橫梗霉產(chǎn)酯化酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)

鐘利明，曹新志，李書源，張鍇正，胡琴

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川自貢 6430001）（2.宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644007）

大曲中的微生物的種類非常多，在其中有許多重要的產(chǎn)酯化酶的菌其中包括霉菌，在乙醇和己酸反應(yīng)時(shí)的時(shí)候使用酯化酶進(jìn)行催化合成己酸乙酯[1]。乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酯[2]都是呈香物質(zhì)。酯類物質(zhì)在窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程中生成所需要的時(shí)間較長(zhǎng)[3]，所以我們使用酶法發(fā)酵就可以使得反應(yīng)的轉(zhuǎn)換率更高，還可以使得反應(yīng)的副產(chǎn)物更加的少[4]。通過(guò)篩選代謝活力高的產(chǎn)酯化酶菌株，提高己酸乙酯的生成，進(jìn)而達(dá)到優(yōu)化酒質(zhì)、縮短發(fā)酵周期的目的[5]。現(xiàn)在的大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是研究的紅曲霉、酵母的使用以及各種條件的優(yōu)化和其他應(yīng)用。研究表明，可以產(chǎn)生酯化酶的微生物有霉菌、酵母、細(xì)菌中均有存在。來(lái)源不同的酯化酶其性質(zhì)不同，會(huì)被濃度，反應(yīng)的底物影響[6]。因此，探索純化酯化酶的分離純化及酯化酶的酶學(xué)性質(zhì)，就能有針對(duì)性讓酯化酶技術(shù)更好的為白酒生產(chǎn)服務(wù)[7]。

在中國(guó)的白酒市場(chǎng)上銷量以及產(chǎn)量濃香型白酒占據(jù)了70%左右。由于在濃香型白酒的生產(chǎn)過(guò)程中需要窖泥中許多的微生物參與其中并且相互作用，在釀造濃香型白酒的過(guò)程當(dāng)中使用固態(tài)、厭氧半自然發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)[8]。濃香型白酒在窖內(nèi)發(fā)酵進(jìn)行的時(shí)候，生產(chǎn)周期較長(zhǎng)的酯類[9]，由于產(chǎn)生酯類的轉(zhuǎn)化率高，所以酯化酶有著廣泛的運(yùn)用[10]。研究酯化酶在濃香型白酒中的應(yīng)用可以提升白酒品質(zhì)為其他研究奠定基礎(chǔ)[11]。

本實(shí)驗(yàn)選取在五糧液大曲中經(jīng)過(guò)嚴(yán)格篩選得到的一株高產(chǎn)酯化酶的橫梗霉進(jìn)行研究，研究該橫梗霉發(fā)酵液產(chǎn)生的酯化酶，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分離純化得到高純度的酯化酶，純化過(guò)程首先進(jìn)行硫酸銨鹽析沉淀，然后是透析之后在離心，最后進(jìn)行離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析，經(jīng)過(guò)這一系列的純化步驟之后得到純度較高的酯化酶，對(duì)純化以后的酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究，為酯化酶在濃香型白酒的研究應(yīng)用當(dāng)中提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

橫梗霉：從五糧液大曲中分離篩選，結(jié)合霉菌的菌落的形態(tài)特征以及分子生物學(xué)鑒定得到產(chǎn)酯化酶的菌株為橫梗霉。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：橄欖油1.0，蛋白胨1.0，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O 0.05，KCl 0.05，F(xiàn)eSO40.001，(NH4)2SO40.2。

1.2 方法

1.2.1 橫梗霉發(fā)酵

使用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)12 h的菌株，恒溫培養(yǎng)，溫度為28 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/m，96 h后過(guò)濾發(fā)酵液，得到發(fā)酵酶液。

1.2.2 硫酸銨沉淀

飽和條件下，于10 mL粗酶液中分別加入（0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）的硫酸銨，冰浴條件下輔以磁力攪拌[12]。將鹽析后的發(fā)酵液，在轉(zhuǎn)速5000 r/min的轉(zhuǎn)速下低速離心15 min，取沉淀將沉淀置于pH為7.0的PB緩沖液（20 mmol/L）中反應(yīng)，反應(yīng)后測(cè)量酶活大小。在所有濃度的硫酸銨反應(yīng)之后，使用最優(yōu)的濃度進(jìn)行硫酸銨鹽析，并取鹽析后的酶液進(jìn)行下一步的純化。

1.2.3 透析

鹽析以后的酶液加入到處理好的透析袋當(dāng)中，加入緩沖液在冰浴條件下復(fù)議磁力攪拌進(jìn)行透析，在透析的時(shí)候需要每2.5 h更換一次緩沖液，在7.5 h后停止透析[13]。

1.2.4 透析袋的處理

裁剪透析袋，在Na2HCO3（10 mmol/L）和乙二胺四乙酸二鈉（1 mmol/L）放入裁剪好的透析袋煮沸，15 min后，用蒸餾水清洗干凈。

1.2.5 粗酶液的濃縮

取15 mL透析之后的酶液倒入超濾離心管（截流量5000 u），在轉(zhuǎn)速為4000 r/min低速離心25 min后，繼續(xù)使用截流液，繼續(xù)進(jìn)行離心，到截流液的體積為最小的時(shí)候停止[14]。

將得到的最后的截流液經(jīng)過(guò)濾膜（0.45 μm）過(guò)濾去除一部分的雜質(zhì)。

1.2.6 離子交換層析

選用DEAE纖維素-52層析柱進(jìn)行陰離子層析，來(lái)分離酯化酶粗酶，280 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光光度，步驟如下所示：

a平衡：平衡液流速為1 mL/min，8倍柱體積的平衡緩沖液沖洗，直到紫外和導(dǎo)電的基線穩(wěn)定為止。

b上樣：柱子平衡后用Loop自動(dòng)進(jìn)樣，上樣前樣品需經(jīng)0.22 μm濾頭過(guò)濾除雜。為了使樣品能夠與填料充分融合，樣品上柱前需要進(jìn)行鹽析處理并降低上樣流速至0.5 mL/min。

c洗脫：上樣完后，繼續(xù)洗脫，到基線穩(wěn)定，以上過(guò)程流速皆為1 mL/min。

d清洗：每次使用完后，使用1 mol/L的NaOH溶液洗脫5~10倍柱體積，去除結(jié)合牢固的雜質(zhì)，再使用去離子水洗脫至基線平穩(wěn)，用2 mol/L的NaCl溶液沖洗10倍柱體積對(duì)Q柱進(jìn)行復(fù)性處理，去離子水沖洗至電導(dǎo)平穩(wěn)后即可用20%的乙醇沖洗。

1.2.7 凝膠過(guò)濾層析

凝膠過(guò)濾層析Sephadex G-75（Φ1.6×50 cm）在加入酯化酶樣品以前使用Tis-HCl緩沖液（0.05 mol/L pH 8.2）流速為0.3 mL/min進(jìn)行平衡。將處理平衡好的層析柱中加入2 mL含酯化酶樣品經(jīng)過(guò)超濾濃縮以后倒入層析柱，用0.05 mol/L pH 8.2的Tis-HCl緩沖液洗脫，并測(cè)定其酶活，合并活性洗脫峰后備用[15]。

1.2.8 酶活測(cè)定-紫外分光光度法

緩沖液：在0.02 mol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中加入0.001%阿拉伯膠混合溶解。

底物溶液：3 mg棕櫚酸對(duì)硝基苯酯加入到1 mL異丙醇攪拌溶解，再進(jìn)行超聲溶解1 min。

測(cè)定方法：將50 μL底物溶液和400 μL緩沖液攪拌混合均勻，溫度為50 ℃下預(yù)熱5 min，然后再加0.5 mL 0.5 mol/L碳酸鈉溶液，空白對(duì)照組加入失去酶活的酶液。測(cè)量三次取平均值。

定義：1 min、1 mL的底物溶液釋放1 μmol對(duì)硝基苯酚，為一個(gè)酶活單位，計(jì)算方法如下[16]：

式中：U：酶活力；K：摩爾吸光系數(shù)；b：吸收層厚度；t：反應(yīng)時(shí)間；v：反應(yīng)體系體積。

1.3 酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.3.1 酯化酶最適溫度

分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃，pH 7.0的條件下測(cè)定其反應(yīng)活力，比較得出最適的酯化酶反應(yīng)溫度。

1.3.2 酯化酶的溫度穩(wěn)定性

分別將酶液（45 μg/mL）在20~60 ℃溫度范圍內(nèi)放置反應(yīng)一定的時(shí)間，一定時(shí)間內(nèi)保溫后測(cè)定殘留的酯化酶活性，測(cè)定方法同上。

1.3.3 酯化酶的最適pH

選擇pH 3.0~8.0（3、4、5、6、7、8）Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液，50 ℃預(yù)熱5 min后測(cè)定反應(yīng)混合物中的酶活，比較得出最適的酯化酶反應(yīng)pH。

1.3.4 酯化酶的pH穩(wěn)定性

將酶液置于20 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液（pH 3.0~7.0）中，均勻混合，50 ℃恒溫保存一定時(shí)間后測(cè)定殘留活性。

1.3.5 金屬離子對(duì)酯化酶的影響

分別用pH 5.0 20 mmol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液配制2 mmol/L金屬離子（Fe2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Ca2+），再將酶液與緩沖液混合，50 ℃保溫30 min檢測(cè)酶活，不同金屬對(duì)活力的影響。對(duì)照組不加入金屬離子。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，將各個(gè)指標(biāo)用SPSS進(jìn)行方差分析(ANOVA)，用多重比較法分析差異顯著性，其中p<0.05表示差異顯著。使用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 純化

2.1.1 硫酸銨沉淀

于50 mL的發(fā)酵液中添加不同飽和度的硫酸銨，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，進(jìn)行鹽析沉淀，將發(fā)酵液與硫酸銨溶液混合。將反應(yīng)后的反應(yīng)液進(jìn)行離心，將離心后的溶液去除上清液，加入磷酸緩沖液，計(jì)算測(cè)量酶活。在酶的純化過(guò)程當(dāng)中其他的雜蛋白會(huì)對(duì)酯化酶的純化造成影響，所以本次實(shí)驗(yàn)將采用分級(jí)沉淀的方法進(jìn)行鹽析。由圖1可知上清液的酶活力最適宜的是范圍是20%~40%，由此可以推斷雜蛋白開始發(fā)生沉淀是在濃度為20%時(shí)的硫酸銨溶液，隨著硫酸銨的濃度不斷變大雜蛋白的不斷析出。將雜蛋白析出后繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)。硫酸銨的濃度不斷升高，析出目的酶，導(dǎo)致了酶活力降低。因此選擇40%進(jìn)行后續(xù)的研究。由于在發(fā)酵液當(dāng)中有著很多其他的雜蛋白，這些雜蛋白對(duì)之后的酯化酶的純化會(huì)產(chǎn)生影響，需要使用分級(jí)沉淀，由于前期雜蛋白被析出之后，后期的酶活力取出來(lái)雜蛋白的影響，所以酶活力才會(huì)保持在較高的值，但是過(guò)高的飽和度在將雜蛋白析出之后，會(huì)繼續(xù)將目標(biāo)的酯化酶也析出，所以選取過(guò)大的飽和度并不適宜，因此選擇40%的飽和度為最適宜的鹽析濃度，再后續(xù)研究中使用。

圖1 硫酸銨沉淀最適飽和度Fig.1 Optimal saturation of ammonium sulfate precipitation

2.1.2 DEAE-纖維素52

將100 mL濃縮液中的不溶物離心去掉，再進(jìn)一步純化。離子交換柱：DEAE-Sepharose Fast Flow。繪制層析曲線如圖2。

由圖2可知，Tris緩沖洗脫液（0.01 mol/L）能洗脫多于或?yàn)橐环N的微量蛋白組分。使用0~1mol/L NaCl溶液洗脫出來(lái)兩種蛋白。通過(guò)對(duì)洗脫出的蛋白酶活檢測(cè)得到，除第二洗脫峰外均沒有活性，即DEAE-52離子交換色譜介質(zhì)能有效吸附酯化酶，使其與雜蛋白分離。兩吸收峰能基本重疊，且峰型達(dá)到對(duì)稱狀態(tài)，基線約為0，及此時(shí)的目標(biāo)蛋白具有較高的純度。劉瑞娟[17]等人研究堿性脂肪酶時(shí)發(fā)現(xiàn)使用DEAESepharose Fast Flow離子交換層析的時(shí)候具有三個(gè)洗脫峰且第三個(gè)洗脫峰具有活性并且與280 nm吸收峰是重合的。所以得出使用DEAE-52進(jìn)行酯化酶的純化是可行的。

圖2 離子交換層析洗脫曲線Fig.2 Ion exchange chromatography on DEAE-52

2.1.3 Sephadex G-100

將進(jìn)行了離子層析后的反應(yīng)液繼續(xù)進(jìn)行純化。使用緩沖液進(jìn)行純化，并且每4 mL為一組進(jìn)行測(cè)量280 nm的數(shù)值，繪制出圖3。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得，洗脫的過(guò)程當(dāng)中出現(xiàn)了兩個(gè)洗脫峰，經(jīng)過(guò)測(cè)定第二個(gè)是目標(biāo)酶，洗脫峰的峰型對(duì)稱且基線接近0，可以將其與其他的雜蛋白區(qū)別開，所以可以使用Sephadex G-100凝膠進(jìn)行進(jìn)一步的純化。

圖3 SephadexG-100凝膠曲線Fig.3 Gel filtration chromatography on Sephadex G-100

在洗脫過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，酯化酶出現(xiàn)了2個(gè)蛋白峰，且第二個(gè)的峰型呈對(duì)稱狀態(tài)，基線基本為零，與另一蛋白組分能有效分離，經(jīng)酶活性檢測(cè)可知，其為活性組分。說(shuō)明Sephadex-100能有效分離純化經(jīng)DEAE-52離子交換后的酯化酶。

2.1.4 酯化酶純化回收情況

通過(guò)分析檢測(cè)橫梗霉發(fā)酵液所產(chǎn)生的酯化酶在純化過(guò)程中的總活力值、總蛋白值、活力比值、活力回收率及純化倍數(shù)等指標(biāo)，得到酯化酶的純化表。見表1。

由表1可知，橫梗霉發(fā)酵液通過(guò)不斷的純化之后，其純化結(jié)果得到明顯的優(yōu)化?？偦盍τ?426.6 U/mg降低至172.16 U/mg，總蛋白降低到0.02 U/mg，比活力由241.32 U/mg上升至8608.06 U/mg，回收率達(dá)到2.54%，純化倍數(shù)優(yōu)化至35.66。

表1 橫梗霉所產(chǎn)脂肪酶純化結(jié)果Table 1 Purification results of lipase produced by Lichtheimia

2.1.5 SDS-PAGE凝膠電泳

橫梗霉酯化酶發(fā)酵上清純化步驟后，其純化倍數(shù)達(dá)35.66倍，活性回收率為2.54%比中DEAE-纖維素-52離子交換層析結(jié)果最佳，純化效果見表4，純化后的是單一條帶，見圖4，相對(duì)分子質(zhì)量43000 u。

圖4 12 g/dL SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 12 g/dL SDS-PAGE of enzyme solution

2.2 酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 酯化酶的最適溫度

為得到，在pH 7.0的條件，溫度分別為20 ℃~100℃（每10 ℃設(shè)置一個(gè)實(shí)驗(yàn)組），檢測(cè)酯化酶的活力。結(jié)果如圖5。

圖5 酯化酶的最適作用溫度Fig.5 Optimum temperature of esterification enzyme

實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析之后得到，該酯化酶在25 ℃~ 40℃溫度范圍內(nèi)酶活較高，在30 ℃時(shí)的相對(duì)酶活為67.92%比20 ℃的48.89%有了明顯的上升，而且在40℃時(shí)相對(duì)酶活最高。50 ℃后相對(duì)酶活為75.31%開始急劇下降，60 ℃的時(shí)候只有43.98%的相對(duì)酶活，在70 ℃的時(shí)候更是下降到了27.96%的酶活，當(dāng)80 ℃時(shí)僅有7.65%，由此可知酯化酶最適反應(yīng)溫度40 ℃。劉光[18]等人研究發(fā)現(xiàn)在脂肪酶的生產(chǎn)過(guò)程中通常的溫度不高于40 ℃，最適宜的反應(yīng)溫度是30 ℃左右，他篩選得出的是低溫的脂肪酶，沒有很好的耐熱性。與本實(shí)驗(yàn)得到的酯化酶的反應(yīng)最適宜溫度類似，表明了酯化酶的不耐熱性。

2.2.2 溫度對(duì)酯化酶穩(wěn)定性的影響

20~60 ℃保溫，檢測(cè)殘留的酯化酶活性。結(jié)果如圖6。

圖6 酯化酶的溫度穩(wěn)定性Fig.6 Temperature stability of esterase

在酯化酶的最適溫度的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，酯化酶沒有很好的耐熱性，溫度過(guò)高會(huì)使酯化酶的失去活性。將橫梗霉所產(chǎn)生的酯化酶在相同時(shí)間下，橫梗霉所產(chǎn)酯化酶的相對(duì)酶活隨溫度的增加相對(duì)降低；同溫度下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性呈降低趨勢(shì)。在20 ℃時(shí)，保溫0~30 min，酶活力降低不明顯（p>0.05），12 min時(shí)的相對(duì)酶活為94.97%，在24 min后僅降低到了91.12%，活性并沒有很大的變化，在36 min后酶活為89.31%，在36 min的時(shí)間內(nèi)酶活力都保存90%左右，36 min后酶活開始下降，48 min的酶活73.31%，60 min降低到68.31%，72 min后明顯的下降49.49%，在84 min后，失去酶活的活性82.09%。在30 ℃的溫度下0~36 min內(nèi)的酶活力的降低比較小維持在92%，在24 min后酶活為94.98%，36 min后的酶活92.98%，48 min后的酶活開始有了明顯的下降，在60 min的時(shí)候酶活76.96%，到72 min后的酶活下降到了56.97%，在96 min后的酶活為37.43%。在40 ℃時(shí)，保溫36 min~96 min，酶活力下降顯著（p<0.05），12 min后的酶活力97.97%而24 min后酶活就降低至87.86%在36 min保持79%的酶活力，在72 min的時(shí)候酶活下降至56.98%，96 min時(shí)的酶失活。在50 ℃下，酶活在12 min后酶活86.97%，24 min后的酶活僅75.97%，在36 min的酶活力65.97%酶活力由顯著降低至84 min的24.98%。60 ℃時(shí)，12 min后的酶活就只有81.97%在36 h后僅有67.97%，72 min后的酶活下降至34.86%。表面了該酯化酶沒有很好的耐熱性。劉光[18]等人研究發(fā)現(xiàn)在通常的產(chǎn)業(yè)當(dāng)中的酶在50 ℃就會(huì)喪失活性，而在他的實(shí)驗(yàn)中所得到的脂肪酶是低溫的脂肪酶具有適用于洗滌劑以及其他添加劑的能力并且與本實(shí)驗(yàn)得到的酯化酶的不耐熱性相似。

2.2.3 酯化酶的最適pH

選擇20 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液（pH 3.0~8.0）（3、4、5、6、7、8）為緩沖體系，反應(yīng)混合物50 ℃預(yù)熱5 min后測(cè)定酶活，比較得出酯化酶反應(yīng)中的最適pH值，結(jié)果如圖7所示。

圖7 酯化酶的最適作用pHFig.7 Optimum action of esterification enzyme pH

實(shí)驗(yàn)得出，在pH 5.0~10.6范圍內(nèi)，酯化酶均有活性呈先增大后降低的趨勢(shì)。且在pH為7.5時(shí)，酶活性達(dá)到最高為100%。pH 3~pH 7.5的時(shí)候酶活呈上升趨勢(shì)，pH 3的時(shí)候相對(duì)酶活為3.01%，上升至pH 4.0的時(shí)候相對(duì)酶活為8.97%，pH 5.0時(shí)的酶活15.95%上升到pH為6.5時(shí)，保持57%的酶活，pH 7.0時(shí)，保持88%的酶活，pH 8~9的時(shí)候酶活力開始下降，pH 8的時(shí)候下降至酶活力77.86%，pH 9.0的時(shí)候酶活力僅有63%。呂梅[19]等人研究的酯酶在pH改變的條件下，酯酶的活性也發(fā)生改變，在pH為6的時(shí)候酯酶的活性只具有60%左右，在酸性的條件下不適合酯酶保持活力，得出在堿性條件下更加的適合酯酶生長(zhǎng)。所以得出結(jié)論酯化酶在堿性條件下更加的適合。研究發(fā)現(xiàn)主要可能是因?yàn)榻橘|(zhì)的酸堿度會(huì)被pH的改變而影響，導(dǎo)致酶活性中心的基團(tuán)解離的程度有了改變，進(jìn)而導(dǎo)致底物與酶的結(jié)合狀態(tài)發(fā)生了改變，使得酶的催化發(fā)生了改變。酯化酶在酸性的條件下酯化酶的活性中心的基團(tuán)發(fā)生解離，使得底物與酶的結(jié)合發(fā)生了改變，影響了底物的結(jié)合，說(shuō)明pH的改變對(duì)酶的影響顯著，且酯化酶適合在堿性條件下發(fā)生反應(yīng)，且最適的反應(yīng)pH為7.5。

2.2.4 pH對(duì)酯化酶穩(wěn)定性的影響

分別將1 mL酶液與19 mL的不同pH磷酸緩沖液（pH 5.0~9.0）均勻混合，25 ℃恒溫保存96 h，5 min取一次樣測(cè)定其酶活。結(jié)果如圖8。

圖8 酯化酶的pH 穩(wěn)定性Fig.8 pH stability of esterase

如圖8所示，由圖可知堿性范圍內(nèi)，酯化酶能具有良好的穩(wěn)定性。在pH 4 12 h后的活性僅剩下54.97%，24 h后的酶活為38.02%，36 h后下降至30.86%，72 h后僅僅保持了8.21%的相對(duì)酶活。在pH 5 12 h后的相對(duì)酶活為67.83%，24 h后下降至43.92%，72 h后的酶活僅剩下17.91%。但是在pH 6 12 h后酶活還有93.01%，24 h后還有84.94%的相對(duì)酶活，72 h后任然具有57.81%的相對(duì)酶活，84 h后酶活降低至32.01%。在pH 7 12 h后的酶活為95.31%，24 h后的酶活為86.96%，36 h后的酶活依舊還有80.05%，48 h后的酶活為75.1%，96 h后還具有31.09%的酶活，pH 8.0 84 h時(shí)仍具有可保持56%的活性。pH 5.0保存84 h下，活性降低94%。劉瑞娟[17]篩選出的菌株所產(chǎn)的酶具有良好的耐堿性，84 h時(shí)，分別在pH 8.0及9.0條件下保持55%、42%的酶活，pH 5.0時(shí)僅保持活性值為6%。與本實(shí)驗(yàn)研究酯化酶的pH穩(wěn)定性所得到的結(jié)論在堿性的環(huán)境下更加適合酯化酶的生長(zhǎng)結(jié)論相似，表明酯化酶具有良好的耐堿性，酸性條件下不適合酯化酶的生存。

2.2.5 金屬離子對(duì)酯化酶穩(wěn)定性的影響

為探究金屬離子對(duì)酯化酶的影響，用20 mmol/L pH 5.0 Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液分別配制2 mmol/L金屬離子（Fe2+，Mg2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Ca2+）。如圖9所示。

圖9 金屬離子對(duì)酯酶活性的影響Fig.9 Effects of metal irons on the esterase activities

研究表明，酶的活性中心的改變會(huì)被金屬離子所影響，導(dǎo)致酶的活性受到促進(jìn)或者會(huì)抑制酶的活性，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，加入了Mg2+、Ca2+后的相對(duì)酶活無(wú)明顯的變化，說(shuō)明Mg2+、Ca2+對(duì)酶活性無(wú)顯著影響，而在加入了Fe2+后的相對(duì)酶活為76%，加入Zn2+后的相對(duì)酶活為65%，加入Mn2+后的相對(duì)酶活為86%，加入Cu2+后的相對(duì)酶活為19%，所以得出結(jié)論Fe2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+抑制作用不同，其中Cu2+的抑制效果最顯著，酶活性喪失80%以上。這可能是由于Cu2+影響了酯化酶催化活性中心。這與王春雨[20]研究低溫脂肪酶受金屬離子影響的結(jié)果相似。表明了實(shí)驗(yàn)結(jié)果Cu2+影響了酯化酶的活性中心。

3 結(jié)論

使用橫梗霉進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生酯化酶，并對(duì)酯化酶發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，純化步驟首先使用40%飽和度的硫酸銨鹽析沉淀，然后進(jìn)行透析，之后進(jìn)行離心，最后使用DEAE-纖維素-52離子交換層析和Sephadex G-100凝膠過(guò)濾層析。較粗酶液增加了35.66倍，而活性回收率由100%降低至2.54%，相對(duì)分子質(zhì)量為43000 u。使用純化后的酯化酶用于酶學(xué)性質(zhì)的研究，得出酯化酶的最適宜的反應(yīng)溫度為40 ℃，耐熱性不好，60 ℃處理30 min僅殘留67.97%酶活性。酯化酶在堿性條件下比較適合生長(zhǎng)，最適pH是7.5。以及對(duì)酯化酶有抑制作用的金屬離子有Mn2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+。所以該酯化酶具有高產(chǎn)、耐堿、熱敏性高的特點(diǎn)，在食品、釀酒、洗滌等產(chǎn)業(yè)有著很好的應(yīng)用前景。

致謝

感謝五糧液股份有限公司給本項(xiàng)目（CXY2019 ZR012）提供的經(jīng)費(fèi)。