高世代回交玉米矮稈種質(zhì)的轉(zhuǎn)錄組分析

王亞麗 陳煜東 王益軍

摘要：?株高影響株型建成，與抗倒性、收獲指數(shù)以及最終產(chǎn)量相關(guān)。對矮稈材料的研究有助于豐富對株高調(diào)控機理的認識。在前期研究中，對玉米矮稈材料D11的農(nóng)藝與生理特征進行了分析。本研究基于高世代回交群體，通過轉(zhuǎn)錄組測序，對矮稈材料D11的基因表達調(diào)控進行解析。與株高正常植株相比，矮稈材料中共檢測到2 537個差異表達的基因，其中1 120個基因表達上調(diào)、1 417個基因表達下調(diào)。功能注釋、GO富集、通路富集的結(jié)果表明，差異表達基因參與細胞延伸、細胞骨架功能、微管組織、葉綠體功能、植物激素合成代謝等。差異表達基因最顯著富集的通路與糖酵解相關(guān)。共表達分析結(jié)果表明，編碼果糖-1，6-雙磷酸酶的基因與多個差異表達基因存在功能關(guān)聯(lián)。該研究結(jié)果揭示了玉米矮稈材料中的基因表達調(diào)控，為后續(xù)玉米株高調(diào)控節(jié)點的發(fā)掘提供了參考。

關(guān)鍵詞：?矮稈;高世代回交群體;轉(zhuǎn)錄組測序;共表達;玉米

中圖分類號：?S513.035.3??文獻標(biāo)識碼：?A??文章編號：?1000-4440（2021）02-0280-09

Abstract：?Plant height affects plant type and is related to lodging resistance， harvest index and final yield. The research on dwarf plants helps to improve the understanding of plant height regulation mechanism. In previous studies， the agronomic and physiological characteristics of maize dwarf material D11 were analyzed. In this study， based on the advanced backcross population， the gene expression regulation of D11 was analyzed by transcriptome sequencing. A total of 2 537 differentially expressed genes （DEGs） were identified，including 1 120 up-regulated and 1 417 down-regulated DEGs. Functional annotation， GO enrichment and pathway enrichment analysis results indicated that DEGs were involved in cell expansion， cytoskeletal function， microtubule organization， chloroplast function， phytohormone homeostasis. The pathway most significantly enriched by DEGs was related to glycolysis. The gene encoding fructose-1，6-bisphosphatase was functionally related to several DEGs. The results of this study reveal the gene expression regulation in maize dwarf materials， and provide a reference for the subsequent exploration of maize plant height regulatory modes.

Key words：?dwarf plant;advanced backcross population;transcriptome sequencing;co-expression;maize

株高是重要的農(nóng)藝性狀，影響抗倒性、光合效率、收獲指數(shù)和最終產(chǎn)量?！熬G色革命”期間，產(chǎn)量的提高主要得益于株型與農(nóng)藝措施的改良。改良的高產(chǎn)品種具有半矮稈性狀、較高的氮肥同化效率、優(yōu)良的抗倒性[1]。控制高產(chǎn)品種半矮稈性狀的基因已被克隆。水稻的半矮稈基因semidwarf1 （sd1）編碼負責(zé)赤霉素合成的酶GA 20-oxidase2 （GA20ox2）[2-3]。小麥株高降低是由于Reduced height （Rht）基因的變異所導(dǎo)致，Rht編碼DELLA蛋白，參與赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]。“綠色革命”期間，半矮稈性狀主要是由于赤霉素合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變所導(dǎo)致。除了赤霉素，其他植物激素，例如生長素、油菜素內(nèi)酯、獨腳金內(nèi)酯等植物激素也與株高調(diào)控相關(guān)。生長素轉(zhuǎn)運異常導(dǎo)致玉米和高粱植株矮化[5]。玉米嚴(yán)重矮化表型是由于編碼油菜素內(nèi)酯合成酶brassinosteroid C-6 oxidase基因的突變所導(dǎo)致[6]。油菜素內(nèi)酯信號通路的改變同樣能導(dǎo)致玉米植株矮化[7]。植物激素獨腳金內(nèi)酯誘導(dǎo)豌豆幼莖伸長[8]。除了植物激素，表觀調(diào)控因子也影響株高。通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，調(diào)控玉米株高的表觀因子被發(fā)掘[9]。

玉米株高是由微效多基因控制的性狀[10]。通過連鎖分析、全基因組關(guān)聯(lián)分析，已有大量調(diào)控玉米株高的QTL/靶點被發(fā)掘[10-11]。其中，一些玉米株高QTL已被圖位克隆，例如qPH3.1、qph1[12-13]。QTL克隆是發(fā)掘玉米株高調(diào)控靶點的重要方法。通過玉米矮稈突變體研究，亦能為株高調(diào)控機制的解析提供重要參考。在前期研究中，實驗室鑒定到1份玉米矮稈材料Dwarf11 （D11），矮稈材料D11的農(nóng)藝性狀、生理特征已被初步分析[14]?；诟咄繙y序的轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，被用來研究植物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可用于SNP發(fā)掘、可變剪輯預(yù)測、融合轉(zhuǎn)錄本鑒定、基因表達分析等[15]。本研究采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，結(jié)合熒光定量PCR驗證、基因功能注釋、通路富集分析、共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等，對高世代回交D11矮稈群體的基因表達調(diào)控進行了分析，所得結(jié)果有助于解析矮稈基因D11介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也為后續(xù)玉米株高調(diào)控靶點的解析提供參考。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

矮稈材料D11與玉米自交系Mo17雜交，獲得F1代。通過連續(xù)5個世代的回交，獲得高世代回交群體BC5。在高世代回交群體BC5中，與株高正常植株相比，矮稈材料株高顯著降低。本研究采用高世代回交群體BC5中的株高正常植株與矮稈植株作為試驗材料。

1.2?RNA提取、文庫構(gòu)建與高通量測序

在高世代回交群體BC5中，取三葉期幼莖，采用RNeasy Plant Mini Kit （QIAGEN）試劑盒進行RNA提取。提取RNA的質(zhì)量與濃度用NanoDrop 2000 spectrophotometer、Agilent 2100 Bioanalyzer進行測定。mRNA通過帶有oligo（dT）的磁珠進行吸附。吸附的mRNA片段，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA末端修復(fù)，加腺嘌呤，連接接頭。連接產(chǎn)物進一步純化，用于PCR擴增?；厥?00～500 bp大小的產(chǎn)物，采用RNA Seq Library Preparation Kit進行文庫構(gòu)建。測序前，文庫質(zhì)量采用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System進行qPCR檢測。合格的文庫基于125 bp成對模式，在Illumina Hiseq2500 platform進行高通量測序。

1.3?差異表達基因發(fā)掘

對轉(zhuǎn)錄組測序獲得的原始序列，首先進行質(zhì)量控制。接頭序列、低質(zhì)量reads（含有超過50%低質(zhì)量堿基的reads、未知堿基數(shù)超過5%的reads、測序質(zhì)量低于10的低質(zhì)量堿基）被剔除。采用SOAPaligner/soap2，過濾后的reads比對到玉米參考基因組[16]。比對結(jié)果質(zhì)量控制后，采用Cufflinks進行轉(zhuǎn)錄本組裝[17]。通過計算每1×106 reads中來自于某基因每1 000堿基長度的reads數(shù) （RPKM），對基因表達量進行度量。本研究中，表達變化≥2、發(fā)現(xiàn)錯誤率（FDR）≤0.05的基因為差異表達基因。

1.4?差異表達基因生物信息學(xué)分析

差異表達基因功能注釋通過BLAST 進行。玉米基因功能注釋使用maizeGDB數(shù)據(jù)庫 （https：//www.maizegdb.org/）。水稻、擬南芥中差異表達基因的同源基因通過BLASTP獲得，所用數(shù)據(jù)庫分別為RGAP （http：//rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）與Araport （https：//www.araport.org/）。Gene ontology （GO）富集分析：首先基于Gene Ontology Consortium （http：//www.geneontology.org/） 數(shù)據(jù)庫，將差異表達基因比對到GO term[18]。確定每個GO term的差異表達基因數(shù)，超幾何分布檢驗用來發(fā)掘顯著富集的GO term。通過Bonferroni校正，獲得校正P值。校正P值小于0.05為差異表達基因顯著富集的GO term。通路富集分析采用KEGG 數(shù)據(jù)庫（http：//www.genome.jp/kegg/）進行[19]。校正P值小于0.05為差異表達基因顯著富集的通路。

1.5?熒光定量PCR分析

RNA樣品用RNase-free DNase I （QIAGEN） 處理，采用M-MLV reverse transcriptase （Promega）反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。采用SYBR qPCR master mix （TaKaRa），在7500 Real-Time PCR System （ABI）上進行熒光定量PCR。每個樣品重復(fù)3次。18S rRNA基因作為內(nèi)參基因。用2-△△Ct方法分析基因的相對表達量[20]。

2?結(jié)果與分析

2.1?高世代群體矮稈材料表型及基因表達分析

玉米矮稈材料D11與自交系Mo17雜交。通過連續(xù)5個世代的回交，獲得高世代回交群體BC5。在高世代回交群體BC5中，與株高正常植株相比，矮稈材料株高極顯著降低（圖1）。

為了發(fā)掘矮稈材料中差異表達基因，取高世代回交群體中株高正常植株與矮稈植株，進行轉(zhuǎn)錄組測序。通過對原始測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制、過濾，Clean reads比對到玉米參考基因組，對株高正常植株與矮稈植株中的基因表達進行分析。結(jié)果表明，在株高正常植株中檢測到超過30 000個基因的表達。在矮稈植株中檢測到近30 000個基因的表達（圖2）。

2.2?轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)掘差異表達基因

為了發(fā)掘矮稈材料中差異表達基因，比對的reads通過計算RPKM值對基因的表達量進行度量。通過比較株高正常植株和矮稈植株的基因表達量，進行差異表達基因發(fā)掘。本研究中，基因表達變化≥2、發(fā)現(xiàn)錯誤率≤0.05的基因被認為是差異表達基因。根據(jù)上述設(shè)定的閾值，共發(fā)掘到2 537個差異表達基因。與株高正常植株相比，其中1 120個基因在矮稈材料中表達量上升、1 417個基因在矮稈材料中表達量下降。

2.3?轉(zhuǎn)錄組測序揭示的差異表達基因的驗證

基于轉(zhuǎn)錄組測序揭示的差異表達基因，設(shè)計引物（表1），進行熒光定量PCR分析，對差異表達基因進行驗證。

采用2-△△Ct方法，對基因的表達量進行相對定量。差異表達基因熒光定量PCR與轉(zhuǎn)錄組測序表達量的決定系數(shù)（R2）為0.72（圖3）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄組測序獲得的差異表達基因可靠，由轉(zhuǎn)錄組測序獲得的差異表達基因可用于后續(xù)分析。

2.4?差異表達基因功能

對轉(zhuǎn)錄組測序揭示的差異表達基因，首先在maizeGDB數(shù)據(jù)庫中進行功能注釋。此外，發(fā)掘水稻、擬南芥中差異表達基因的同源基因。玉米數(shù)據(jù)庫中沒有功能注釋的差異表達基因，通過其水稻、擬南芥中的同源基因進行功能注釋。功能注釋的結(jié)果表明，差異表達基因參與多個生物學(xué)過程。基于矮稈材料表型，本研究集中分析可能與矮稈表型相關(guān)的差異表達基因。與株高正常植株相比，矮稈材料中與細胞伸長相關(guān)的ARF GTPase家族成員基因差異表達，與微管組織、細胞骨架、木質(zhì)素合成、維管束組織發(fā)育相關(guān)的基因差異表達。矮稈材料葉片變寬、微卷，通過轉(zhuǎn)錄組測序，檢測到與葉片發(fā)育相關(guān)的差異表達基因。例如，生長調(diào)節(jié)因子、MYB轉(zhuǎn)錄因子等。此外，矮稈材料葉緣白化。在矮稈材料中，與葉綠素合成、葉綠體功能相關(guān)的基因差異表達，例如編碼參與葉綠素合成Mg-螯合酶基因、編碼葉綠素a/b結(jié)合蛋白的基因、調(diào)控葉綠素降解的NAC轉(zhuǎn)錄因子基因等。差異表達基因還參與生長素、油菜素內(nèi)酯、細胞分裂素等植物激素的合成與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程（表2）。

本研究所用矮稈材料對外源赤霉素施用敏感。轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果表明，與株高正常植株相比，矮稈材料中與赤霉素合成代謝、信號通路相關(guān)的基因差異表達。與赤霉素合成相關(guān)的4個基因差異表達，包括上調(diào)的GA20ox5基因，下調(diào)的Dwarf1、dwarf3、KO1基因。與赤霉素代謝相關(guān)的2個GA2ox基因均下調(diào)表達。與赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的6個基因，包括赤霉素受體基因、F-box蛋白基因等，其中2個基因表達上調(diào)、4個基因表達下調(diào)。與赤霉素通路調(diào)控相關(guān)的5個基因，在矮稈材料中均下調(diào)表達（表3）。

2.5?差異表達基因GO與通路富集分析

基于Gene Ontology Consortium resource數(shù)據(jù)庫，對差異表達基因進行GO分析。設(shè)定了較嚴(yán)格的閾值（校正P值<0.05）用來發(fā)掘差異表達基因顯著富集的GO term。在生物學(xué)過程中，差異表達基因富集在碳水化合物合成代謝、光合作用等過程。在分子功能方面，差異表達基因最顯著富集的GO term與結(jié)構(gòu)組分相關(guān)。為了進一步分析差異表達基因參與的生物學(xué)通路，采用KEGG數(shù)據(jù)庫，對差異表達基因進行KEGG通路分析。與GO富集分析類似，校正P值<0.05作為顯著富集KEGG通路篩選的標(biāo)準(zhǔn)。KEGG通路富集的結(jié)果表明，差異表達基因最顯著富集的通路與糖酵解相關(guān)。差異表達基因可能參與糖的合成與代謝。此外，差異表達基因顯著富集的通路與RNA轉(zhuǎn)運、氨基酸合成、光合作用等過程相關(guān)（表4）。

2.6?差異表達基因共表達分析

共表達分析有助于發(fā)掘基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點，為后續(xù)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的深入解析提供參考。本研究對轉(zhuǎn)錄組測序揭示的差異表達基因進行了共表達分析。結(jié)果表明，Class I-like SAM-binding甲基轉(zhuǎn)移酶基因（ID： GRMZM2G064759）下調(diào)表達。在基因共表達網(wǎng)絡(luò)中，該基因與10個差異表達基因互作，包括DUF947結(jié)構(gòu)域蛋白基因（ID： GRMZM2G051197）、寡肽轉(zhuǎn)運類蛋白基因（ID： GRMZM2G434935）等。果糖-1，6-雙磷酸酶編碼蛋白基因（ID： GRMZM2G306732）上調(diào)表達，是共表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。該基因與多個差異表達基因功能相關(guān)，包括編碼纖維素-1，7-雙磷酸酶的shbp1基因、編碼磷酸核酮糖激酶基因（ID： GRMZM2G026024）等?；蚬脖磉_分析的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄組測序揭示的差異表達基因可能存在一定的功能關(guān)聯(lián)。

3?討論

本研究所用矮稈材料是田間自然突變所產(chǎn)生，表現(xiàn)為植株矮化。在前期研究中，對該矮稈材料的農(nóng)藝、生理特征進行了分析。結(jié)果表明，外源赤霉素施用可以使該矮稈材料的株高變高，表明該矮稈材料屬于赤霉素敏感型矮稈種質(zhì)[14]。本研究基于高世代回交種質(zhì)，通過轉(zhuǎn)錄組測序，對矮稈材料的基因表達調(diào)控進行了解析。采用高世代回交種質(zhì)，有利于降低遺傳背景對基因表達的影響，提高轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性。在高世代回交群體中，與株高正常植株相比，矮稈材料中共檢測到2 537個基因差異表達，其中1 120個基因上調(diào)表達、1 417個基因下調(diào)表達。差異表達基因功能注釋、GO富集、通路富集的結(jié)果表明，差異表達基因參與多個生物學(xué)過程，包括細胞延伸、微管組成、木質(zhì)素合成、葉綠素合成、葉綠體功能、植物激素合成與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。供試矮稈材料的矮化可能與細胞延伸的缺陷相關(guān)。葉綠素合成、葉綠體功能的異常，可能與矮稈材料的葉緣白化相關(guān)。木質(zhì)素合成的變化與矮稈材料莖稈質(zhì)地的改變相關(guān)[14]。不同生物學(xué)過程存在一定的關(guān)聯(lián)性。例如，植物激素赤霉素、生長素、油菜素內(nèi)酯、細胞分裂素、獨腳金內(nèi)酯等互作，協(xié)同調(diào)控了多個生物學(xué)過程[21-25]。此外，已有證據(jù)表明，植物激素赤霉素影響葉綠體的產(chǎn)生[26]。本研究轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，供試矮稈材料中存在著復(fù)雜的正向、反向、交叉基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進而影響矮稈材料的表型。

通過比較不同矮稈材料的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，可以發(fā)掘共有的、特異的差異表達基因，為矮稈基因介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析提供科學(xué)依據(jù)。通過檢索數(shù)據(jù)庫，未能獲得d1、d3、d5、br2、na2、bv1、D8、D9等玉米矮稈材料的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。通過將本研究獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫中玉米矮稈材料的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較分析，有助于發(fā)掘本研究矮稈材料中特異的差異表達基因，特異差異表達基因的發(fā)掘可以為供試矮稈材料基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析提供重要參考。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）