miR-148a-3p靶向PPARγ基因抑制鵝顆粒細(xì)胞孕酮的合成

鄧 艷，解廣娟，胡深強(qiáng)，李 亮，王繼文

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗室，成都 613111)

microRNAs(miRNAs)是一類由約22個核苷酸組成的短鏈非編碼RNA分子，其通過自身種子序列與靶基因特定位點(diǎn)進(jìn)行堿基配對結(jié)合[1-2]，廣泛參與動物卵巢類固醇激素合成與分泌的調(diào)控過程[3-5]。

近年來，大量研究已報道，miRNAs能調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞類固醇激素的生物合成[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-15a參與了人卵巢顆粒細(xì)胞中黃體酮、雄激素和雌激素的釋放，并且在過表達(dá)miR-15a后可以促進(jìn)孕酮和睪酮生成[9]。Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)，在FSH處理后的牛顆粒細(xì)胞中，miR-31和miR-143通過靶向FSHR基因抑制孕酮的分泌。在豬顆粒細(xì)胞中，miR-378通過靶向芳香化酶的3′UTR來調(diào)節(jié)卵巢中雌二醇的分泌[4]。而在小鼠顆粒細(xì)胞中，miR-383可以靶向RBMS1促進(jìn)雌二醇的代謝[5]。這些結(jié)果表明，miRNAs在哺乳動物卵巢顆粒細(xì)胞的類固醇激素合成與分泌方面有重要調(diào)控作用。相比miRNAs在哺乳動物中的研究，其在禽類卵巢中的研究大多集中在對卵巢細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控。比如，Kang等[11]研究表明，miR-26a-5p通過靶向TNRC6A基因促進(jìn)雞卵巢卵泡膜細(xì)胞的增殖。miR-26b-5p受到轉(zhuǎn)錄因子SMAD4的調(diào)控，靶向INHBB介導(dǎo)TGF-β/SMADs信號通路的表達(dá)，從而促進(jìn)鵝卵泡顆粒細(xì)胞的增殖[12]。此外，鵝顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡也受miR-181a-5p的調(diào)控，其通過靶向SIRT1參與FOXO信號通路[13]。然而，miRNAs 對禽類卵泡顆粒細(xì)胞的類固醇激素的合成與分泌的調(diào)控機(jī)制還未見報道。

過氧化物酶體增殖物激活型受體(peroxisome proliferator activated receptors，PPARs)是核受體超家族的配體依賴型轉(zhuǎn)錄因子，主要包括α、β、γ三種亞型[14-15]。其中，PPARγ參與調(diào)節(jié)卵巢的卵泡發(fā)育、排卵及卵子的質(zhì)量和類固醇激素(雌激素和孕激素)的分泌[16-17]。Kim等[16]研究表明，PPARγ通過調(diào)控孕激素受體參與小鼠顆粒細(xì)胞類固醇激素的合成。然而，PPARγ基因是否影響鵝卵巢顆粒細(xì)胞的生物學(xué)功能目前尚不清楚。

本課題組前期轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，miR-148a-3p在鵝4～6 mm、8～10 mm和F5卵泡顆粒層中的表達(dá)逐漸升高。因此，本研究首先檢測miR-148a-3p在鵝不同階段卵泡顆粒層中的表達(dá)，然后在體外培養(yǎng)的鵝卵泡顆粒細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)染mimics和inhibitor模擬miR-148a-3p的過表達(dá)和抑制，利用qPCR法檢測與類固醇激素合成分泌相關(guān)基因的表達(dá)變化，接著通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證靶標(biāo)關(guān)系，最后干擾靶基因檢測miR-148a-3p對孕酮合成變化的影響，為進(jìn)一步闡明miR-148a-3p在禽類顆粒細(xì)胞中的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和樣品采集

本試驗共選用12只天府肉鵝母系母鵝，其中，6只 進(jìn)行組織樣品采集，6只進(jìn)行顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)。所選用的試驗鵝均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽育種場提供，試驗鵝在相同的條件下飼養(yǎng)，開產(chǎn)時間和體重基本一致。鵝麻醉致死后，迅速取出整個卵巢，用游標(biāo)卡尺測量不同直徑大小的卵泡(2～4 mm、4～6 mm、 6～8 mm、8～10 mm、F5、F4、F3、F2、F1)，根據(jù)甘翔等[18]的方法進(jìn)一步分離不同階段卵泡顆粒層，PBS漂洗3～4次，將顆粒層附著的卵黃清洗干凈后，剪碎并置于-80 ℃凍存，用于RNA提取。

1.2 miR-148a-3p在不同物種中的保守性分析

在miRBase(http://www．Mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫中在線檢索人(Homosapiens, GenBank_No.：NC_000003.12)、小鼠(Musmusculus, GenBank_No.：NC_000072.6)、雞(Gallusgallus, GenBank_No.：NC_006099.5)、豬(Susscrofa, GenBank_No.：NC_010455.5)、牛(BosTaurus, GenBank_No.：NC_037349.1)、恒河猴(Macacamulatta, GenBank_No.：NC_041755.1)、綠蜥蜴(Anoliscarolinensis, GenBank_No.：NC_014777.1)、大西洋鮭魚(Salmosalar, GenBank_No.：NC_027314.1)8個物種的miR-148a-3p成熟體序列，鵝的miR-148a-3p成熟體序列由課題組前期miRNA測序所得，采用MEGA 7進(jìn)行保守性分析。

1.3 鵝等級卵泡顆粒細(xì)胞分離培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

參考Deng等[19]的方法進(jìn)行鵝等級卵泡顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度為70%～80%時，根據(jù)Lipofectamine?3000(Invitrogen，USA)試劑使用說明，先將lipofectamine 3000分別和miR-148a-3p mimics、mimics NC、inhibitor、inhibitor NC、Control在DMEM/F12(HyClone，USA)培養(yǎng)基內(nèi)形成脂質(zhì)體復(fù)合物，然后共轉(zhuǎn)染到顆粒細(xì)胞中，在含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后6 h對細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行一次觀察，轉(zhuǎn)染24 h后收取上清液和細(xì)胞用于后續(xù)的檢測。miR-148a-3p mimics、mimics NC、inhibitor、inhibitor NC由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成(表1)。

表1 miR-148a-3p mimics和inhibitor合成序列

1.4 鵝卵泡顆粒層組織和顆粒細(xì)胞RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

利用RNAiso Plus(TaKaRa, China)提取鵝卵泡顆粒層組織和細(xì)胞的總RNA，利用Nano Drop 2000紫外分光光度計檢測總RNA的濃度和純度，使用Prime ScripTMRT reagent Kit(TaKaRa, China)進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄，按照上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司的miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄miRNA，反應(yīng)結(jié)束后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 qPCR檢測miR-148a-3p及關(guān)鍵基因的表達(dá)

利用課題組前期對鵝顆粒細(xì)胞miRNA測序得到的miR-148a-3p序列，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成miR-148a-3p定量檢測試劑盒，其他mRNAs 定量檢測引物由華大基因科技有限公司合成(表2)。使用SYBR?Premix Ex TaqTM II(TaKaRa, China)檢測mRNAs表達(dá)量，mRNAs反應(yīng)體系為：SYBR?Premix Ex TaqTM II 6.25 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板1 μL，無菌水4.25 μL，總反應(yīng)體系為12.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，退火溫度30 s，72 ℃延伸30 s， 72 ℃ 10 min, 總共40個循環(huán)；設(shè)置熔解曲線為65～95 ℃，每5 s增加0.5 ℃，以檢測引物特異性。使用miR-148a-3p定量檢測試劑盒檢測miR-148a-3p的表達(dá)量，miR-148a-3p的反應(yīng)體系為：2×Real-time PCR Master Mix (SYBR) 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，TaqDNA polymerase 0.2 μL，模板2 μL，無菌水7 μL， 總反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 12 s，退火溫度40 s，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)3個 技術(shù)重復(fù)，miRNA表達(dá)量計算以U6為內(nèi)參，mRNAs表達(dá)量計算以GAPDH和β-actin為內(nèi)參。

表2 用于qPCR的引物

1.6 突變型載體和野生型載體構(gòu)建

通過miRecords_version4、miRTarBase、Tarbase 7.0等數(shù)據(jù)庫中收錄的經(jīng)試驗驗證的miR-148a-3p靶基因，綜合TragetScan 7.1、miRanda、miRWalk 2.0、DIANA-microT等在線軟件預(yù)測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PPARγ-3′UTR與miR-148a-3p種子序列存在結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。根據(jù)鵝PPARγ-3′UTR 序列設(shè)計含結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)的擴(kuò)增引物(表3)，將所得到的PPARγ-3′UTR目的片段和pmir GLO空載質(zhì)粒(Promega，USA)分別用SacⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)完畢后進(jìn)行純化回收。將經(jīng)過切膠純化后的目的片段和已切開的pmir GLO(Promega，USA)空載質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建野生型靶標(biāo)驗證載體PGL/PPARγ-WT。將野生型載體的潛在結(jié)合位點(diǎn)突變?yōu)槠浠パa(bǔ)序列(圖1)，從而得到突變型重組載體即PGL/PPARγ-Mut，突變載體由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成。

黑色加粗字體為種子序列和突變序列

表3 PPARγ-3′UTR序列擴(kuò)增引物

1.7 雙熒光素酶報告試驗驗證miR-148a-3p的靶基因

使用中國倉鼠卵巢細(xì)胞系(CHO，中國科學(xué)院昆明動物研究所)用于雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測。CHO細(xì)胞系復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長滿后用胰酶消化，然后用含10% FBS(Gibco, USA)的DMEM/F12(HyClone, USA)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以4×106個·mL-1的密度接種于96孔板。待細(xì)胞密度達(dá)到約60%～70%時，按照Lipofectamine?3000(Invitrogen，USA)說明書將miR-148a-3p mimics分別與PGL/PPARγ-WT或PGL/PPARγ-Mut兩兩進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，每個處理設(shè)置3孔重復(fù)。轉(zhuǎn)染后24 h使用Dual-Luciferase?Reporter試劑盒(Promega, China)檢測細(xì)胞熒光素酶活性。以螢火蟲熒光素酶作為試驗報告基因，海腎熒光素酶作為對照報告基因，二者的比值即為相對熒光素活性。

1.8 miR-148a-3p靶基因的干擾

從NCBI獲取鵝PPARγ CDS區(qū)預(yù)測序列，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建si-PPARγ，序列見表4。結(jié)合Lipofectamine?3000(Invitrogen，USA)試劑使用說明，使用12孔板轉(zhuǎn)染siRNA及其NC，轉(zhuǎn)染24 h后收集樣品進(jìn)行關(guān)鍵基因表達(dá)量的檢測及激素含量的檢測。

表4 PPARγ干擾序列

1.9 ELISA檢測孕酮含量

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后收取細(xì)胞上清液，根據(jù)ELISA試劑盒(上海恒遠(yuǎn)科技有限公司，中國)說明書在板條標(biāo)準(zhǔn)品孔內(nèi)加50 μL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，樣本孔加10 μL待測樣本和40 μL稀釋液，空白孔不加，其余孔中加入100 μL辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗體，封板膜密封，37 ℃恒溫箱溫育60 min；棄去液體，紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，紙上拍干，重復(fù)洗板5次；每孔各加入50 μL底物A、B，37 ℃避光孵育15 min；每孔加入50 μL終止液混勻，15 min內(nèi)在450 nm波長處檢測各孔OD值。在Excel中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值，從而得到不同處理組中孕酮含量。

1.10 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

采用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，組間差異顯著性檢驗采用獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行分析，利用公式2-△△Ct計算所選目標(biāo)基因的相對表達(dá)量[20]。P<0.05 表示具有統(tǒng)計學(xué)意義，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié) 果

2.1 miR-148a-3p在不同物種中的保守性分析

通過miRBase數(shù)據(jù)庫下載不同物種的miR-148a-3p的成熟體序列，比對不同物種的成熟體序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-148a-3p的成熟體序列在各個物種中高度保守，其核心的種子序列基本一致(表5)。

表5 miR-148a-3p序列保守性分析

2.2 miR-148a-3p在鵝不同階段卵泡顆粒層中的表達(dá)分析

結(jié)果如圖2所示，隨著卵泡直徑的增加，miR-148a-3p的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，且在等級卵泡F4顆粒層中表達(dá)最高。此外，miR-148a-3p在等級階段卵泡顆粒層的表達(dá)也高于等級前卵泡(圖2)，因此，選擇等級卵泡顆粒細(xì)胞用于后續(xù)的細(xì)胞試驗。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.3 轉(zhuǎn)染miR-148a-3p mimics和inhibitor對鵝卵泡顆粒細(xì)胞功能的影響

為了探究miR-148a-3p對鵝卵泡顆粒細(xì)胞功能的影響，在鵝等級卵泡顆粒細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-148a-3p mimics和inhibitor。定量結(jié)果顯示，與mimics NC組相比，miR-148a-3p mimics能顯著下調(diào)3β-HSD表達(dá)(圖3A,P<0.05)，而與inhibitor NC組相比，miR-148a-3p inhibitor能顯著上調(diào)3β-HSD表達(dá)(圖3C,P<0.05)。同時，ELISA結(jié)果顯示，與mimics NC組相比，miR-148a-3p mimics能顯著抑制孕酮的合成(圖3B,P<0.05)，而與inhibitor NC組相比，miR-148a-3p inhibitor能顯著促進(jìn)孕酮的合成(圖3D,P<0.05)。由此可知，miR-148a-3p能抑制鵝等級卵泡顆粒細(xì)胞中孕酮的合成。

A. miR-148a-3p mimics對3β-HSD的mRNA表達(dá)的影響；B. miR-148a-3p mimics對孕酮合成的影響；C. miR-148a-3p inhibitor對3β-HSD的mRNA表達(dá)的影響；D. miR-148a-3p inhibitor對孕酮合成的影響。NC. 陰性對照組；mimics. miR-148a-3p mimics；inhibitor. miR-148a-3p inhibitor；Control. 空白對照組

2.4 miR-148a-3p靶基因的確定

為了進(jìn)一步探究miR-148a-3p抑制鵝卵泡顆粒細(xì)胞孕酮合成的分子機(jī)制，在CHO細(xì)胞系中共轉(zhuǎn)染miR-148a-3p mimics與野生型載體PGL/PPARγ-WT或突變型載體PGL/PPARγ-Mut，采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測雙熒光素酶的活性。結(jié)果顯示，當(dāng)miR-148a-3p與PPARγ的結(jié)合位點(diǎn)突變后，雙熒光素酶活性顯著升高(圖4，P<0.05)，證實(shí)PPARγ是miR-148a-3p的靶基因。

圖4 miR-148a-3p與PPARγ靶標(biāo)關(guān)系的雙熒光素檢測

2.5 miR-148a-3p mimics和inhibitor對PPARγ表達(dá)的影響

為了探究miR-148a-3p對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響，在鵝卵泡顆粒細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-148a-3p mimics和miR-148-3p inhibitor后檢測靶基因PPARγ的mRNA表達(dá)變化。結(jié)果如圖5所示，與mimics NC組相比，miR-148a-3p mimics能顯著降低鵝顆粒細(xì)胞中PPARγ的表達(dá)(圖5A,P<0.05)。與inhibitor NC組相比，miR-148a-3p inhibitor能顯著上調(diào)PPARγ的表達(dá)(圖5B,P<0.05)。由此可知，miR-148a-3p能調(diào)控靶基因PPARγ的轉(zhuǎn)錄水平。

A. miR-148a-3p mimics對PPARγ的mRNA表達(dá)的影響；B. miR-148a-3p inhibitor對PPARγ的mRNA表達(dá)的影響

2.6 干擾PPARγ對鵝卵泡顆粒細(xì)胞孕酮分泌的影響

為了探究miR-148a-3p是否會通過其靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響鵝卵泡顆粒細(xì)胞的激素合成，在顆粒細(xì)胞中干擾PPARγ后檢測關(guān)鍵基因的表達(dá)變化及孕酮含量。結(jié)果如圖6所示，與對照組和si-PPARγ NC組相比，干擾PPARγ基因后，3β-HSD的表達(dá)量顯著降低(圖6A,P<0.05)，孕酮的含量也降低，但差異不顯著(圖6B,P>0.05)。由此可知，鵝顆粒細(xì)胞中孕酮的含量受PPARγ的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

A.干擾PPARγ對3β-HSD的mRNA表達(dá)的影響；B.干擾PPARγ對孕酮合成的影響

3 討 論

miR-148a-3p的序列已經(jīng)在多個物種中被鑒定[21]，而在鵝上，miR-148a-3p的序列是通過前期轉(zhuǎn)錄組測序獲得。本研究通過對多個物種的序列進(jìn)行保守性比對分析發(fā)現(xiàn)，miR-148a-3p在不同物種中高度保守，推測miR-148a-3p在不同的物種中可能具有類似的功能，但關(guān)于miR-148a-3p調(diào)控鵝卵泡顆粒細(xì)胞類固醇激素分泌的相關(guān)研究未見報道。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，miR-148a-3p在許多生理過程中均發(fā)揮重要作用，比如免疫、腫瘤和癌癥[22-23]，骨骼肌細(xì)胞的分化、增殖和凋亡以及脂肪細(xì)胞的增殖分化[24-26]。本研究中，miR-148a-3p在鵝不同發(fā)育階段的卵泡顆粒層中均有表達(dá)，且隨著卵泡直徑的增加，其表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在F4、F5階段卵泡達(dá)到頂峰。F4、F5階段卵泡為等級前卵泡發(fā)育到等級卵泡的過渡時期[27]，推測miR-148a-3p可能在卵泡發(fā)育或卵泡選擇過程中有重要作用，這也表明，miR-148a-3p也參與禽類的繁殖生理過程。進(jìn)一步體外培養(yǎng)鵝顆粒細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-148a-3p mimics能顯著下調(diào)3β-HSD表達(dá)，抑制孕酮的合成；而轉(zhuǎn)染miR-148a-3p inhibitor能顯著上調(diào)3β-HSD表達(dá)，促進(jìn)孕酮的合成。3β-HSD是孕酮合成的關(guān)鍵基因[28]，禽類卵泡顆粒層中3β-HSD的表達(dá)量隨著卵泡的發(fā)育逐漸升高[29-30]。這些結(jié)果表明，miR-148a-3p可以抑制3β-HSD的表達(dá)降低孕酮的合成，進(jìn)而影響鵝卵泡的選擇和發(fā)育。miRNAs主要通過與靶基因的3′-UTR結(jié)合調(diào)控靶基因表達(dá)繼而影響靶細(xì)胞的生物學(xué)功能[1]。研究表明，在食管癌中，miR-148a-3p通過靶向DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1,DNMT1)調(diào)控癌細(xì)胞的增殖和入侵[31]。在人卵巢癌細(xì)胞中，miR-148a-3p通過靶向絡(luò)氨酸蛋白激酶Met(tyrosine-protein kinase Met,c-Met)抑制癌細(xì)胞的增殖[32]。而在正常的細(xì)胞中，如C2C12肌細(xì)胞系和原代老鼠細(xì)胞中，miR-148a能直接通過靶向含蛋白激酶1的Rho相關(guān)螺旋線圈(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1,ROCK1)的3′UTR來促進(jìn)成肌細(xì)胞分化[33]。在牛的骨骼肌細(xì)胞中，miR-148a-3p通過轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)類Krüppel因子6(Krüppel-like factor 6,KLF6)的表達(dá)抑制成肌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡[34]。而在雞的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中，miR-148a-3p通過直接靶向間質(zhì)同源框2(mesenchyme homeobox 2,Meox2)來促進(jìn)細(xì)胞的分化，抑制凋亡，但不影響增殖，同時能增加PI3K/AKT信號通路[35]。本課題組前期通過靶基因在線預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)，miR-148a-3p與PPARγ3′-UTR存在潛在結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報告載體試驗結(jié)果顯示，miR-148a-3p可以直接靶向結(jié)合PPARγ調(diào)控鵝顆粒細(xì)胞的生理功能。進(jìn)一步檢測miR-148a-3p對PPARγ表達(dá)量的影響時發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-148a-3p mimics能顯著降低鵝顆粒細(xì)胞中PPARγ表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR-148a-3p inhibitor后，PPARγ的表達(dá)顯著升高。研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ可以影響大鼠[36]、豬[37]、綿羊[38]、牛[39]卵巢顆粒細(xì)胞產(chǎn)生類固醇激素。Komar[40]研究表明，PPARγ可以引起人孕酮分泌量的改變。本研究中，干擾PPARγ能顯著降低3β-HSD表達(dá)水平和孕酮的含量。這些結(jié)果就表明，在鵝卵泡顆粒細(xì)胞中，miR-148a-3p通過靶向PPARγ來抑制3β-HSD的表達(dá)，進(jìn)而降低孕酮的合成。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-148a-3p在鵝等級卵泡顆粒細(xì)胞中通過靶向結(jié)合PPARγ來抑制3β-HSD的表達(dá)，從而降低孕酮的合成，初步探討了miR-148a-3p對禽類卵泡顆粒細(xì)胞孕酮合成的分子機(jī)制，為深入探究miRNA在禽類卵巢顆粒細(xì)胞中的功能提供理論依據(jù)。