水牛Novel-miR-57對Bcap-37和BMECs細胞DOK4基因的調(diào)控作用

蔡小艷 李雅輝 鮑正潘 陳秋萍 李勝 周宇 鄧凱 石德順 劉慶友

摘要：【目的】篩選Novel-miR-57調(diào)控靶基因，并明確其對靶基因的調(diào)控作用及生物功能，為揭示水牛乳腺上皮細胞（BMECs）的分化機理提供科學依據(jù)?！痉椒ā坷肕iRscan預測Novel-miR-57二級結構;以自編軟件Ensembl（v80）注釋的水牛mRNA截取3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）作為預測數(shù)據(jù)庫，采用Miranda（v3.3a）對Novel-miR-57進行靶基因預測;運用實時熒光定量PCR篩選重點靶基因。以化學合成的Novel-miR-57模擬物Mimics和抑制劑Inhibitor，分別轉染人類乳腺癌細胞（Bcap-37）及BMECs細胞，以驗證Novel-miR-57與靶基因的表達相關性。【結果】Novel-miR-57前體序列形成7個莖環(huán)結構，成熟序列位于第1、2和3個莖環(huán)結構間，其結合自由能為-53.70 kcal/mol。以結合自由能低于-20.00 kcal/mol為標準，最終篩選出34個可能的靶基因，共與42條KEGG信號通路存在關聯(lián)，其富集的信號通路主要有代謝通路（ID：bta01100）、PI3K-Akt（信號通路（ID：bta04151）、MAPK信號通路（ID：bta04010）和細胞因子—細胞因子受體相互作用（ID：bta04060）等;經(jīng)實時熒光定量PCR檢測分析發(fā)現(xiàn)DLX3、CANCNG3、DOK4、NFKBID、C17orf53、RTN1和FBXO10等7個靶基因在非泌乳期的相對表達量極顯著高于泌乳期（P<0.01），二者間相差100.0倍以上，且與Novel-miR-57的相對表達量呈負相關。7個靶基因中僅DOK4基因與Novel-miR-57的表達具相關性，以200 nmol/L Inhibitor轉染B-cap37細胞能顯著提高DOK4基因表達（P<0.05，下同），添加100 nmol/L Mimics則顯著抑制DOK4基因表達。以100 nmol/L Mimics轉染BMECs細胞，Novel-miR-57和DOK4基因的相對表達量顯著提高;而以200 nmol/L Inhibitor轉染BMECs細胞，Novel-miR-57和DOK4基因的表達均受到顯著抑制?！窘Y論】Novel-miR-57含有7個莖環(huán)結構，且其成熟序列位于第1～3個莖環(huán)上。Novel-miR-57過表達可下調(diào)Bcap-37細胞DOK4基因表達或上調(diào)BMECs細胞DOK4基因表達，即Novel-miR-57對靶基因的調(diào)控作用因乳腺細胞生理狀態(tài)不同而存在差異。

關鍵詞： 水牛;Novel-miR-57;靶基因;BMECs細胞;Bcap-37細胞;調(diào)控作用

中圖分類號： S823.83? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）02-0269-11

Abstract：【Objective】In order to provide scientific basis for revealing the differentiation mechanism of buffalo mammary epithelial cells（BMECs）， the regulatory target gene of Novel-miR-57 was screened to clarify its regulatory function and biological function on target genes. 【Method】MiRscan was used to predict the secondary structure of Novel-miR-57. The target gene of Novel-miR-57 was predicted by Miranda（v3.3a） using buffalo mRNA truncated 3-untranslated region （3'-UTR） annotated by Ensembl（v80） as prediction database. Key target genes were screened by real-time fluorescence quantitative PCR. To verify the correlation between Novel-miR-57 and target gene expression， chemically synthesized mimics and inhibitor were transfected into human breast cancer cells（Bcap-37） and BMECs cells， respectively. 【Result】The precursor sequence of Novel-miR-57 formed seven stem-loops， and the mature sequence was located between the first， second and third stem-loops， and its binding free energy was -53.70 kcal/mol. With the binding free energy lower than -20.00 kcal/mol as the standard， 34 possible target genes were finally screened out， which were associated with 42 KEGG signaling pathways. The enriched signaling pathways mainly included metabolic pathway（ID：bta01100）， PI3K-Akt（ID：bta04151）， MAPK signaling pathway（ID：bta04010） and cytokine-cytokine receptor interaction （ID：bta04060）. The real-time fluorescence quantitative PCR showed that the relative expression of seven target genes，DLX3， CANCNG3， DOK4， NFKBID， C17orf53， RTN1 and FBXO10， were significantly higher in non-lactation period than in lactation pe-riod（P<0.01）， and the difference between them was more than 100.0 times， which were negatively correlated with the relative expression of Novel-miR-57. Only the expression of DOK4 gene was correlated with the expression of Novel-miR-57 among the seven target genes. Transfection of B-cap37 cells with 200 nmol/L inhibitor could significantly increase the expression of DOK4 gene（P<0.05， the same below）， while addition of 100 nmol/L mimics could significantly inhibit the expression of DOK4 gene. The relative expression of Novel-miR-57 and DOK4 gene was significantly increased when BMECs cells were transfected with 100 nmol/L mimics. The expression of Novel-miR-57 and DOK4 gene were significantly inhibited when BMECs cells were transfected with 200 nmol/L inhibitor. 【Conclusion】Novel-miR-57 contains se-ven stem-loops， and its mature sequence locates on the first to the third stem rings. Overexpression of Novel-miR-57 can down-regulate DOK4 gene expression in Bcap-37 cells or up-regulate DOK4 gene expression in BMECs cells， that is， Novel-miR-57 has different regulating effects on target genes due to different physiological states of breast cells.

Key words： buffalo; Novel-miR-57; target gene; BMECs cell; Bcap-37 cell; regulating effects

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31960680）; Ningxia Key Research and Development Project（2018BEB04031）

0 引言

【研究意義】microRNAs（miRs）是一類約22 bp的非編碼小分子RNA，大量存在于哺乳動物體內(nèi)（李新云等，2017）。miRs通過與靶mRNA分子的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）不完全結合以抑制或降解mRNA翻譯（Stark et al.，2005），進而調(diào)控細胞的發(fā)育、分化及增殖等重要生命活動過程（王塑天等，2013;Jiao et al.，2019）。miRs還參與乳腺發(fā)育，包括維持乳腺上皮前體細胞、促使乳腺上皮管道長出及促進乳腺上皮細胞增殖分化等（Wang et al.，2018）。因此，研究miRs對乳腺細胞基因的調(diào)控作用及其功能，可為揭示乳腺泌乳機制和提高泌乳性能奠定基礎。【前人研究進展】目前，有關miRs的研究主要集中在功能調(diào)控和作用機理等方面，如miR-103通過靶向PANK3（Pantothenate kinase 3）調(diào)控水牛乳脂代謝（蔡小艷，2016）;miR-200b通過負調(diào)控靶基因Pten（Phosphatase and tensin homologue）表達而正調(diào)控奶牛乳腺泌乳（邊艷杰等，2018）;miR-183通過靶向MST1（Mammalian sterile 20-like kinase 1）基因來調(diào)節(jié)山羊奶中脂肪的消化吸收、合成及分解（Chen et al.，2018）;miR-3880通過與奶山羊乳腺上皮細胞OGR1（Ovarian cancer G protein-coupled receptor 1）基因3'-UTR結合而調(diào)控其mRNA和蛋白的表達（侯金星等，2019）;miR-4312通過靶向PDCD4（Programmed cell death protein 4）以促進細胞增殖和抑制細胞凋亡（苑紅，2019）;miR-221通過靶向STAT5a（Signal transducer and activator of transcription 5A）和IRS1（Recombinant insulin receptor substrate 1）基因調(diào)控牛乳腺上皮細胞增殖（Jiao et al.，2019）;miR-92a具有調(diào)控奶山羊乳腺發(fā)育和泌乳性能的潛能（包黎娟等，2020）;miR-28-3p能促進三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-468（人乳腺癌細胞）的增殖、侵襲和抑制其凋亡（李杰等，2020）;miR-380-5p能抑制乳腺癌細胞增殖和促進乳腺癌細胞凋亡（孫云菊等，2020）。此外，有少數(shù)學者針對測序新發(fā)現(xiàn)miRs的靶基因及其功能進行研究。崔曉鋼等（2015）基于物種間序列同源比對新發(fā)現(xiàn)44條牛候選miRs，選取其中4條進行實時熒光定量PCR驗證，并預測對應的靶基因，但尚未進一步研究其調(diào)控功能。郭麗霞（2017）基于高通量技術從5頭黃牛和5頭水牛的大腦組織中測序獲得Novel-miR-25和Novel-miR-13，并證實二者均能調(diào)控大腦功能及神經(jīng)元的分化和發(fā)育。臧樹成等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，處于冷應激狀態(tài)下大鼠肝臟中的Novel-miR-133-5p異常上調(diào)，可能對機體的生長發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)及遺傳等有重要影響。練雨（2019）對經(jīng)脂多糖（LPS）處理的豬子宮內(nèi)膜上皮進行測序，結果發(fā)現(xiàn)Novel-mir-106-5p能抑制NF-tB激活，降低NF-tB磷酸化水平。Li等（2020）從96 條日本牙鲆miRs中篩選出pol-miR-novel-171，并證實其靶向負調(diào)控FAM49B（Family with sequence similarity 49，member B）的3'-UTR。張月（2020）研究表明，奶山羊乳腺中的Novel-miR-3880可通過PI3K/AKT/mTOR/S6Kl和Bcl-2/Bax通路調(diào)節(jié)乳腺上皮細胞細胞生長、乳脂合成和乳酪蛋白分泌，進而促進乳腺發(fā)育。【本研究切入點】盡管目前已有較多關于miRs調(diào)控牛和水牛乳腺基因表達的研究，但針對水牛乳腺組織新發(fā)現(xiàn)miRs的調(diào)控基因研究鮮見報道。本課題組前期基于Solexa高通量測序和實時熒光定量PCR，在創(chuàng)建的miRs文庫中發(fā)現(xiàn)并鑒定出5個新的水牛miRs表達模式（蔡小艷等，2017a，2017b），其中Novel-miR-57在水牛泌乳期和非泌乳期的表達量差異極顯著，是5個新發(fā)現(xiàn)水牛miRs中差異最明顯的miRs（Cai et al.，2017），因此深入研究Novel-miR-57對揭示水牛乳腺細胞的泌乳作用機制具有重要意義?！緮M解決的關鍵問題】通過MiRscan預測Novel-miR-57二級結構，以化學合成的Novel-miR-57模擬物Mimics和抑制劑Inhibitor分別轉染人類乳腺癌細胞（Bcap-37）及水牛乳腺上皮細胞（BMECs），篩選其調(diào)控靶基因，并明確Novel-miR-57對靶基因的調(diào)控作用及生物功能，以期為揭示BMECs細胞的分化機理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

水牛乳腺組織采自廣西南寧市屠宰場，一般于凌晨2：00—4：00時采集;泌乳期樣本為可明顯觀察到有白色乳液一直流出的乳腺組織，非泌乳期樣本是無法從表面上看出有白色乳液流出，且用手按壓后也無乳液流出的乳腺組織。2種乳腺組織樣本各3個重復，以生理鹽水清洗干凈后，立即使用消毒眼科手術剪在所有樣本的組織內(nèi)部取樣1.0～2.0 g，裝入2 mL的EP管中，然后立即將其放進液氮罐，帶回實驗室置于-80 ℃冰箱保存。BMECs細胞為亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室分離獲得;Bcap-37細胞由亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室保存提供。DMEM培養(yǎng)基、FBS和Lipo2000轉染試劑購自Life Technology公司;一步快速反轉試劑盒購自TaKaRa公司;熒光定量SYBR Green Master和Mix羅氏轉染試劑購自瑞士Roche公司。儀器設備主要有CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）、低溫離心機（Beckman公司）及熒光定量PCR儀等（蔡小艷等，2016）。

1. 2 Novel-miR-57二級結構預測

登錄MiRscan（http：//genes.mit.edu/mirscan/），輸入Novel-miR-57基因序列，單擊Submit即可獲得結果（劉長征和余佳，2012;王偉等，2019）。

1. 3 引物設計與合成

采用Primer 3.0進行PCR擴增引物設計，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。Novel-miR-57的莖環(huán)反轉錄引物為5'-GTCGTATCCAGTG CAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCGGTC-3'，U6的逆轉錄引物為5'-CGCTTCACGA ATTTGCGTGTCAT-3';Novel-miR-57的實時熒光定量PCR上游引物為5'-GGAAATACCGGCACGAGA C-3'，下游引物為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3';內(nèi)參基因U6的實時熒光定量PCR上游引物為5'-CTC GCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCT TCACGAATTTGCGT-3'。Novel-miR-57預測靶基因的實時熒光定量PCR擴增引物見表1。

1. 4 實時熒光定量PCR

參照蔡小艷等（2016）的方法，將0.1 g乳腺組織置于研缽中，倒入液氮迅速研磨，加入TRIzol試劑進行總RNA提取;提取獲得的總RNA采用紫外分光光度計測定其濃度，并以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。使用AMV試劑盒（TaKaRa）反轉合成cDNA：反應液配制均在冰上操作，依照AMV試劑盒說明加入各種試劑進行反轉錄。將反轉錄合成的cDNA稀釋至100 ng/mL，實時熒光定量PCR反應體系20.0 μL： cDNA模板1.0 μL，SYBR GreenMaster 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，無RNA酶水8.4 μL。擴增程序：95 ℃預變性10 min;95 ℃ 15 s，60～55 ℃ 1 min，進行40個循環(huán)，收集熒光。每個樣品設3個重復，以U6基因為Novel-miR-57的內(nèi)參基因。

1. 5 靶基因預測

因水牛全基因組尚未公布，故以Ensembl（v80）注釋的水牛mRNA截取3'-UTR作為預測數(shù)據(jù)庫，采用Miranda（v3.3a）對Novel-miR-57進行靶基因預測，篩選出結合自由能小于-20 kcal/mol的3'-UTR，即獲得有關Novel-miR-57靶基因總數(shù)。

1. 6 化學合成Novel-miR-57的Mimics和Inhibitor轉染Bcap-37細胞和BMECs細胞Novel-miR-57 Pri序列為：CACTCAGAGATAA GAGGCTGGGTTCGACTGGGAGAGGATGCAAGTTTCAGGCTAAATACCGGCACGAGACCGATAGTCAACAAGTACCATAAGGGAAAGTTGAAAAGAACTTTGAGATGGTACGTGTGCATGCTAGAGGAACCGTTGCTGTATTAATGAAAGGGCACCTGGCACGTGGAAACACCCCTAAGATGTTCATT。

根據(jù)其成熟序列化學合成Novel-miR-57的Mi-mics（正義鏈：5'-AAAUACCGGCACGAGACCGA-3'，反義鏈：5'-UCGGUCUCGUGCCGGUAUUU-3'）和Inhibitor（5'-UCGGUCUCGUGCCGGUAUUU-3'），以及Mimics對照（MNC）序列（正義鏈：5'-UUUGUA CUACACAAAAGUACUG-3'，反義鏈：5'-CAGUAC UUUUGUGUAGUACAAA-3'）和Inhibitor對照（INC）序列（5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA-3'）。參照Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）試劑說明轉染Bcap-37細胞和BMECs細胞。于直徑60 mm的Bcap-37細胞培養(yǎng)皿中分別加入50、75和100 nmol/L Mimics及200 nmol/L Inhibitor，并設空白對照組（NC）;根據(jù)Bcap-37細胞的轉染結果，分別以100 nmol/L Mimics和200 nmol/L Inhibitor轉染BMECs細胞，采用實時熒光定量PCR檢測Novel-miR-57和靶基因的表達情況。

1. 7 統(tǒng)計分析

實時熒光定量PCR檢測結果采用2-△△Ct法進行換算，然后以SPSS 19.0進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2. 1 Novel-miR-57二級結構預測結果

前體莖環(huán)結構是miRNA的主要特征之一，且miRNA的二級結構會影響其加工及成熟miRNA進入不同AGO（Argonaute）蛋白質(zhì)，因此本研究通過MiRscan對Novel-miR-57的二級結構進行預測分析，結果如圖1所示。Novel-miR-57前體序列（黑色）形成7個不一樣的小莖環(huán)，其成熟序列位于第1、2和3個莖環(huán)間的核苷酸序列（紅色）上。Novel-miR-57的結合自由能為-53.70 kcal/mol。

2. 2 Novel-miR-57靶基因預測結果

miRNA主要通過結合與調(diào)控靶基因?qū)崿F(xiàn)其生理功能，故使用Miranda（v3.3a）預測Novel-miR-57的靶基因，挑選出結合自由能低于-20.00 kcal/mol的所有靶基因，最終篩選出34個可能的靶基因（表2），經(jīng)基因資料搜索及信號通路分析，然后篩選部分代表靶基因進行實時熒光定量PCR檢測分析。

2. 3 Novel-miR-57靶基因的GO功能注釋及KEGG信號通路富集分析結果

使用GO數(shù)據(jù)庫比對分析Novel-miR-57靶基因，最終獲得729個相關類別（Term），其中有89個類別的P<0.05，有2個類別的P<0.01，分別是水解酶活性和線性酰胺中碳—氮鍵（非縮氨酸）（GO：0016811）及細胞內(nèi)信號轉導負調(diào)控（GO：1902532）。將預測篩選獲得的34個靶基因輸入KEGG數(shù)據(jù)庫，進行系統(tǒng)的KEGG信號通路富集分析，結果發(fā)現(xiàn)這些靶基因與42條KEGG信號通路存在關聯(lián)，其富集的信號通路主要有代謝通路（Metabolic pathways，ID：bta01100）、PI3K-Akt（磷脂酰肌醇三激酶—蛋白激酶B或PKB）信號通路（ID：bta04151）、MAPK（Mitogen-activated protein kinase）信號通路（ID：bta04010）和細胞因子—細胞因子受體相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction，ID：bta04060）等。

2. 4 靶基因的實時熒光定量PCR檢測分析結果

針對34個預測靶基因進行實時熒光定量PCR檢測分析，結果發(fā)現(xiàn)在所有乳腺組織中有5個靶基因的相對表達量較低。對比各靶基因在泌乳期和非泌乳期的相對表達量，發(fā)現(xiàn)有11個靶基因（圖2）在泌乳期的相對表達量相當或顯著高于非泌乳期（P<0.05，下同），有10個靶基因（圖3）在非泌乳期的相對表達量相當或顯著高于泌乳期;而DLX3（Distal-less homeobox 3）、CACNG3（Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 3）、DOK4（Downstream of tyrosine kinase/docking protein）、NFKBID（NFKB inhibitor delt）、C17Orf53（Chromosome 17 open reading frame 53）、RTN1（Isoform RTN1-C）和FBXO10（F-box protein 10）等7個靶基因（圖4）在非泌乳期的相對表達量極顯著高于泌乳期（P<0.01），二者間相差100.0倍以上，且與Novel-miR-57的相對表達量呈負相關，故將其列為靶向基因的重點篩選對象。

2. 5 靶基因在Bcap-37細胞上的驗證結果

實時熒光定量PCR檢測結果（圖5）表明，僅DOK4基因與Novel-miR-57的表達具相關性，添加Novel-miR-57的Inhibitor能顯著提高DOK4基因表達，加入100 nmol/L Mimics則顯著抑制DOK4基因表達。

2. 6 轉染Mimics和Inhibitor對BMECs細胞Novel-miR-57表達的影響

由圖6可知，以100 nmol/L Mimics轉染BMECs細胞，Novel-miR-57的相當表達量顯著高于其對照組（MNC）;而添加200 nmol/L Inhibitor后Novel-miR-57的相對表達量顯著低于其對照組（INC），說明Novel-miR-57轉染成功，達到預期效果。

2. 7 轉染Mimics和Inhibitor對BMECs細胞DOK4基因表達的影響

由圖7可知，以100 nmol/L Mimics轉染BMECs細胞，DOK4基因的相對表達量顯著提高;而以200 nmol/L Inhibitor轉染BMECs細胞，DOK4基因的表達受到顯著抑制。綜合轉染Mimics和Inhibitor對BMECs細胞Novel-miR-57表達的影響可知，Novel-miR-57在BMECs細胞中對DOK4基因表達呈正調(diào)控作用。

3 討論

miRs對乳腺組織起重要的調(diào)控作用，可影響乳腺發(fā)育，包括維持乳腺上皮前體細胞、促使乳腺上皮管道長出及促進乳腺上皮細胞增殖分化等（Wang et al.，2018;Zheng et al.，2019），其相關研究主要集中在已知miRs的靶向基因挖掘及其功能探析等方面，如miR-27a通過靶向PPAR-γ（Peroxisome proliferato-ractivated receptor gamma）調(diào)控甘油三酰合成（Tang et al.，2017），miR-146通過靶向TRAF6（TNF receptor associated factor 6）和HMG（High mobility group）調(diào)控乳腺上皮細胞炎癥因子（Wang et al.，2017），miR-454通過靶向PPAR-γ調(diào)控牛乳腺上皮細胞甘油三酯合成（Zhang et al.，2018）。崔曉鋼等（2015）雖然從新發(fā)現(xiàn)的44條牛候選miRs中選取4條進行實時熒光定量PCR驗證，并預測對應的靶基因，但尚未深入研究靶基因的功能。Novel-miR-57是本課題組從水牛體內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的miRs，在水牛泌乳期和非泌乳期的表達量差異極顯著，在其功能研究過程中尚存在諸多未知問題和難題。一是Novel-miR-57二級結構尚屬于預測階段，無法確定其二級結構是否會影響miRs加工及成熟miRs進入不同的AGO蛋白質(zhì)（張偉等，2020）;二是在預測Novel-miR-57靶基因時，由于水牛全基因組尚未公布，因此只能使用自編軟件Ensembl（v80）注釋的水牛mRNA截取3'-UTR作為預測數(shù)據(jù)庫，而導致靶基因預測數(shù)量相對較少;三是驗證Novel-miR-57靶基因時由于缺乏相關的參考資料，只能將已篩選出的34個靶基因全部進行實時熒光定量PCR檢測分析，最后在細胞水平僅發(fā)現(xiàn)DOK4基因與Novel-miR-57存在表達相關性，而以往的研究發(fā)現(xiàn)單個miRs可調(diào)控多個靶基因表達（吳寧昭，2017;袁茂等，2019），因此對于Novel-miR-57的靶基因及功能作用尚有待進一步研究。

本研究結果表明，僅DOK4基因與Novel-miR-57的表達具相關性，且Novel-miR-57在BMECs細胞中對DOK4基因表達呈正調(diào)控作用，即Novel-miR-57的靶基因是DOK4基因。DOK4為酪氨酸激酶下游分子（Win et al.，2018），是細胞膜中的適配器及支架蛋白的組成成分，由15406個氨基酸殘基組成，定位于反義鏈上，同時是胰島素受體底物（Cai et al.，2003;Hooker et al.，2012），涉及多個信號通路，包括GDNF-家族配體和受體互作等。已有學者在靈長類動物和牛的乳腺細胞中預測到DOK4b基因，被視為酪氨酸激酶發(fā)送信號的抑制劑（Zhang et al.，2020）。此外，DOK4的mRNA和蛋白大量存在于多種上皮細胞中，對上皮細胞的分化有一定影響，由此推測DOK4基因受Novel-miR-57表達調(diào)控，進而影響上皮細胞分化。DOK4還可能與下游效應分子一起作用，然后與Ret（RET proto-oncogene）的1062Tyr結合，且Shc（Generic shell script compiler）及其他效應器分子也會競爭性與Ret的1062Tyr結合，并根據(jù)細胞環(huán)境不同而改變對Elk/Elk-1的激活作用。在Caco-2細胞系中，DOK4基因的作用是防止Ret介導的Elk-1信號通路被激活，但該作用在293T細胞中較弱（Grimm et al.，2001;Itoh et al.，2005;Guittard et al.，2018），具體作用機制還需進一步探究。

大部分動物的miRs與靶基因結合后會下調(diào)基因表達（汪劼，2016），但在近年來的相關報道中發(fā)現(xiàn)動物miRs呈正調(diào)控或去抑制作用，即在少數(shù)動物中miRs能促進靶基因上調(diào)表達。Vasudevan等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，miRs既可降低靶基因表達，又能促使靶基因執(zhí)行活化功能。當細胞處于休眠期時，miRs能上調(diào)基因表達;當細胞處于循環(huán)/增殖期時，miRs則抑制基因表達（Vasudevan et al.，2008），且這種作用與ARE（AU rich element）（富含腺嘌呤/尿嘧啶原件）相關。ARE是一種活化miRs翻譯的信號，能與AGO、FXRP（Fragile X retardation-1 protein）等miRISC復合物結合，而影響miRs翻譯及上調(diào)基因表達。von Roretz和Gallouzi（2008）研究表明，ARE對miRs介導的mRNA衰減調(diào)控有一定影響。此外，miRs的表達具有細胞特異性，當miR-24在抑制胃癌的BCL2L11細胞中表達時，能促進細胞生長，減少細胞凋亡（Zhang et al.，2016）;而在下調(diào)肝癌的Bcl-2細胞內(nèi)，miR-24表現(xiàn)為促進細胞凋亡（楊鵬等，2019）。因此，Novel-miR-57是否通過類似機制對DOK4基因進行調(diào)控有待進一步探究。Guittard等（2018）研究表明，通過引入外源性siRNA干擾，可同時抑制Caco-2細胞中的DOK4基因和DOK4b基因表達，但對α-管蛋白無任何影響。本研究也發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性Novel-miR-57可下調(diào)DOK4基因表達，為后期揭示Novel-miR-57在其他細胞系中的功能作用提供了參考依據(jù)。

4 結論

Novel-miR-57含有7個莖環(huán)結構，且其成熟序列位于第1～3個莖環(huán)上。Novel-miR-57過表達可下調(diào)Bcap-37細胞DOK4基因表達或上調(diào)BMECs細胞DOK4基因表達，即Novel-miR-57對靶基因的調(diào)控作用還因細胞生理狀態(tài)不同而存在差異。

參考文獻：

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（責任編輯 蘭宗寶）