厚皮甜瓜種質蔓枯病抗性評價與遺傳多樣性分析

朱凌麗 徐建 姚協(xié)豐 徐錦華 李蘋芳 柳李旺 羊杏平

摘要：?采用苗期蔓枯病接種和單核苷酸多態(tài)性（SNP）基因型分析對120份厚皮甜瓜高代自交系進行抗性評價與遺傳多樣性研究。結果顯示：光皮類型厚皮甜瓜中高抗、中抗種質資源占比達11.11%，其抗性水平結構優(yōu)于網(wǎng)紋甜瓜和哈密瓜。統(tǒng)計分析結果顯示，21個SNP位點的PIC值為0.050～0.478，其中12個中度多態(tài)SNP位點的PIC值平均為0.37，表明甜瓜種質的多態(tài)性中等。群體結構與聚類分析結果表明，124份甜瓜種質資源可分成5大類群，各類群具有一定的獨立性，且類群間存在明顯的差異，遺傳多樣性豐富。

關鍵詞：?厚皮甜瓜;種質資源;蔓枯病;抗性評價;遺傳多樣性

中圖分類號：?S652??文獻標識碼：?A??文章編號：?1000-4440（2021）02-0454-11

Abstract：?The gummy stem blight （GSB） resistance evaluation and genetic diversity study of 120 high generation inbred lines of muskmelons were conducted via inoculation at seedling stage and single nucleotide polymorphism （SNP） genotype analysis.?The results showed that， the proportion of germplasm resources of smoothbark muskmelons with high and medium resistance to GSB was up to 11.11%， and the structure of resistance level was better than that of netted melon and Hami melon.?The statistical analysis results showed that， the polymorphism information content （PIC） value of 21 SNP loci ranged from 0.050 to 0.478， and the average PIC value of 12 moderate polymorphic SNP loci was 0.37， indicating that the polymorphism of the melon germplasms was moderate.?Results of population structure and clustering analysis showed that， the 124 melon germplasms could be classified into five major groups， and each group showed certain independence.?Furthermore， there were obvious differences between different groups and the genetic diversity was abundant.

Key words：?muskmelon;germplasm resources;gummy stem blight;resistance evaluation;genetic diversity

甜瓜是世界范圍內重要的經(jīng)濟作物，在熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)廣泛種植，具有極高的食用和經(jīng)濟價值。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）統(tǒng)計，2018年全球甜瓜栽培面積約1.05×106 hm2，其中中國甜瓜栽培面積占總量的34.3%，年總產(chǎn)量1.278×107 t，位居世界之首。厚皮甜瓜是食用栽培甜瓜的一種類型，較薄皮甜瓜品質優(yōu)良，香甜可口，營養(yǎng)豐富，是廣受國內外市場歡迎的高檔果品。隨著哈密瓜東移栽培的成功，厚皮甜瓜逐漸成為中國主要的設施栽培瓜類作物[1]。但是中國東部地區(qū)氣候濕潤，在保護地栽培的甜瓜極易誘發(fā)瓜類蔓枯病，嚴重時常常造成毀滅性減產(chǎn)[2]。

生產(chǎn)中主要通過使用化學藥劑防治蔓枯病，不僅成本高、效率低，還會引發(fā)病原菌的抗藥性與環(huán)境污染等問題[3]。防治實踐表明，利用抗源選育抗病品種是防治甜瓜蔓枯病最經(jīng)濟有效的措施[4]。因此，利用致病力強的蔓枯病病菌人工接種厚皮甜瓜種質資源，鑒定其抗性，篩選出抗病或耐病的種質，可以從源頭上解決蔓枯病問題，并為選育優(yōu)質抗病品種奠定基礎。近年來國內甜瓜蔓枯病的研究多側重于對地方品種的抗病性鑒定[5]，以及蔓枯病抗性遺傳關系分析及抗性基因定位[6-7]，亟需對厚皮甜瓜種質資源進行蔓枯病抗性評價。而且目前厚皮甜瓜商業(yè)品種多為雜交種，育種者為獲取其優(yōu)良特性進行多代自交獲得骨干親本，造成目前厚皮甜瓜種質資源的親緣關系相近，遺傳背景趨于模糊[8]。因此，利用分子標記鑒定技術，完善厚皮甜瓜種質資源遺傳多樣性評價體系，明確其種質遺傳多樣性分布特點，對厚皮甜瓜的品種選育與種質創(chuàng)新以及甜瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展都具有重要意義。

本研究對江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所西甜瓜創(chuàng)新團隊多年選育的120份厚皮甜瓜高代自交系材料進行蔓枯病抗性鑒定，分析不同類型及地理來源甜瓜種質資源對蔓枯病的抗感性;同時篩選厚皮甜瓜單核苷酸多態(tài)性（SNP）引物，對124份甜瓜種質資源的遺傳多樣性進行分析，以期為厚皮甜瓜核心種質構建、種質創(chuàng)制、抗病新品種選育等研究工作提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料準備

供試甜瓜種質資源共124份（表1），包括厚皮甜瓜120份、薄皮甜瓜（抗蔓枯病對照）3份和厚皮哈密瓜雪里紅（感蔓枯病對照）1份。其中厚皮甜瓜種質資源為江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所從國內不同省份和日本、韓國、東南亞、美國及歐洲等不同國家及地區(qū)收集，經(jīng)多代自交選擇獲得的高代自交系;薄皮甜瓜引自美國，為抗蔓枯病對照材料;雪里紅由新疆農(nóng)業(yè)科學院哈密瓜研究中心培育，為感蔓枯病對照材料。厚皮甜瓜中有網(wǎng)紋甜瓜種質資源48份，哈密瓜種質資源43份，光皮甜瓜種質資源27份。2017年秋季于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所玻璃溫室內進行甜瓜育苗，每份材料種植20個單株，日溫25～28 ℃，夜溫18～20 ℃，長至2～3張真葉時備用。

蔓枯病病菌[Didymella bryoniae （Auersw.） Rehm]選擇DBJSJY2作為接種菌株，該菌株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所瓜類作物研究室從田間收集、分離、鑒定和保存，致病力強，穩(wěn)定性好。接種前將DBJSJY2接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）固體培養(yǎng)基上，16 h/d光照、26～28 ℃培養(yǎng)1周。參照姚協(xié)豐等[9]方法利用黃瓜培養(yǎng)蔓枯病病菌分生孢子（圖1）。用刀片刮取菌塊，研磨后以無菌水沖洗，用4層滅菌紗布過濾沖洗液，在顯微鏡下將分生孢子懸浮液調整為1 ml 5×105個備用。

1.2?取樣及DNA提取

對124份甜瓜種質資源葉片用標準打孔器打孔取樣，每份資源材料取8張葉片，液氮冷凍保存。采用十六烷基三甲基溴化銨/十二烷基硫酸鈉（CTAB/SDS）方法提取組織DNA。DNA溶解后用BioTEK多功能酶標儀測定OD值，包括OD230、OD260、OD280。通過1%瓊脂糖凝膠于120 V電泳30 min，確定DNA的完整性。

1.3?蔓枯病病菌苗期接種及病情鑒定

參照周曉慧等[10]方法進行苗期接種，在甜瓜苗期3～4葉期時用噴霧器噴灑孢子懸浮液（按1 ml 5×105個的密度，加1% Tween80），噴至植株葉片開始滴水為止。每份材料處理5株，3次重復，以清水為對照。接種后置于拱棚內覆膜并加蓋遮陽網(wǎng)，保證濕度在90%以上，溫度控制在25 ℃左右，3 d后揭開拱棚。

甜瓜苗期活體接種后分別在第7 d、11 d、15 d調查統(tǒng)計蔓枯病病害發(fā)生情況。參照Gabriele等[11]方法，根據(jù)植株不同部位發(fā)病情況及病斑大小進行抗性分級統(tǒng)計：0級，無癥狀;1級，葉片發(fā)黃（僅疑似感?。?2級，葉片有輕微癥狀（<20% 壞死）;3級，葉片有中度癥狀（21%～45% 壞死）;4級，葉片有嚴重癥狀（>45% 壞死）;5級，有葉片病死，莖上無癥狀;6級，葉片有輕微癥狀（<20% 壞死），葉柄和莖上也有壞死（<3 mm）;7級，葉片有中度癥狀（21%～45% 壞死），葉柄和莖上也有壞死（3～5 mm）;8級，葉片有嚴重癥狀（>45% 壞死），葉柄和莖稈壞死（>5 mm）;9級，植株死亡。平均病情級別數(shù)（RI）計算公式：RI=∑（各級值×株數(shù)）/總株數(shù)。根據(jù)平均病情級別數(shù)確定蔓枯病抗性級別。高抗（HR）： RI≤2.0;抗（R）： 2.06.0。

1.4?SNP引物設計合成

以檢出率100%、雜合率<30%、最小等位基因頻率（MAF）>40%、上下游100 bp內沒有其他SNP、基因組單拷貝為標準，挑選了40個均勻覆蓋甜瓜基因組的SNP標記[12-15]。根據(jù)SNP位點設計PCR 3′末端擴增引物，設計軟件為Primer5，引物Tm值為55～65 ℃。每個SNP位點設計2條SNP特異性引物和1條通用引物，引物由Lifetech公司合成。

1.5?SNP基因分型驗證

競爭性等位基因特異性PCR（Kompetitive allele specific PCR，KASP）反應體系：10 ng基因組DNA， 5.00 μl KASP V4.0 2×Master Mix， 0.14 μl KASP 72×assay mix， 加ddH2O至10.00 μl（適用96孔板）。其中KASP V4.0 2 ×Master Mix購于LGC公司，包括熒光探針A、熒光探針B、淬滅探針A和淬滅探針B、高保真Taq酶、dNTP等。KASP 72×assay mix由濃度為100 μmol/L的SNP1-A1、SNP1-A2、SNP1-C1與ddH2O按照12∶12∶30∶46（體積比）混合組成。試驗同時設置不加模板的空白對照，每個PCR板中設置1個空白對照。梯度PCR反應程序如下：95 ℃ 15 min，10個循環(huán);94 ℃ 20 s，61 ℃（每個循環(huán)降0.6 ℃） 退火60 s，26個循環(huán);94 ℃ 20 s，55 ℃退火60 s。采用雙向單激發(fā)讀板儀PHERAstar 對PCR擴增產(chǎn)物進行掃描，羧基熒光素（FAM）激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為520 nm，六氨-6-甲基熒光素（HEX）激發(fā)波長為528 nm，發(fā)射波長為560 nm，系統(tǒng)參比熒光（ROX）激發(fā)波長為575 nm，發(fā)射波長為610 nm。

采用KrakenTM軟件對雙向單激發(fā)讀板儀PHERAstar進行掃描數(shù)據(jù)分析：聚合在接近X軸、顯示藍色的樣本基因型為連接FAM熒光標簽序列的等位基因，聚合在接近Y軸、顯示紅色的樣本基因型為連接HEX熒光標簽序列的等位基因，中間顯示綠色的樣本基因型為上述2種等位基因的雜合型，顯示粉色的樣本可能是DNA質量或濃度問題而使擴增產(chǎn)物沒有明確分型，顯示黑色的樣本為空白對照[16]。

1.6?統(tǒng)計分析

病情級別統(tǒng)計數(shù)據(jù)利用DPS統(tǒng)計軟件進行相關性分析。SNP位點基因型頻率數(shù)據(jù)使用PIC-CALC軟件計算分析多態(tài)信息量（PIC值）。利用Structure 2.3軟件計算遺傳相似系數(shù)，用Structure 2.3軟件分析群體結構及其遺傳多樣性，選擇最佳群體組群數(shù)（K），并在計算時將K取值范圍設置為1～8，重復8次，采用Admixture model，計算△K值作為衡量最佳K值的標準。獲得聚類矩陣，利用Structure軟件進行數(shù)學模型聚類分析，基于結構程序生成聚類圖。

2?結果與分析

2.1?不同厚皮甜瓜種質資源對蔓枯病病菌的抗病性

利用噴霧接種法鑒定120份厚皮甜瓜種質資源對蔓枯病病菌的抗性反應。除1份材料（編號102）出苗情況不佳未能接種外，其余119份自交系材料和感病對照（雪里紅）在接種3～5 d后均開始發(fā)病。具體癥狀表現(xiàn)為：子葉最先出現(xiàn)失綠斑點，隨著病斑的擴展而壞死;葉部出現(xiàn)褪綠色病斑，并逐漸擴大擴展為“V”形病斑;莖稈晚于子葉、葉片發(fā)病，感病時出現(xiàn)水漬狀病斑，逐漸擴大后滲出少量紅色膠狀物（圖2）。不同材料的發(fā)病程度不同，蔓枯病抗性對照PI140471達到高抗水平。在119份自交系中未發(fā)現(xiàn)免疫或高抗材料，除PI 200819、PI 482398兩份抗病對照達到抗（R）級別外，發(fā)現(xiàn)8份厚皮甜瓜自交系抗蔓枯病，其平均病情級別數(shù)在2.00至3.00之間。此外還有30份自交系平均病情級別數(shù)小于4.00，對蔓枯病表現(xiàn)為中抗（MR），其余材料均易感蔓枯?。ū?）。

群體中篩選到抗性種質資源8份，占比6.7%，包括4份網(wǎng)紋甜瓜種質資源、3份光皮甜瓜種質資源以及1份哈密瓜種質資源。這8份抗性種質資源在果實形狀、果皮果肉顏色和果肉質地方面表現(xiàn)迥異，可作為優(yōu)質種質資源加以利用（表3）。其中M-16-TH-39、M-17-108為光白皮圓果，全生育期110 d，中心糖分含量別為16.0%、14.5%，是開展早熟、高品質、抗病厚皮甜瓜育種的優(yōu)良種質; M-17-58-8-7的果肉中心糖分含量達到17.4%，綠色果肉風味濃厚，是較為難得的高糖優(yōu)質抗病種質資源。

2.2?119份厚皮甜瓜種質資源地理來源與蔓枯病抗性關系分析

將119份厚皮甜瓜種質資源按照地理來源劃分成6組，其中來源于國內的種質資源按地理來源劃分成2個組，即中國南方組和中國北方組。國外有日本和韓國組、東南亞組、歐洲組、美國組。統(tǒng)計分析結果表明，不同地理來源的甜瓜自交系中都有抗性材料分布，但是不同地理來源抗性材料占比差別較大，東南亞組內達到中抗（MR）級別以上的材料占比最高，達到66.70%（圖3）。中國南方組中達到抗（R）與中抗級別的材料數(shù)量最多，抗級別的材料占比最高，達到11.36%。達到抗病級別的種質資源都來源于中國、日本和韓國。

2.3?SNP位點篩選及PIC值分析

從ARAYA熒光閱讀儀上讀取熒光信號，然后將結果導入數(shù)據(jù)庫，采用KrakenTM軟件對雙向單激發(fā)讀板儀PHERAstar掃描獲得的數(shù)據(jù)進行分析，124個甜瓜種質資源中含有候選SNP位點的3個基因型類別。通過KrakenTM軟件從40個均勻覆蓋甜瓜基因組的標記中篩選出21對多態(tài)性較好的SNP引物（表4）。

根據(jù)21個SNP位點的基因分型，分析21個SNP在所測試甜瓜種質資源中的基因型頻率和多態(tài)信息量，結果顯示，21個SNP位點的PIC值為0.050～0.478（表5）。

2.4?甜瓜種質資源群體結構及遺傳多樣性分析

用Structure 2.3軟件計算△K值，作為衡量最佳K值的標準。結果顯示，當K=5時△K最大（圖4）。依據(jù)K=5時分析獲得的數(shù)據(jù)，在Simulation Result 中用bar plot 繪制各個材料在各群中所占比例（圖5）。由圖5可以看出，124份甜瓜種質資源分成5大類群（5種顏色表示5個類群），各群體間存在明顯的差異，并具有一定的獨立性，這說明供試的甜瓜種質資源存在明顯的群體結構?？孤莶〔牧现饕性诰G色的第2大類和粉色的第5大類中。第2大類全部為軟肉類型甜瓜種質資源，藍色的第3大類以脆肉型甜瓜為主，黃色的第4大類全部為來源于新疆和上海的哈密瓜，第5大類以網(wǎng)紋甜瓜為主。

根據(jù)材料的地理來源，用Structure軟件分析得到124個甜瓜種質資源聚類三角圖（圖6），3個角頂點代表3個群組。Cluster 1群組主要為來源于中國新疆、上海和歐洲的厚皮甜瓜種質資源，Cluster 2群組主要為來源于日本、韓國、中國臺灣及美國的厚皮甜瓜種質資源，其中黃色點為引自美國的薄皮甜瓜種質資源，在Cluster 1和Cluster 2中間聚類，表現(xiàn)出一定差異性。All others 群組主要包括來源于甘肅、河南的種質資源。棕色點為來源于江蘇的種質資源，在3個組群都有分布，說明來源于江蘇的部分種質資源與3個類群間的差異都比較大，在中間聚類。同一地理來源的厚皮甜瓜種質資源可能聚在同一類群組，也可能交叉分布在不同群組，可見其聚類并不完全以地理來源為標準。

圖6中的綠色點代表引自中國新疆的厚皮甜瓜材料，淡藍色點代表引自中國上海的厚皮甜瓜材料，粉紅色點代表引自歐洲的厚皮甜瓜材料，棕色點代表引自中國江蘇的厚皮甜瓜材料，深紫色點代表引自日本的厚皮甜瓜材料，淡紫色點代表引自中國臺灣地區(qū)的厚皮甜瓜材料，卡其色點代表引自美國的厚皮甜瓜材料，黃色點代表引自美國的薄皮甜瓜材料，深藍色點代表引自中國甘肅的厚皮甜瓜材料。

3?討論

3.1?厚皮甜瓜種質對蔓枯病的抗病性評價

高溫、高濕有利于甜瓜蔓枯病的發(fā)生，在相同的利于發(fā)病的栽培環(huán)境中，來源于內陸干旱地區(qū)的甜瓜種質資源更容易感病，來源于沿海等潮濕地區(qū)的厚皮甜瓜因自然壓力的選擇積累遺傳，通常能夠適應潮濕的氣候環(huán)境，會對蔓枯病形成不同程度的抗敏反應。張學軍等 [17]對國內外190份甜瓜種質進行蔓枯病苗期篩選時，發(fā)現(xiàn)來源于中國新疆的甜瓜資源全部表現(xiàn)為高感。本試驗所用哈密瓜種質資源中抗性材料占比明顯低于網(wǎng)紋甜瓜和光皮甜瓜，來源于中國新疆的哈密瓜材料全部感病，達到抗、中抗級別的3份哈密瓜材料則分別來源于中國上海、中國江蘇和中國臺灣。參試的光皮甜瓜種質資源主要來源于日本和中國江蘇，其抗性材料占比較高，達到高抗、抗級別的材料占比達到11.11%。歐洲栽培厚皮甜瓜的歷史悠久，并擁有包括羅馬甜瓜、網(wǎng)紋甜瓜、冬甜瓜等在內的多類型、數(shù)量豐富的甜瓜種質資源。而本試驗所用的歐洲甜瓜種質資源僅16份，占材料總數(shù)的13.4%，篩選出抗蔓枯病材料1份。通過對厚皮甜瓜種質進行蔓枯病抗性評價，篩選出了能應用于抗性改良。同時具有優(yōu)良性狀的種質，對于從源頭上解決蔓枯病問題具有廣泛的應用價值。

3.2?厚皮甜瓜種質遺傳多樣性

多態(tài)性位點效率往往可以揭示不同種質材料間的遺傳多樣性。本研究從40個SNP位點中篩選出21個SNP位點設計引物組合，對124份甜瓜種質進行了分析，發(fā)現(xiàn)有12個位點的PIC值處于中度多態(tài)，PIC值平均為0.37，表明這些位點在甜瓜種質間多態(tài)性程度中等。同時，使用Structure軟件對供試甜瓜種質材料進行了基于數(shù)學模型的類群劃分，所劃分的5個群體材料各具遺傳特征。本方法主要基于模型，具有不過分依賴于遺傳距離、避免人為因素干擾等優(yōu)點，可以在不了解材料背景時，結合樣品的遺傳信息和額外的地理來源信息、表型性狀等對群體綜合分類，相比于遺傳距離可以更加真實地反映材料間在遺傳上的差異[18]。本研究劃分的5類群體，除了作為對照的薄皮甜瓜外，其他群體均為栽培種自交系，表明基因間有一定滲透性。這可能是有些最初來源相同的材料各自在不同生態(tài)環(huán)境栽培過程中，在分子水平上積累的遺傳變異所導致。

本試驗材料包括中國江蘇、中國上海、中國新疆、中國河南、中國臺灣、日本、美國、歐洲等15個不同地理來源的種質資源。Structure聚類分析能夠把部分種質資源的地理來源區(qū)分開來，如將甘肅材料、日韓（中國臺灣）材料、新疆和上海材料區(qū)分為3個組別，這些同一地理來源材料傾向于聚在一起，可能與同一地理來源材料間相對親緣關系比較近有關。日本、韓國、中國臺灣地區(qū)作為傳統(tǒng)的優(yōu)質厚皮甜瓜種質來源地，材料親緣關系也比較近，主要與其材料類型一致性較高有關，同時也表明不同地理來源甜瓜種質資源存在豐富的遺傳多樣性。通過對厚皮甜瓜種質資源進行遺傳多樣性分析，掌握高代自交系的遺傳多樣性和類群間的遺傳關系，能夠使育種思路更加清晰，育種目標更易實現(xiàn)，同時也為厚皮甜瓜核心種質構建、種質創(chuàng)制等工作提供了理論依據(jù)。

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（責任編輯：張震林）