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    延齡草苷通過上調(diào)miR-1247-3p表達減輕高糖誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞損傷

    2021-06-30 03:23:42馬金蘭王青牛浩宇
    實用醫(yī)學雜志 2021年11期
    關(guān)鍵詞:草苷高糖內(nèi)皮細胞

    馬金蘭 王青 牛浩宇

    1青海大學附屬醫(yī)院眼科(西寧810001);2青海大學醫(yī)學院眼科(西寧810001)

    糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病常見的并發(fā)癥之一,也是導致成年人失明的主要原因[1]。目前,DR 的發(fā)病機制尚未明確,且缺乏有效的治療藥物,一般認為持續(xù)的高血糖誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞損傷是其發(fā)生的基礎(chǔ)[2]。延齡草苷是延齡草的主要活性成分之一,具有抗炎、抗癌等功效[3-4]。研究[5]顯示,延齡草苷可通過調(diào)控Sirtl/NFκB 信號通路提高過氧化氫誘導的PC12 細胞抗氧化能力,并降低細胞炎性因子表達,保護PC12 細胞損傷。但目前,延齡草苷是否影響高糖誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞損傷尚未明確。

    微小RNA(miRNA)是一類小分子非編碼RNA,在細胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及凋亡中發(fā)揮重要作用[6-8]。研究[9]顯示,過表達miR-1247-3p 可減少氧-糖剝奪/復氧處理的神經(jīng)細胞凋亡,減輕缺血再灌注腦損傷。但目前,miR-1247-3p 對高糖誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞損傷的影響也還未知。本研究以人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞(HRVEC)為研究對象,主要觀察了延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 細胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響及其能否調(diào)控miR-1247-3p 表達發(fā)揮作用,以期為DR 的治療提供新途徑。

    1 材料與方法

    1.1 細胞和試劑人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞(HRVEC),上海雅吉生物科技有限公司;延齡草苷,純度≥98%,上海鈺博生物科技有限公司;胎牛血清(FBS),杭州四季青;DMEM 培養(yǎng)基,北京索萊寶;Trizol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 試劑盒,大連寶生物;和LipofectamineTM2000 試劑盒,美國Invitrogen 公司;PCR 引物、miR-1247-3p 模擬物(mimcs)、模擬對照序列(miR-NC)、miR-1247-3p 抑制劑(anti-miR-1247-3p)、抑制劑陰性序列(antimiR-NC),上海生工,丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和活性氧(ROS)試劑盒,南京建成;二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒和Annexin VFITC/PI 凋亡試劑盒;上海碧云天;兔抗人B 淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、B 淋巴細胞瘤-2 相關(guān)蛋白(Bax)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體,美國Santa Cruz 公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用含10 % FBS 的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HRVEC。將HRVEC 接種于6 孔板中(1 × 105個/孔),用LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體法,分別轉(zhuǎn)染miR-1247-3p mimcs、miR-NC 組、anti-miR-1247-3p、anti-miR-NC。轉(zhuǎn)染6 h 后,更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h,收集細胞用于后續(xù)實驗。

    1.2.2 分組處理未轉(zhuǎn)染的HRVEC 細胞及轉(zhuǎn)染后的細胞接種于24 孔板中(2.5×104個/孔)。未轉(zhuǎn)染的HRVEC 細胞分為對照組(細胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng))、高糖組(細胞用含30 mmol/L[10]葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng))、高糖+延齡草苷低劑量組(5 μmol/L[5]延齡草苷與30 mmol/L 葡萄糖共同培養(yǎng))、高糖+延齡草苷中劑量組(10 μmol/L 延齡草苷與30 mmol/L 葡萄糖共同培養(yǎng))和高糖+延齡草苷高劑量組(20 μmol/L延齡草苷與30 mmol/L葡萄糖共同培養(yǎng))。轉(zhuǎn)染miR-1247-3p mimcs、miR-NC 的細胞用含30 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng),記為高糖+miR-1247-3p、高糖+miR-NC。轉(zhuǎn)染anti-miR-1247-3p、anti-miR-NC 的細胞用含20 μmol/L 延齡草苷與30 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)。每組設(shè)3 個復孔。培養(yǎng)24 h 后,檢測以下指標。實驗重復3 次。

    1.2.3 DCFH-DA 法檢測ROS細胞培養(yǎng)后,棄培養(yǎng)基,加入2 mL終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA工作液,孵育40 min,收集細胞,流式細胞儀檢測熒光強度,其中激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長520 nm。

    1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測MDA 和SOD細胞培養(yǎng)后,收集細胞,加裂解液裂解,3 500 r/min 離心10 min,上清液-20 ℃保存?zhèn)溆谩7謩e利用MDA 和SOD試劑盒,檢測上清液中MDA含量和SOD活力。

    1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡細胞培養(yǎng)后,收集細胞,PBS 清洗2 次,利用Annexin V-FITC/PI試劑盒,上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

    1.2.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-1247-3p 表達Trizol 試劑提取細胞中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,行PCR 擴增。擴增程序:95 ℃10 min,95 ℃10 s,58 ℃30 s,72 ℃30 s,共35 個循環(huán)。引物序列:miR-1247-3p 上游5'-CAGTGC ATAGCCACGTAACG-3',下游5'-GCCGTAACCACTAATCCG-3';內(nèi)參U6 上游5'-CTGAACAGGTCCCTAAGCTAC-3',下游5'-CGTAATCCGTGACTGCTCG-3'。2-△△Ct法計算miR-1247-3p 相對U6 的表達量。

    1.2.7 Western blot 法檢測Bax 和Bcl-2 蛋白表達RIPA 試劑提取細胞中總蛋白,經(jīng)BCA 法定量、SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后,分別于Bax 和Bcl-2 一抗孵育液中,4 ℃孵育過夜。再于山羊抗兔孵育液中,37 ℃孵育1 h。加化學發(fā)光試劑避光顯影,曝光拍照。

    1.3 統(tǒng)計學方法GraphPad Prism 7.0 軟件分析實驗數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗;多組間比較用單因素方差分析,進一步兩兩比較用t檢驗。以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 氧化應(yīng)激的影響與對照組比較,高糖組ROS 和MDA 水平升高(P<0.05),SOD 活性降低(P<0.05)。與高糖組比較,高糖+延齡草苷不同劑量組ROS 和MDA水平降低(P<0.05),SOD 活性升高(P<0.05),且不同劑量組間各檢測指標兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

    表1 延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 氧化應(yīng)激的影響Tab.1 The effect of trillin on oxidative stress of HRVEC induced by high glucose±s

    表1 延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 氧化應(yīng)激的影響Tab.1 The effect of trillin on oxidative stress of HRVEC induced by high glucose±s

    注:與對照組比較,*P <0.05;與高糖組比較,#P <0.05;與高糖+延齡草苷低劑量組比較,&P <0.05;與高糖+延齡草苷中劑量組比較,$P <0.05

    ROS 水平(%)SOD 活性(U/mg)MDA 含量(nmol/mg)100.00±7.52169.39±10.845.49±0.54 292.36±15.47*47.57±4.56*24.79±2.07*劑量組228.50±14.22#84.08±6.79#19.92±1.15#劑量組179.33±11.78#&113.65±8.87#&14.68±1.13#&分組對照組高糖組高糖+延齡草苷低高糖+延齡草苷中高糖+延齡草苷高劑量組F 值P 值128.39±11.30#&$351.355<0.001 143.32±9.19#&$298.045<0.001 8.33±0.79#&$366.982<0.001

    2.2 延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 凋亡的影響與對照組比較,高糖組細胞凋亡率和Bax 蛋白水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)。與高糖組比較,高糖+延齡草苷不同劑量組細胞凋亡率和Bax 蛋白水平降低(P<0.05),Bcl-2 蛋白水平升高(P<0.05),且不同劑量組間各檢測指標兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、表2。

    表2 延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 凋亡的影響Tab.2 The effect of trillin on the apoptosis of HRVEC induced by high glucose±s

    表2 延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 凋亡的影響Tab.2 The effect of trillin on the apoptosis of HRVEC induced by high glucose±s

    注:與對照組比較,*P <0.05;與高糖組比較,#P <0.05;與高糖+延齡草苷低劑量組比較,&P <0.05;與高糖+延齡草苷中劑量組比較,$P <0.05

    分組對照組高糖組高糖+延齡草苷低劑量組高糖+延齡草苷中劑量組高糖+延齡草苷高劑量組F 值P 值凋亡率(%)8.04±0.77 34.23±3.01*25.98±2.22#17.49±1.72#&11.59±1.15#&$272.506<0.001 Bcl-2 蛋白0.67±0.05 0.22±0.02*0.34±0.03#0.46±0.03#&0.58±0.05#&$203.625<0.001 Bax 蛋白0.29±0.02 0.81±0.06*0.68±0.04#0.55±0.03#&0.38±0.03#&$274.682<0.001

    圖1 延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響Fig.1 The effect of trillin on the apoptosis of HRVEC induced by high glucose and the protein expression of Bcl-2 and Bax

    2.3 延齡草苷對高糖誘導的HRVEC中miR-1247-3p 表達的影響與對照組比較,高糖組miR-1247-3p 水平降低[(0.41 ± 0.04)vs.(1.00 ± 0.07),t=21.954,P<0.05]。與高糖組比較,高糖+延齡草苷不同劑量組miR-1247-3p 水平升高[(0.57±0.04)、(0.69±0.05)、(0.87±0.05)vs.(0.41±0.04),t=8.485、13.119、21.552,均P<0.05],且不同劑量組間各檢測指標兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

    2.4 miR-1247-3p 過表達對高糖誘導的HRVEC氧化應(yīng)激的影響與高糖+miR-NC 組比較,高糖+miR-1247-3p 組ROS 和MDA 水平降低[(146.74 ±13.65)vs.(297.29±19.17)、(12.15±0.89)vs.(26.78±2.71),t= 19.192、15.387,均P<0.05],miR-1247-3p 水平和SOD 活性升高[(2.50 ± 0.21)vs.(1.00 ±0.04)、(124.56±9.55)vs.(45.91±4.17),t=21.050、22.642,均P<0.05]。

    2.5 miR-1247-3p 過表達對高糖誘導的HRVEC凋亡的影響與高糖+miR-NC 組比較,高糖+miR-1247-3p 組細胞凋亡率和Bax 蛋白水平降低[(14.80± 1.15)vs.(36.83 ± 3.02)、(0.45 ± 0.03)vs.(0.84 ±0.06),t= 20.452、17.441,均P<0.05],Bcl-2 蛋白水平升高[(0.54±0.03)vs.(0.21±0.02),t=27.458,P<0.05]。見圖2。

    圖2 miR-1247-3p 過表達對高糖誘導的HRVEC 凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響Fig.2 The effect of overexpressing miR-1247-3p on the apoptosis of HRVEC induced by high glucose and the protein expression of Bcl-2 and Bax

    2.6 抑制miR-1247-3p 表達逆轉(zhuǎn)延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 損傷的影響與高糖+延齡草苷+anti-miR-NC 組比較,與高糖+延齡草苷+anti-miR-1247-3p 組miR-1247-3p 水平降低[(0.38±0.04)vs.(1.00±0.05),t=29.048,P<0.05],ROS 和MDA 水平升高[(246.79±11.84)vs.(124.27±10.22)、(17.79± 1.70)vs.(8.13 ± 0.84),t= 23.500、15.283,均P<0.05],SOD 活性降低[(58.94 ± 5.73)vs.(144.37 ±14.29),t=16.647,P<0.05],凋亡率和Bax 蛋白水平升高[(27.34 ± 2.37)vs.(10.67 ± 1.13)、(0.71 ±0.05)vs.(0.36±0.03),t=19.047、18.007,P<0.05],Bcl-2蛋白水平降低[(0.28±0.02)vs.(0.59±0.05),t=17.270,P<0.05]。見圖3。

    圖3 抑制miR-1247-3p 逆轉(zhuǎn)延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響Fig.3 Inhibiting miR-1247-3p reversed the effect of trillin on the apoptosis of HRVEC induced by high glucose and the protein expression of Bcl-2 and Bax

    3 討論

    糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期特征為視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞損傷,而持續(xù)的高血糖是誘導其發(fā)生的主要原因[11-12]。因此,采取有效的措施抑制或降低高血糖誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞損傷對于糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療具有積極意義。作為延齡草的主要活性成分,延齡草苷發(fā)揮多種藥理功效。研究[13]顯示,延齡草苷可通過激活AMPK/Sirt1通路抑制肺組織中炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng),進而降低腦缺血再灌注繼發(fā)肺損傷;延齡草苷可抑制脊髓組織中的氧化應(yīng)激反應(yīng),減輕大鼠脊髓損傷[14]。但目前,延齡草苷對高糖誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞損傷的影響和分子機制還未知。

    糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制十分復雜,其中氧化應(yīng)激導致的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞損傷是其機制之一[15]。正常生理條件下,機體內(nèi)的氧自由基處于動態(tài)平衡,而在病理狀態(tài)下,自由基的生成和清除平衡被打破,細胞內(nèi)的SOD 等抗氧化酶的活性降低,造成ROS 含量升高,引起細胞內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),加劇細胞損傷[16]。MDA 是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一,可間接反映脂質(zhì)過氧化水平[18]。本研究顯示,高糖誘導HRVEC 細胞后,細胞中ROS和MDA 水平升高,而SOD 活力降低,與相關(guān)報道結(jié)果一致[19],表明高糖誘導HRVEC 細胞產(chǎn)生了氧化應(yīng)激反應(yīng);而延齡草苷可降低高糖誘導的HRVEC 細胞中ROS 和MDA 水平,并提高SOD 活力,說明其可抑制高糖誘導的HRVEC 細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。

    氧化應(yīng)激可進一步誘導細胞凋亡。Bax和Bcl-2是細胞凋亡的重要調(diào)控分子,Bax 表達升高促進細胞凋亡,而Bcl-2 表達升高則抑制細胞凋亡[20-21]。本研究顯示,高糖可能通過調(diào)控Bax/Bcl-2 促進HRVEC 細胞,與相關(guān)報道結(jié)果一致[22];不同劑量的延齡草苷干預后,高糖誘導的HRVEC 細胞凋亡及Bax 蛋白表達降低,而Bcl-2 蛋白表達升高,表明延齡草苷可有效降低高糖誘導的HRVEC 細胞凋亡。

    miRNA 廣泛存在于真核生物中,參與調(diào)控細胞的增殖、凋亡、氧化應(yīng)激等生理或病理過程,與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[23-24]。研究顯示,過表達miR-1247-3p 可減輕缺氧/復氧(H/R)誘導的心肌細胞H9c2 損傷,為急性心肌梗塞的治療提供了分子靶點[25]。本研究結(jié)果顯示,高糖可抑制HRVEC 細胞中miR-1247-3p 的表達,而過表達miR-1247-3p 可降低高糖誘導的HRVEC 細胞氧化應(yīng)激和凋亡,提示miR-1247-3p 可作為治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的分子靶點。本研究還顯示,延齡草苷可劑量依賴性促進高糖誘導的HRVEC 細胞中miR-1247-3p 表達,而抑制miR-1247-3p 表達則逆轉(zhuǎn)了延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 細胞氧化應(yīng)激和凋亡的抑制作用,提示延齡草苷通過上調(diào)miR-1247-3p 表達來減輕高糖誘導的HRVEC 細胞損傷。

    綜上所述,延齡草苷可有效抑制高糖誘導的HRVEC 細胞氧化應(yīng)激和凋亡,減輕細胞損傷,其可能通過上調(diào)細胞中miR-1247-3p 表達來發(fā)揮作用,具有研發(fā)為治療糖尿病視網(wǎng)膜病變藥物的潛在價值。本研究接下來將進一步探究miR-1247-3p 靶基因及下游信號通路對高糖誘導的HRVEC細胞損傷的影響,并通過動物實驗進一步驗證延齡草苷對糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展的影響和作用機制。

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