基于16S rDNA測序及培養(yǎng)基法探究虹鱒魚貯藏優(yōu)勢腐敗菌

周 慧， 蓋園明， 徐 超， 付紹平， 林心萍， 張大偉*

(1.大連工業(yè)大學 食品學院，遼寧 大連 116034；2.中國科學院 天津工業(yè)生物技術研究所，天津 300000)

虹鱒魚原產自北美洲北部地區(qū)和太平洋西岸地區(qū)，是鮭科、太平洋鮭屬的冷水性魚類，在中國已經大范圍養(yǎng)殖[1]。虹鱒魚是高級魚類之一，品種較為名貴，其肉質鮮嫩，味道鮮美，無腥味，也沒有小骨刺[2]。由于虹鱒魚魚肉中蛋白質、脂肪的含量較高，在貯藏過程中容易受到微生物及酶的作用，導致其腐敗變質[3]。微生物因素對虹鱒魚腐敗過程起著至關重要的作用[4]。因此鑒定虹鱒魚在貯藏過程中的優(yōu)勢腐敗菌對于虹鱒魚保鮮具有重要意義。16S rDNA由10個保守區(qū)域和9個高變區(qū)域構成，位于原核細胞核糖體小亞基上。16S rDNA保守區(qū)域的差異性在不同的細菌之間不大，而高變區(qū)域在不同的屬或種之間存在特異性，隨細菌間親緣關系不同存在差異。因此將16S rDNA作為特征核酸序列用來揭示生物物種特性，是最適合用于細菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的指標[5]。16S rDNA擴增子測序，是指選擇其中一個或幾個變異區(qū)域，對保守區(qū)域設計通用引物進行PCR擴增，然后利用高變區(qū)進行測序分析和菌種鑒定[6]。16S rDNA擴增子測序技術已成為研究環(huán)境樣品中微生物群落組成結構的重要手段[7]。常見的腐敗菌致腐能力鑒定方法有兩種，分別是將待測菌種接種于無菌魚塊或者無菌魚汁中。無菌魚塊雖然能作為天然培養(yǎng)基模擬自然貯藏環(huán)境，但是只能在制備過程中盡量保證無菌，魚塊本身存在的微生物無法去除，因此會對實驗結果產生干擾。而對于無菌魚汁可選用高溫高壓滅菌，在保證絕對無菌的同時，額外補充一些氨基酸類物質，能夠保證腐敗菌生長的營養(yǎng)需求[8]。此外有研究表明，以揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)作為腐敗指標，分析無菌魚汁中腐敗菌腐敗能力的方法更為可靠[9]。因此，將腐敗菌種接種到無菌魚汁的方法在時效性和可靠性方面都更具有優(yōu)勢。本研究通過菌落總數及揮發(fā)性鹽基氮含量等指標對虹鱒魚腐敗周期進行確定，通過16S rDNA高通量測序方法分析虹鱒魚貯藏的各個時期腐敗菌種類及相對豐度。同時采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，使用選擇培養(yǎng)基分離常見的水產品優(yōu)勢腐敗菌假單胞菌屬及希瓦氏菌屬。利用無菌虹鱒魚魚汁模擬腐敗菌生存環(huán)境，通過接種實驗，以腐敗菌菌落總數及揮發(fā)性鹽基氮含量作為評價指標，鑒定腐敗菌的致腐能力，從而獲得虹鱒魚在0 ℃貯藏條件下的優(yōu)勢腐敗菌，為虹鱒魚腐敗機制的研究以及保鮮劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料及預處理 新鮮虹鱒魚購自天津SM超市，及時運回實驗室，立即殺死，去除頭、骨及內臟，處理成60 g左右的魚片裝入自封袋，放置于冰盒中，并及時更換新冰，保證貯藏環(huán)境的低溫狀態(tài)。定期取樣檢測。

1.1.2 培養(yǎng)基 假單胞菌選擇性培養(yǎng)基(CFC)、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基(TSI)購自青島海博生物技術有限公司；LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,氯化鈉10 g/L,瓊脂粉15 g/L，水1 L。

1.1.3 試劑與儀器 細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；DNA聚合酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司。XP-基因擴增儀(TC-XP-G，杭州博日科技有限公司)；全自動鼓風干燥箱(ZFD-A5090，上海智城分析儀器制造有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(HPX-9162 MBE，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWY-240，上海智城分析儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌落總數測定 參考國標GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》中的方法[10]。每3 d取10 g魚肉樣品攪碎，與90 mL生理鹽水混合均勻，震蕩5 min后取上清液梯度稀釋，選擇合適的稀釋梯度，取1 mL傾注PCA培養(yǎng)基并搖勻，每個梯度2個重復，30 ℃培養(yǎng)48 h后計數。

1.2.2 揮發(fā)性鹽基氮的測定 參考國標GB 5009.228-2016《食品安全國家標準食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中第一法半微量定氮法進行測定[11]。每3 d取20 g魚肉樣品，攪碎后準確加入100 mL蒸餾水，不時震蕩，使樣品分散均勻，浸漬30 min后過濾取濾液。利用半微量定氮裝置進行蒸餾，用鹽酸標準滴定溶液滴定。

1.2.3 16S rDNA高通量測序 ①樣本提?。簾o菌環(huán)境條件下，取貯藏的初期、中期和末期的魚片樣品，分別于魚片的不同位置取樣，共取10 g魚肉樣品，混合均勻。將樣品送至北京諾禾致源公司進行微生物多樣性檢測。②DNA抽提和多樣性檢測：CTAB法提取魚肉樣本中微生物的基因組，將得到的基因組進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。以提取的基因組為擴增模板，再利用515F和806R兩條引物對V4可變區(qū)進行PCR擴增，目的產物利用膠回收試劑盒回收。使用建庫試劑盒進行文庫構建，檢測合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL進行上機測序。對測序結果初步質控并去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數據(Clean Reads)。使用Uparse軟件對Clean Reads進行聚類，默認將97%的一致性的序列聚類成為OTUs。

1.2.4 優(yōu)勢腐敗菌的分離鑒定 將貯藏末期的樣品攪碎后加無菌水進行梯度稀釋，選取適宜的濃度，分別涂布在假單胞菌選擇性培養(yǎng)基(CFC)和三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基(TSI)上，30 ℃培養(yǎng)48 h，挑取菌落形態(tài)不同的單菌落劃線純化3次。將純化后的單菌落接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)12 h后，使用細菌基因組提取試劑盒提取基因組。使用細菌通用引物1492r和27f對16S區(qū)域進行PCR擴增。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將產物送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序，測序結果進行BLAST分析比對。

1.2.5 無菌虹鱒魚汁的制備 鮮活虹鱒魚去除頭、骨及內臟后，攪碎，每1 000 g魚肉加入500 mL蒸餾水，混合均勻后，加熱煮沸5 min，混合物過濾后得到魚汁。每1 000 mL魚汁加入氧化三甲胺(TMAO)1.6 g，L-半胱氨酸和L-甲硫氨酸各40 mg，以補充加熱可能損失的營養(yǎng)物質?；旌暇鶆蚝螅?21 ℃高壓滅菌15 min得到無菌魚汁[12]。

1.2.6 菌懸液的制備 將1.2.4中分離得到的優(yōu)勢腐敗菌在LB培養(yǎng)基活化兩次，以1%(體積分數)接種量接種于LB培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)12～18 h，使菌體有效活菌數達到109cfu/mL，4 ℃條件下12 000 g離心10 min，收集菌體，無菌生理鹽水重懸，得到菌懸液。

1.2.7 接種實驗 吸取20 μL菌懸液(OD600為0.1)接種于400 mL無菌魚汁中，對照組為20 μL無菌生理鹽水。分別于第0天、第3天、第6天、第9天、第12天、第15天取樣，測定菌落總數及揮發(fā)性鹽基氮含量，確定優(yōu)勢腐敗菌的致腐能力，方法見1.2.1、1.2.2。以揮發(fā)性鹽基氮產量因子YTVB-N/cfu作為評估優(yōu)勢腐敗菌腐敗能力的指標[13]。

2 結果與分析

2.1 虹鱒魚貯藏期間品質變化情況

影響水產品貨架期的因素有很多，包括環(huán)境溫度、初始微生物污染情況和微生物的生長繁殖情況[14]。菌落總數可以反映水產品在貯藏過程中受微生物污染情況，也能作為評價水產品腐敗情況的指標之一。如圖1所示，虹鱒魚在0 ℃貯藏條件下，菌落總數在逐步增長。在貯藏的第6天時,菌落總數達到了5.59 lg(cfu/g)，第12天時菌落總數增長到7.36 lg(cfu/g)。參考食品國家標準相關規(guī)定(≤ 105cfu/g)[15]，可以判定虹鱒魚片0 ℃貯藏條件下的貨架期為5 d。參考國際微生物規(guī)格委員會規(guī)定的食品微生物最高安全限值(≤107cfu/g)[16]，判定在該貯藏條件下的虹鱒魚貯藏12 d已經腐敗。

圖1 0 ℃貯藏條件下菌落總數變化情況Fig.1 Change of total bacterial count under 0 ℃ storage

揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)產生的原因是在腐敗過程中，魚肉在酶和細菌的作用下使蛋白質分解產生的氨以及胺類等堿性含氮物質[17]。揮發(fā)性鹽基氮同樣可以作為評價腐敗的標準之一。此類物質有一定的揮發(fā)性，揮發(fā)性鹽基氮的含量越高，表明樣品的腐敗程度越高。如圖2所示，虹鱒魚片在整個貯藏過程中，揮發(fā)性鹽基氮持續(xù)積累，在貯藏末期達到最高值18.344 mg/100 g，雖未達到腐敗標準，但已接近不可食用程度[18]。

圖2 0 ℃貯藏條件下TVB-N變化情況Fig.2 Change of TVB-Nt under 0 ℃ storage

綜合菌落總數及揮發(fā)性鹽基氮含量變化情況，確定貯藏的第5天為0 ℃貯藏條件下的貨架期終點。

2.2 16S rDNA測序結果及優(yōu)勢腐敗菌分離鑒定

2.2.1 Alpha多樣性分析 Alpha Diversity用于分析樣品內部的微生物群落多樣性，可以反映樣品內部微生物群落的相對豐度以及多樣性[19]。如圖3所示，3個樣品的稀釋曲線都逐步趨于平緩，即斜率趨于0，說明測序結果的數據量合理，再多的序列量也不會產生新的物種(OTUs)。此外，由稀釋曲線可知，虹鱒魚樣品在第5天時物種相對豐度最大，在第8天時物種相對豐度最小?？梢哉f明優(yōu)勢菌在貯藏過程中，會抑制其他菌株的生長繁殖，使物種數量趨于單一。以得到的OTUs按相對豐度進行排序，繪制Rank Abundance曲線。Rank Abundance曲線能夠直觀地反映樣品中物種的相對豐度和均勻度。水平方向能夠說明物種的相對豐度，曲線在橫軸上的跨度越大，其物種相對豐度越高；垂直方向上曲線的平滑程度能夠說明物種的均勻程度，曲線越平緩，物種分布越均勻[20]。由圖4所示，曲線從左到右分別為第8天、第0天和第5天樣本的Rank Abundance曲線，可知虹鱒魚樣品貯藏過程中第5天，物種相對豐度最高，第8天物種相對豐度最低。

圖3 稀釋曲線Fig.3 Dilution curve

圖4 Rank Abundance曲線Fig.4 Rank Abundance curve

如表1所示，Alpha多樣性指數反映微生物分布的相對豐度及均勻程度。其中，反映群落分布相對豐度的指數有chao1和ACE指數，由表1可知，虹鱒魚在0 ℃貯藏條件下第5天的物種相對豐度最大，第8天的物種相對豐最小；反映群落分布多樣性的指數有shannon和simpson，由表1可知，虹鱒魚在4 ℃貯藏條件下貯藏第5天的群落多樣性最大，第8天的群落多樣性最??；goods_coverage指數用來表示本次測序結果能否代表樣本的真實情況[21]，經過檢測的3個樣品的coverage值都達到了0.99以上，表示樣品文庫的覆蓋率高，有很小的可能性序列未被檢出，因此本次檢測結果能夠用于樣品微生物多樣性分析。

表1 0 ℃貯藏條件下貯藏不同時間的虹鱒魚樣品的多樣性指數

2.2.2 虹鱒魚貯藏過程菌群變化情況 高通量測序技術的優(yōu)點在于不需要對微生物進行分離培養(yǎng)，是一種快速檢測技術。高通量測序技術不僅可以檢測出不易培養(yǎng)的優(yōu)勢微生物，同時能夠確定樣品中優(yōu)勢微生物的相對豐度[22]。在虹鱒魚魚肉樣品上檢測到變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、醋桿菌門(Acidobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)等菌落，選取豐度前10的菌種繪制成門水平的菌落結構分布圖。由圖5可知，虹鱒魚在貯藏初期厚壁菌門所占比例最大，達到67.44%,其次為擬桿菌門，所占比例為22.23%；隨著貯藏時間的延長，厚壁菌門和擬桿菌門所占比例逐步減少，到貯藏末期分別占比6.00%和0.29%。而變形菌門的所占比例隨著貯藏時間的延長，所占比例逐漸提高，從貯藏初期的5.28%增長到72.14%，最終達到93.33%成為優(yōu)勢菌。變形菌門中包括水產品常見的腐敗菌，如假單胞菌屬、希瓦氏菌屬等，在水產品腐敗過程中發(fā)揮著重要作用。

圖5 虹鱒魚貯藏過程菌群變化情況(門水平)Fig.5 Changes of microflora during storage of rainbow trout (phylum level)

在虹鱒魚魚肉樣品上檢測到不動桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、擬桿菌屬(Bacteroides)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、乳桿菌屬(Lactococcus)等菌落，選取豐度前30的菌種繪制成屬水平的菌落結構分類圖。

如圖6所示，貯藏第0天存在多種菌屬種類，所占比例最高的菌屬為擬桿菌屬，隨著貯藏時間的延長，不動桿菌屬、假單胞菌屬所占比例顯著提高。不動桿菌屬從最初的0.2%逐漸增長到37.37%，貯藏末期達到70.59%，成為優(yōu)勢菌；假單胞菌屬從0.2%增長到5.33%，最終達到13.32%。到貯藏末期，除不動桿菌屬、假單胞屬外，希瓦氏菌屬也占有較大比例，達到1.13%。而擬桿菌屬在貯藏過程中在逐漸消失。此外，魚肉樣品在貯藏初期，菌群種類極為豐富，而隨著貯藏時間的延長，物種的相對豐度逐步下降，趨于單一。

圖6 虹鱒魚貯藏過程中菌群變化情況(屬水平)

結合菌群總數變化情況以及各菌群所占比例，隨著魚肉貯藏時間的延長，優(yōu)勢菌群并可能發(fā)揮腐敗作用的菌群數量在逐漸增多，與之相對的，生長環(huán)境不適宜，無法有效利用虹鱒魚魚肉環(huán)境而生長的菌群數量在逐漸減少，甚至消失。很可能特定腐敗菌代謝產物對其他菌屬的生長起到負面作用，從而抑制其他菌的生長繁殖。

2.3 典型菌株致腐能力分析

利用選擇性培養(yǎng)基分離得到9株假單胞菌屬菌株(P1:Pseudomonasfragistrain ATCC 4973；P2:Pseudomonasfluorescensstrain KBL29；P3:Pseudomonasfluorescensstrain CP DA19；P4:Pseudomonasfluorescensstrain KBL17；P5:Pseudomonasputidastrain DSQ4；P6:Pseudomonasfragistrain NBRC 3458；P7:Pseudomonasfragistrain 2-2；P8:Pseudomonasfragistrain Sneb811；P9:Pseudomonasfragi)及2株希瓦氏菌屬菌株(S1:Shewanellasp. S05；S2:Shewanellasp. S5-52)，高通量測序結果也同時檢測到這兩個菌屬。之后根據揮發(fā)性鹽基氮產量因子對其致腐能力進行分析。由圖7可知，S2菌株的揮發(fā)性鹽基氮含量在整個貯藏期間的積累量最多，一直到貯藏末期從初始的14.87 mg/100 g增加到100.56 mg/100 g。其次是P5菌株，從14.87 mg/100 g增加到73.32 mg/100 g。初步判定這兩株菌的致腐能力較強。而P4、P8兩株菌的揮發(fā)性鹽基氮含量的積累與對照組幾乎一致，在整個貯藏期間沒有揮發(fā)性鹽基氮的產生及積累，說明這兩株假單胞菌菌株無致腐能力。

圖7 接種優(yōu)勢腐敗菌的魚汁貯藏過程揮發(fā)性鹽基氮變化情況Fig.7 Changes of volatile base nitrogen during storage of fish juice inoculated with dominant spoilage bacteria

由圖8可知，所有菌株的菌落總數均呈現逐日遞增的趨勢。而在貯藏第9天之后，部分菌株的菌落總數開始有減少的趨勢或是趨于平穩(wěn)，說明菌株生長到達了衰退期或穩(wěn)定期。隨著貯藏時間的增加，培養(yǎng)環(huán)境中的營養(yǎng)物質不斷地被消耗，菌株分泌的有毒有害物質逐漸積累，菌株的生長受到抑制。在貯藏第9天開始，大部分腐敗菌開始出現死亡現象。因此，選擇第9天作為觀察點，對優(yōu)勢腐敗菌的致腐能力進行評價。

圖8 接種優(yōu)勢腐敗菌的魚汁貯藏過程菌落總數變化情況Fig.8 Changes of the total number of colonies during the storage of fish juice inoculated with dominant spoilage bacteria

由于不同腐敗菌所需營養(yǎng)物質不同，生長代謝存在一定差異，因此將菌落總數與揮發(fā)性鹽基氮相結合，通過產量因子Y(TVB-N/cfu)定量表征各優(yōu)勢腐敗菌的腐敗能力[23]。表2數據顯示，致腐能力最強的菌株為S2，TVB-N產量因子可達15.13×10-8mgTVB-N/cfu，其次是P5以及P1菌株，說明在虹鱒魚貯藏過程中，希瓦氏菌屬的致腐能力強于假單胞菌屬。希瓦氏菌是一種嗜冷性及產硫能力極強的菌屬[24],是虹鱒魚貯藏過程中的優(yōu)勢腐敗菌屬。

表2 各種腐敗菌的TVB-N產量因子

3 討 論

虹鱒魚在0 ℃貯藏過程菌落總數持續(xù)增長，在貯藏第6天時達到5.59 lg(cfu/g)，已經超過相應的衛(wèi)生標準，達到虹鱒魚貯藏的貨架期。同時腐敗產物揮發(fā)性鹽基氮在貯藏過程中逐漸積累，在貯藏第15天時達到18.344 mg/100 g，說明虹鱒魚魚片在貯藏過程中品質逐漸下降。利用16S rDNA測序技術對虹鱒魚貯藏初期、中期、末期的菌群變化情況進行測定。結果表明，在貯藏末期的優(yōu)勢菌群為假單胞菌屬、不動桿菌屬和希瓦氏菌屬等。利用選擇性培養(yǎng)基分離水產品常見腐敗菌假單胞菌屬及希瓦氏菌屬，高通量測序結果同時包含這兩種菌屬，對這兩種菌屬部分菌株的腐敗能力進行評價，結果顯示，優(yōu)勢腐敗菌中的一株希瓦氏菌屬在虹鱒魚貯藏過程中的致腐作用強于其他假單胞菌屬的致腐作用。

本研究主要利用高通量測序技術及傳統(tǒng)培養(yǎng)分離技術分別從群落數量及致腐能力兩方面分析特定腐敗菌種類。對比兩種技術特點，高通量測序可以幾乎完全覆蓋樣品中的物種種類，反映各貯藏時期的物種組成，從數量上分析腐敗菌種類，但無法對具體物種的致腐能力進行有效分析。利用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離手段分離特定腐敗菌，進而對其致腐能力進行分析，可以更準確地了解各菌屬的致腐能力，但同時無法兼顧各個物種及各個物種中的每株細菌。例如同屬假單胞菌屬的菌株，有部分菌株卻不具備致腐能力。兩種方法各具特點，在研究中應結合兩種方法更加深入地探究水產品的優(yōu)勢腐敗菌。

本研究確定了虹鱒魚貯藏過程的特定腐敗菌為希瓦氏菌屬。有研究表明，大黃魚[25]和鱸魚[26]在冷藏過程中的優(yōu)勢腐敗菌均為希瓦氏菌屬。通過與其他腐敗菌致腐能力進行比較，結果表明，希瓦氏菌屬的致腐能力最強，這與本研究結果相一致。有相關文獻報道，希瓦氏菌生長過程產生大量硫化物，是產硫能力較強的菌屬[27]。同時能夠形成大量生物膜，說明其黏附能力較強，更容易黏附在水產品表面。此外，有研究表明希瓦氏菌株可以竊聽外源群體感應信號分子，增強自身的致腐能力[28]。因此，希瓦氏菌能夠在虹鱒魚貯藏過程中逐漸成為優(yōu)勢菌群，并對虹鱒魚的腐敗產生巨大作用。本研究揭示了虹鱒魚貯藏過程中的特定腐敗菌，為虹鱒魚腐敗機制的研究及虹鱒魚保鮮劑的開發(fā)提供參考。