基于RNA-seq結(jié)果開發(fā)豬SSR標(biāo)記

李文霞，吳怡琦，楊 帥，張燕偉，路 暢，楊 陽，蔡春波，高鵬飛，郭曉紅，李步高，曹果清

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

微衛(wèi)星標(biāo)記，又稱簡單序列重復(fù)(simple sequence repeat, SSR)或短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat, STR)，主要分布于真核生物基因組，原核生物基因組中也偶有發(fā)現(xiàn)[1-2]。SSR標(biāo)記由核心序列與側(cè)翼序列組成，核心序列為1～6個核苷酸串聯(lián)重復(fù)，重復(fù)次數(shù)為10～20次左右，如(AC)n、(CT)n、(TAT)n等；側(cè)翼序列位于核心序列兩側(cè)，屬于保守的特異單拷貝序列，使微衛(wèi)星特異地定位于基因組特定部位[3]。Schl?tterer和Tautz[4]認為，SSR因核心序列重復(fù)次數(shù)的改變而顯現(xiàn)出高度變異性。SSR作為常見的分子遺傳標(biāo)記，具有數(shù)量大、分布廣泛、檢測便利及信息含量高等特點，在遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、親子鑒定等方面具有積極的應(yīng)用價值[5-7]。李軍成等[8]對高原小型蕨麻豬進行遺傳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9個微衛(wèi)星位點的平均等位基因數(shù)為6.11，平均雜合度為0.731 9，平均多態(tài)信息含量為0.765 9。牛榮等[9]利用35個微衛(wèi)星位點對版納小耳豬的5個家系進行遺傳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各家系均已構(gòu)成獨立的遺傳群體，其基因多態(tài)性和遺傳多樣性相比于普通商品豬較低。R?baa等[10]利用16個SSRs標(biāo)記通過對數(shù)似然比方法成功鑒別了歐洲野生與家養(yǎng)豬種。Lin等[11]利用13個四核苷酸重復(fù)的SSR標(biāo)記和1個性別鑒別基因構(gòu)建了豬DNA鑒定系統(tǒng)，該系統(tǒng)可用于豬個體識別、親子鑒定及其他遺傳育種試驗。

開發(fā)SSR標(biāo)記對于豬遺傳多樣性研究、特定性狀輔助育種及遺傳圖譜繪制等多個方面具有重大意義。傳統(tǒng)SSR標(biāo)記的開發(fā)是通過構(gòu)建基因組文庫進行篩選，過去大多數(shù)微衛(wèi)星序列均是利用該方法獲取的。Groenen等[12]從豬基因組文庫中成功分離出了30個微衛(wèi)星克隆，其中10個可作微衛(wèi)星標(biāo)記。傳統(tǒng)開發(fā)SSR標(biāo)記方法操作繁瑣，費時費力且費用昂貴，一定程度上限制了SSR標(biāo)記的研究與應(yīng)用[13]。近年來，高通量測序技術(shù)的發(fā)展為全基因組水平篩選短串聯(lián)重復(fù)序列變異提供了基礎(chǔ)，已有大量基于高通量測序數(shù)據(jù)開發(fā)SSR標(biāo)記的成功案例[14-16]。Liu等[17]利用基因組重測序數(shù)據(jù)，篩選出16 527個高質(zhì)量多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，將其應(yīng)用于豬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有中國豬，包括兩頭野豬，聚集為一個分支，而所有商品瘦肉型豬聚集為一個分支?；谵D(zhuǎn)錄組測序結(jié)果開發(fā)SSR標(biāo)記已在沼澤水牛[18]、四川白鵝[19]、黃菇魚[20]、羅氏沼蝦[21]、蘋果蝸牛[22]、南極魚[23]、泥鰍[24]、窄足真蚋[25]等動物中取得成功。

本研究基于課題組前期獲取的大白豬與馬身豬背最長肌RNA-seq結(jié)果，從預(yù)測的10 488個SSRs位點中隨機選擇154個進行檢測，共篩選出25個高多態(tài)性位點，并用于馬身豬、大白豬、晉汾白豬及山西黑豬等4個豬種的遺傳多樣性分析，為進一步開展豬品種資源的保護和利用工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和樣品采集

試驗動物選自山西大同市種豬場，采集健康、個體間無直接血緣關(guān)系的6月齡馬身豬(MS)、大白豬(LW)、晉汾白豬(JW)及山西黑豬(SB)等4個豬種各30份耳組織樣品(大約0.5 g)，放于裝有1 mL 700 mL·L-1乙醇的1.5 mL離心管中，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 2×Taq Plus Master MixⅡ購自諾唯贊公司；Tris堿和EDTA購自華美公司；SDS(十二烷基硫酸鈉)、50×TAE電泳緩沖液、TEMED、Tris飽和酚、過硫酸銨、N，N-亞甲基二丙烯酰胺等購自北京索萊寶科技有限公司；6×DNA Loading Buffer購自康為世紀公司；DL500 DNA Marker、Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、pMD 18-T Vector、E.coliDH-5α Competent Cells購自TaKaRa公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2.2 主要儀器 Veriti 96 Well PCR儀(ABI，美國)；ND-1000核酸蛋白測定儀(Nanodrop，美國)；DYY-6C電泳儀(六一儀器廠，北京)；Centrifuge 5430R高速冷凍離心機(Eppendorf，德國)；D1008E微型離心機(Scilogex，美國)、MX-S旋渦混合儀(Scilogex，美國)等。

1.3 試驗方法

1.3.1 豬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源及SSR位點分析 豬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來自于課題組前期利用Illumina HiSeq 2500測序平臺對6月齡大白豬和馬身豬各3頭豬背最長肌的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果[26-27]。首先對測序獲取的原始數(shù)據(jù)(raw reads)使用Perl腳本進行質(zhì)量控制，去除接頭序列、>10%的未知核酸序列以及質(zhì)量分數(shù)≤10的堿基數(shù)占到整個堿基數(shù)50%以上的冗余序列，得到clean reads。利用bowtie2(v2.2.9)對clean reads建立索引，并通過Trinity軟件對clean reads進行拼接、過濾及組裝后得到高質(zhì)量Unigenes，再利用tophat(v2.0.12)將質(zhì)控后的序列片段mapping到豬基因組中，已知轉(zhuǎn)錄本信息以Ensembl ID命名，未知轉(zhuǎn)錄本信息以TCONS ID命名。

使用位點挖掘工具MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對豬轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中序列長度大于1 kb的clean reads進行SSR位點搜索，檢測的SSR位點為單核苷酸至六核苷酸重復(fù)6類，設(shè)置參數(shù)為單核苷酸重復(fù)至少10次，二核苷酸重復(fù)至少6次，三、四、五及六核苷酸重復(fù)至少5次。復(fù)合SSR的兩個位點間最大間隔堿基數(shù)為100 bp。將最終生成的文本文件整合導(dǎo)入到Excel(Microsoft Office Excel 2016)中，并對SSR位點信息進行特征分析。

1.3.2 SSR位點篩選與引物設(shè)計 通過前期RNA-seq結(jié)果預(yù)測的SSR位點，根據(jù)其染色體位置、堿基類型、重復(fù)次數(shù)等差異將Excel中的所有SSR位點進行分類與統(tǒng)計，并利用OFFSET函數(shù)(=OFFSET(A$1，(ROW(A1)-1)×50)實現(xiàn)每隔50個位點自動篩選1個SSR位點，最終選擇200個SSRs位點進行引物設(shè)計。根據(jù)基因Unigene ID在Ensembl數(shù)據(jù)庫中查到SSR位點所對應(yīng)的基因序列，從中選出合理長度并包含SSR位點的序列，使用Primer 3.0最終成功設(shè)計154對引物，由上海生工合成，部分引物信息見表1。

1.3.3 PCR擴增及多態(tài)性位點的篩選 按照酚/氯仿抽提法提取豬耳組織基因組DNA。將馬身豬、大白豬、晉汾白豬、山西黑豬等4個豬種分別10個 DNA樣品取適量體積，均勻混合為1個DNA池，最終每個豬種混合為3個DNA池。以混合DNA池為模板，用合成的154對引物進行PCR擴增和PAGE電泳，篩選多態(tài)性位點。PCR反應(yīng)總體積為10 μL：DNA模板1.0 μL，2×Taq Plus Master MixⅡ 5.0 μL，Primer F(10 μmol·L-1)和Primer R(10 μmol·L-1)各0.5 μL，ddH2O加3.0 μL。 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s， 退火(表1)30 s， 72 ℃延伸30 s，35次循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min，最后4 ℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測效果較好的產(chǎn)物經(jīng)100 g·L-1聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，可產(chǎn)生豐富多態(tài)性的SSR位點即為新篩選的SSR標(biāo)記。利用篩選的多態(tài)性SSR對4個豬群體中所有個體進行PCR擴增和PAGE檢測，以評價新開發(fā)SSR位點的有效性和群體遺傳多樣性。

表1 引物信息

1.3.4 SSR多態(tài)性位點的克隆測序 為了驗證本研究所獲取SSR標(biāo)記的準確性，對部分位點進行了克隆測序。采用“1.3.3”條件進行PCR擴增，總體系為200 μL。采用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，使用Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0對目的片段進行切膠回收，利用ND-1000核酸蛋白測定儀測定回收DNA濃度。將回收產(chǎn)物與pMD 18-T Vector 16 ℃連接過夜，采用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH-5α感受態(tài)細胞中，在固體培養(yǎng)基中使用Amp抗性、X-Gal與IPTG篩選陽性菌株，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取陽性單個白色菌落在含Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，隨后進行菌液PCR鑒定，最后篩選陽性菌液送至華大基因公司測序。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 使用Pop Gene 3.2軟件統(tǒng)計SSR位點的平均等位基因數(shù)(allele number,Na)、有效等位基因數(shù)(effective allele number,Ne)、觀測雜合度(observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity,He)等參數(shù)；使用PIC CALC程序計算多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC)；使用NTsys 2.10e軟件計算遺傳距離。

2 結(jié) 果

2.1 SSR位點數(shù)量與分布特征

利用MISA搜索豬轉(zhuǎn)錄組序列SSR位點，設(shè)置的SSR長度均大于10 bp。結(jié)果從36 693條轉(zhuǎn)錄組Unigene序列(序列長度>1 kb)中搜索到10 488個SSRs位點，分布于6 953條Unigene序列中，堿基數(shù)目總長度221 838 bp，平均長度為21.15 bp。SSR發(fā)生頻率(含有SSR的Unigene數(shù)目與總Unigene數(shù)目之比)為18.95%，出現(xiàn)頻率(檢出SSR個數(shù)與總Unigene數(shù)目之比)為28.58%。其中4 727條Unigene含有單個SSR，2 226條Unigene含有2個及以上SSRs。在評估的所有Unigene序列中，SSR位點類型以純合型為主，有9 424個，以復(fù)合型存在的SSR有1 064個。

豬轉(zhuǎn)錄組SSR位點重復(fù)類型多樣，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)的SSR均有出現(xiàn)，所占比例變化較大。SSR位點數(shù)量分析結(jié)果見表2，單核苷酸、三核苷酸及二核苷酸重復(fù)是優(yōu)勢重復(fù)類型，分別有6 428、 2 414、1 413個，占比分別為61.29%、23.02%和13.47%；四、五、六核苷酸重復(fù)的分布頻率逐漸遞減，占比分別為1.62%、0.4%和0.2%。除三核苷酸重復(fù)外，SSR分布頻率隨核苷酸重復(fù)數(shù)增加而依次遞減。SSR重復(fù)次數(shù)主要集中于5～22次， 其中在5～11次的SSR最多，有6 032個，占比為57.51%；在12～22次的SSR次之，有3 917個，占比為37.35%；重復(fù)次數(shù)>22的SSR數(shù)量最少，有539個，占比為5.14%；重復(fù)次數(shù)在5～11、12～22、>22的SSR數(shù)量依次減少，表明SSR位點數(shù)隨重復(fù)次數(shù)的增加總體上呈現(xiàn)下降趨勢。其中單、二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)數(shù)量最多的重復(fù)次數(shù)分別在12～22、6、5、5、5、5次。

表2 基于轉(zhuǎn)錄組豬SSR重復(fù)類型特征

2.2 SSR位點基序長度特征

統(tǒng)計SSR基序類型，將所有可循環(huán)的堿基序列及其互補堿基序列歸為一類。統(tǒng)計結(jié)果見表3，SSR共有121種基序類型，單至六核苷酸重復(fù)的基序類型分別有2、6、28、48、19、18種。SSR基序類型多樣(圖1)，其中單核苷酸重復(fù)的A/T類型數(shù)量最多，有5 804個，在單核苷酸重復(fù)中的占比為90.29%，總占比為55.34%；雙核苷酸重復(fù)的AC/GT類型數(shù)量最多，有400個，所占本類型比例為28.31%，總占比為3.81%；CA/TG的數(shù)量也較多，有392個，所占本類型比例為27.74%，總占比為3.74%；三核苷酸重復(fù)的GCC/GGC數(shù)量最多，有404個，所占本類型比例為16.74%，總占比為3.85%；CGC/GCG次之，有230個，所占本類型比例為9.53%，總占比為2.19%；四核苷酸重復(fù)的AAAC/GTTT數(shù)量最多，有20個，所占本類型比例為11.76%，總占比為0.19%；五核苷酸重復(fù)的AAAAC/GTTTT數(shù)量最多，有8個，所占本類型比例為19.05%；六核苷酸重復(fù)中的18種基序類型中，AGGCGC/GCGCCT、CCGGGG/CCCCGG均有2個，所占本類型比例均為9.52%；其余15種六核苷酸重復(fù)的基序類型均有一個，所占本類型比例共為71.43%。

圖1 基于轉(zhuǎn)錄組豬不同基序類型分布

表3 基于轉(zhuǎn)錄組豬SSR基序類型分布

2.3 豬轉(zhuǎn)錄組SSR可用性評價

SSR標(biāo)記在種群中的多態(tài)性及多態(tài)性的高低是判斷其可用性的依據(jù)，而SSR序列片段總長度是影響多態(tài)性高低的重要因素之一。為了提高微衛(wèi)星潛在的多態(tài)性差異，并增加結(jié)果的實用性，本研究只搜索長度在10 bp以上的SSR。結(jié)果見圖2，所發(fā)現(xiàn)的10 488個微衛(wèi)星長度存在顯著差異，轉(zhuǎn)錄組SSR基序長度大多為10～20 bp，共7 817個，占比為74.53%；其次為21～30 bp，共1 480個，占比為14.11%；30 bp以上的微衛(wèi)星數(shù)量相對較少，共1 191個， 占比為11.36%。研究結(jié)果表明，基于豬轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果獲得的SSR標(biāo)記基序片段長度大多較長，總體具有較高的多態(tài)性和較強的實用性。

圖2 基于轉(zhuǎn)錄組的豬SSR重復(fù)長度分布圖

2.4 SSR引物有效性檢測

用設(shè)計成功的154對引物對馬身豬、大白豬、晉汾白豬及山西黑豬等4個群體共120份DNA進行擴增，共有124對引物能擴增出明亮、特異的條帶，擴增效率為80.52%。經(jīng)100 g·L-1聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，有25對SSR引物具有多態(tài)性(圖3)，占比為16.23%。

M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(100～500 bp)；A、B、C、...... 為等位基因

2.5 SSR多態(tài)性位點克隆測序驗證

選擇多態(tài)性較好的6對引物P10、P22、P24、P59、P61、P66進行擴增，對PCR產(chǎn)物進行克隆測序，測序結(jié)果符合微衛(wèi)星特征(圖4)，且與RNA-seq結(jié)果及聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果相符，表明本研究獲得的SSR位點真實可靠。

圖4 6對SSR引物的測序結(jié)果

2.6 SSR在不同豬種的遺傳多樣性分析

用上述開發(fā)的25個多態(tài)性SSR引物檢測馬身豬、大白豬、晉汾白豬及山西黑豬等4個群體的遺傳多樣性，共獲得131個等位基因，等位基因數(shù)為2～7個，平均等位基因數(shù)為5.24，平均有效等位基因數(shù)為3.487 1。各位點PIC值介于0.378 3～0.805 3之間，平均值為0.646 7，觀測雜合度、期望雜合度分別為0.200 0～0.931 0、0.277 8～0.829 2。

不同豬種各位點等位基因頻率見表4，不同等位基因分布不均勻，各個位點都有優(yōu)勢等位基因存在，其等位基因頻率大于0.5。就大白豬而言，P10A(P10的A等位基因，下同)、P24B、P146A等等位基因分別是其座位上的優(yōu)勢等位基因；就馬身豬而言，P10B、P24A、P146A、P147A等分別是其座位上的優(yōu)勢等位基因；就晉汾白豬而言，P10A、P24A、P56A、P146A、P147A等分別是其座位上的優(yōu)勢等位基因；就山西黑豬而言，P10A、P56A、P146A、P147A等分別是其座位上的優(yōu)勢等位基因。同時，P24E、P24F僅在馬身豬中出現(xiàn)，是馬身豬特有的等位基因，可作為區(qū)分馬身豬與其它品種的特異性標(biāo)記；P147D僅在山西黑豬中出現(xiàn)，可初步判定這些等位基因或者其組合可以作為品種特異性標(biāo)記。

表4 部分位點等位基因頻率

25對多態(tài)性引物中有23對引物在4個豬群中總體PIC大于0.5，屬于高度多態(tài)位點，而P10和P146在4個群體中的PIC均小于0.5，屬于中度多態(tài)(表5)。每個位點在不同豬種的多態(tài)性表現(xiàn)略有差異，馬身豬的P56位點多態(tài)性最高，其PIC為0.618 7；晉汾白豬的P69位點多態(tài)性最高，其PIC為0.716 8，表明馬身豬和晉汾白豬遺傳多樣性豐富。

表5 部分SSR引物在不同豬群體中的遺傳多樣性參數(shù)

2.7 不同豬群體間的遺傳相似性和遺傳距離分析

本研究利用25個微衛(wèi)星位點分析了馬身豬、大白豬、晉汾白豬及山西黑豬等4個群體間的奈氏遺傳相似性和遺傳距離，結(jié)果見表6。4個豬種間的遺傳相似性在0.473 7～0.800 7之間，其中，晉汾白豬與大白豬的遺傳相似性最高，為0.800 7，山西黑豬與晉汾白豬的遺傳相似性最低，為0.473 7。4個豬種間的遺傳距離在0.200 1～0.526 3之間，其中，晉汾白豬與大白豬的遺傳距離最近，為0.200 1，與馬身豬的次之，為0.428 6。該結(jié)果與晉汾白豬遺傳組成相一致。晉汾白豬是以大白豬、長白豬、馬身豬、二花臉為親本雜交培育而成的品種，在遺傳組成上，大白豬占50%的血液，馬身豬占6.25%的血液[28]。

表6 4個豬種間的遺傳相似性和遺傳距離

3 討 論

3.1 基于轉(zhuǎn)錄組的微衛(wèi)星分布與特征分析

本研究對豬轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中的Unigene進行SSR位點分布及序列特征分析，結(jié)果從36 693條 Unigene中找到10 488個SSRs位點，共分布于6 953條 Unigene。SSR發(fā)生率為18.95%，與其他物種相比，本研究中SSR位點的發(fā)生頻率明顯低于牙鲆轉(zhuǎn)錄組中的發(fā)生頻率(27.12%)[29]，而高于中華蜜蜂幼蟲腸道轉(zhuǎn)錄組SSR位點的出現(xiàn)頻率(17.82%)[30]，產(chǎn)生差異的原因可能與物種特異性有關(guān)，也可能與搜索標(biāo)準的設(shè)定、原始序列數(shù)據(jù)、軟件類型、長度不同等有關(guān)。

本研究中，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的SSR種類豐富，包含一至六核苷酸重復(fù)類型，除單核苷酸重復(fù)外，三、二、四核苷酸重復(fù)為其優(yōu)勢重復(fù)類型，分別有2 414、 1 413、170個，占比分別為23.02%、13.47%、1.62%，共占97.78%，五、六核苷酸重復(fù)類型數(shù)量較少，共計2.22%。本結(jié)果與大黃魚[31]和美洲大蠊[32]的優(yōu)勢重復(fù)類型情況相同，與多數(shù)報道的以二、三、四核苷酸重復(fù)為其優(yōu)勢重復(fù)類型的鯉魚[33]、團頭魴[34]、東方實蠅[35]等不同，可能與物種特異性主導(dǎo)微衛(wèi)星重復(fù)類型有關(guān)。重復(fù)基序類型中，二核苷酸重復(fù)的AC/GT類型出現(xiàn)的頻率最高，與裂口腹魚[36]情況一致；三、四核苷酸重復(fù)基序類型中，GCC/GGC和AAAC/GTTT出現(xiàn)的頻率最高，其與日本七鰓鰻[37]和黃鯰[38]情況不同。并且所有三核苷酸重復(fù)類型中，GC含量較高，這種差異可能與物種組成結(jié)構(gòu)相關(guān)，也可能與轉(zhuǎn)錄組SSR來源、密碼子偏倚、編碼蛋白質(zhì)頻率較高有關(guān)，表明豬在生物進化地位中可能位于較高的進化水平。SSR位點多態(tài)性由于堿基數(shù)和重復(fù)數(shù)的不同而產(chǎn)生序列長度多態(tài)性。本轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的微衛(wèi)星基序長度大多集中于10～20 bp，共7 817個，占比74.53%；其次為21～30 bp，共1 480個，占比14.11%；大于30 bp的數(shù)量較少，共1 191個，占比11.36%。Temnykh等[39]提出，SSR長度大于或等于20 bp時，多態(tài)性較高，長度為10～20 bp的多態(tài)性中等，小于10 bp的多態(tài)性極低。所以本轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)掘的SSR位點大多具有多態(tài)性潛能且多態(tài)性較高，可用于SSR標(biāo)記的開發(fā)以及遺傳多樣性分析。

3.2 基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果開發(fā)SSR標(biāo)記

理想情況下，微衛(wèi)星屬于中性DNA標(biāo)記，其特征相對恒定，只受隨機過程影響，如突變和遺傳漂變。但由于人工選擇的存在，微衛(wèi)星標(biāo)記實際上并不完全中立，過去開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記用于現(xiàn)在的遺傳育種工作，其準確性和實用性就會受到限制。Brenig和Schütz[40]研究表明，2004—2014年，ISAG推薦的12個微衛(wèi)星組合標(biāo)記小組對于牛親子鑒定準確性下降，需添加新的微衛(wèi)星標(biāo)記增加其準確性。但傳統(tǒng)開發(fā)SSR標(biāo)記效率低下，費用昂貴，隨著高通量測序技術(shù)的興起，使得基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果開發(fā)新SSR標(biāo)記變得簡便高效。

Liu等[41]基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果隨機挑選出100個位點，共有31個新開發(fā)的微衛(wèi)星位點顯示出多態(tài)性，從中篩選出20個微衛(wèi)星用于大白鱘的親子關(guān)系分析，其結(jié)果準確可靠。Gao等[42]基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，隨機選擇50個SSRs位點檢測多態(tài)性，最終35對引物成功擴增，并在28只斑點海豹個體中檢測到顯著多態(tài)性。Lu等[43]基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，隨機選擇43對引物對西伯利亞虎的DNA進行檢測，最終14對引物的擴增產(chǎn)物具有多態(tài)性，開發(fā)的SSR標(biāo)記成功應(yīng)用于野生和圈養(yǎng)西伯利亞虎的種群遺傳分析。Zhang等[44]基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，隨機選擇300對SSR引物，對長湖、洪湖、南湖及洞庭湖的4個野生黃顙魚群體進行擴增驗證，其中263對引物有效擴增，57對引物在48條黃顙魚個體中被鑒定為多態(tài)性SSR位點。本研究基于豬RNA-seq結(jié)果，隨機選擇154個預(yù)測的SSRs位點檢測多態(tài)性，最終在馬身豬、大白豬、晉汾白豬及山西黑豬等4個群體中篩選到25個高多態(tài)性位點。以上結(jié)果表明，基于高通量轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果開發(fā)SSR標(biāo)記是可行的，且能夠用于動物的遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、親子鑒定等遺傳育種工作。

3.3 不同豬種遺傳多樣性分析

本研究基于RNA-seq結(jié)果開發(fā)出25個SSRs標(biāo)記，將其應(yīng)用于4個群體的遺傳多樣性分析，結(jié)果共識別到131個等位基因，等位基因數(shù)為2～7個，平均等位基因數(shù)為5.24，平均有效等位基因數(shù)為3.487 1，平均PIC為0.646 7，平均Shannon指數(shù)為1.355 1，總體表現(xiàn)出較高的多樣性。賀希文等[45]采用19個SSRs分析大白豬群體的遺傳多樣性，平均PIC為0.565 2；李楨等[46]研究表明，大白豬群體的PIC為0.408 4；與本研究結(jié)果相比，兩者均低于本研究結(jié)果(0.617 2)，表明本研究開發(fā)的SSR標(biāo)記多態(tài)性高。曹果清等[47]利用FAO-ISAG推薦的21個微衛(wèi)星標(biāo)記檢測馬身豬遺傳多樣性變化趨勢，發(fā)現(xiàn)馬身豬群體PIC為0.341～0.441；而本研究中，馬身豬群體的遺傳多樣性較高，平均PIC為0.588 9，高于前者研究結(jié)果，表明本研究獲取的SSR標(biāo)記多態(tài)性高，能充分反映馬身豬群體的遺傳多樣性，這與馬身豬豐富的遺傳組成相一致。

4 結(jié) 論

本研究基于豬轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果開發(fā)出25個多態(tài)性較高的SSRs標(biāo)記，可用于馬身豬、大白豬、晉汾白豬及山西黑豬等4個群體的遺傳多樣性分析，結(jié)果豐富了豬可用SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)庫，對豬的起源進化、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、親子鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助育種等具有重要意義。