常被認為是腦缺血后炎性級聯反應的始動因素[23-24]。腦缺血的炎癥損傷可通過TLR的信號傳導[25]，TLRs屬于模式識別受體，主要在免疫細胞內表達，研究表明[26-27]，大多數類型的TLRs，尤其是TLR2和TLR4可產生細胞因子和趨化因子，在腦缺血損傷后表達明顯增加，進而加重缺血組織的炎癥性損傷，因此抑制TLR2和TLR4信號傳導通路可能是治療腦缺血損傷的重要靶點。

血管新生對于腦組織的修復以及神經功能的恢復具有重要意義，也是缺血性卒中的一個潛在治療靶點。VEGF是一種血管生長和血管滲透因子，是目前公認最強大的促血管生成因子之一，在缺血缺氧情況下可與血管內皮細胞上的特異性受體結合，促進內皮細胞增殖，在血管生成早期階段起作用。研究發(fā)現[28-29]，血清VEGF水平與腦梗死面積以及長期預后相關，其原因可能與其促血管新生作用有關，但作為血管通透性增強因子，VEGF也常導致血腦屏障滲漏，加重腦水腫。Ang與VEGF功能類似，二者相互協同，共同調節(jié)血管新生過程，其中Ang-1在平滑肌細胞、周細胞中表達，通過旁分泌形式作用于血管內皮，可促進新生血管的成熟和穩(wěn)定，Ang-2主要由內皮細胞表達，對Ang-1有拮抗作用，Tie2是血管內皮細胞的特異性受體，主要由血管周圍細胞表達[30-31]。Ang-1與Ang-2可競爭性地與Tie2結合，但只有Ang-1與Tie2結合才能誘導其磷酸化，從而介導血管內皮細胞與壁細胞(血管周圍細胞)相互作用，促使血管周圍細胞向內皮細胞遷移，促進內皮細胞增殖[32]，在血管生成后期維持新生血管的完整性及穩(wěn)定性，并加強內皮細胞和間質細胞之間的緊密連接，保護血腦屏障，從而對抗VEGF引發(fā)的血腦屏障滲漏[33]。VEGF與Ang-1/Tie2系統(tǒng)可相互協同，共同調節(jié)血管新生的過程，促進血管形成和成熟穩(wěn)定。

雌激素是人體常見的一種甾體類固醇激素，作為中樞神經遞質之一，雌激素不僅能夠調節(jié)人體生長發(fā)育，還可以通過血腦屏障進入中樞神經系統(tǒng)，參與各種中樞神經系統(tǒng)疾病的病理生理過程。研究表明[34]，雌激素可能通過促進神經再生、減少氧自由基、拮抗興奮性氨基酸毒性、減輕炎癥反應以及抑制鈣超載等機制發(fā)揮神經保護作用，可降低缺血性腦卒中的發(fā)病率，改善神經功能。除神經保護作用外，雌激素還可促進內皮細胞增殖和血管生成，同時內皮細胞中eNOS的表達，提高NO的生物利用度，進而促進血管擴張，增加腦血流量，減輕腦缺血損傷[35]。

本研究基于網絡藥理學方法，系統(tǒng)分析了益氣活血代表藥對黃芪-川芎“多組分-多靶點-多機制”治療缺血性腦卒中的靶點及作用機制，為其臨床應用提供了理論依據。網絡藥理學作為一種基于數據庫的虛擬研究模式，并不能確切地揭示藥物在生物體內的作用機制及途經，因此通過網絡藥理學分析出的結果，尚需進一步驗證有效成分及靶點的作用機制。