白蛋白索拉非尼納米粒的制備與體外抗肝腫瘤活性評(píng)價(jià)

高文慧 吳錦俊 簡(jiǎn)曉順 賈小婷 李靖

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1藥學(xué)部，4泌尿外科（廣州510095）；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)際中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所（廣州510006）；3廣州醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所（廣州510095）

肝癌在我國(guó)是第4 位常見(jiàn)惡性腫瘤及第2 位腫瘤致死病因［1］，早期手術(shù)可延長(zhǎng)生存期。但肝癌的早期檢出率低，多數(shù)患者確診時(shí)已為晚期，需要進(jìn)行全身治療。目前，靶向藥物治療已成為肝癌治療的主要手段之一，但該類藥物種類少，療效不佳，如何提高這些藥物的抗腫瘤效果已成為研究肝癌治療的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

索拉非尼（sorafenib，SRF）是多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI），是中晚期肝癌患者一線治療藥物，但其無(wú)進(jìn)展生存期僅為167 d，預(yù)后不理想。同時(shí)，由于索拉非尼不良反應(yīng)較多，嚴(yán)重時(shí)需停藥或減量，影響其臨床療效［2-3］。納米技術(shù)為解決上述問(wèn)題提供了有效策略：納米藥物顆粒小、比表面積大、有腫瘤靶向性［4］，能增強(qiáng)療效、降低毒性和優(yōu)化體內(nèi)藥物行為［5-6］。MO 等［7］制備的索拉非尼長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體具有顯著的抗乳腺癌細(xì)胞活性。ZHANG 等［8］制備脂質(zhì)包被的索拉非尼納米晶，可將腫瘤組織中藥物濃度提高近15 倍。MARIA 等［9］制備的索拉非尼固體脂質(zhì)納米粒同樣提高了索拉非尼的抗肝腫瘤活性。因此，索拉非尼納米制劑的研發(fā)已成為肝癌治療的新方向。

目前報(bào)道的索拉非尼納米制劑仍有生物相容性低、粒徑偏大、抗腫瘤活性不高等問(wèn)題。白蛋白是一種天然的親水性生物材料，也是最早用于制備抗腫瘤納米制劑的載體。它對(duì)腫瘤具有獨(dú)特的親和力：內(nèi)皮細(xì)胞上的gp60 受體和腫瘤細(xì)胞外的分泌型富含半胱氨酸的酸性蛋白（SPARC）均能結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)白蛋白到達(dá)腫瘤部位，增加瘤內(nèi)藥物的蓄積量［10］。因此，采用白蛋白負(fù)載索拉非尼（human serum albumin-sorafenib nanoparticles，HSASRF-NPs）有望制備水溶性的納米制劑，并提高索拉非尼的肝腫瘤靶向性和抗腫瘤活性，為該藥的白蛋白納米劑型在肝癌治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器Malvern-3000HS 激光散射粒度分析和電位測(cè)定儀（英國(guó)Malvern 公司）；H-7650 型透射電鏡（日立高新技術(shù)上海國(guó)際貿(mào)易有限公司）；5810R低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；LC-20AT 高效液相色譜儀（島津公司）；DMI3000B/DF450C 熒光倒置顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；IncuCyte ZOOM 變焦活細(xì)胞成像系統(tǒng)（美國(guó)ESSEN Bioscience 公司）。

1.2 藥品與試劑索拉非尼（中國(guó)阿拉丁公司，批號(hào)：1528035，含量≥99.9%）；人血清白蛋白（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：A0307A，含量≥96%）；1-乙基-3-［3-二甲基氨基丙基］碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C10081863，含量：98.5%）；PARP（美國(guó)CST 公司，貨號(hào)-抗體類型：9542P-RabbitmAb）；β-tubulin（美國(guó)BD 公司，貨號(hào)-抗體類型：556321-MousemAb）；PVDF 膜（美國(guó)Millipore 公司）；超純水等。

1.3 細(xì)胞BEL-7402 細(xì)胞（廣州醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所贈(zèng)）。

1.4 方法

1.4.1 制備HSA-SRF-NPs 和FITC-HSA-SRFNPs精密稱取10.0 mg 索拉非尼，用二甲亞砜（DMSO）溶解并逐滴加入0.5%人血白蛋白溶液中，攪拌后加入EDC 交聯(lián)，磷酸鹽緩沖液（PBS）透析后4～8 ℃下保存。制備FITC-HSA：將FITC 溶液滴入含人血白蛋白的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中，避光反應(yīng)過(guò)夜，PBS 透析至外液澄清無(wú)顏色。制備FITC-HSA-SRF-NPs：調(diào)整FITC-HSA 溶液的濃度為0.5%，同前方法逐滴加入索拉非尼，并用EDC交聯(lián)，制備FITC 標(biāo)記的HSA-SRF-NPs。

1.4.2 HSA-SRF-NPs 的表征用激光粒度分布和電位測(cè)定儀測(cè)定粒徑分布和Zeta 電位，透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察形態(tài)特征（3%磷鎢酸染色，pH 7.0），高效液相色譜法測(cè)定載藥量和包封率。

1.4.3 細(xì)胞復(fù)蘇與傳代37 ℃水浴融化凍存管，離心棄上清，完全培養(yǎng)基分散后繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)瓶底細(xì)胞面積達(dá)80%～90%時(shí)棄去培養(yǎng)基，PBS蕩洗，胰酶消化，無(wú)菌吸管吹打分散細(xì)胞，離心棄上清，用完全培養(yǎng)基分散，取一半重新培養(yǎng)。

1.4.4 FITC-HSA-SRF-NPS 在BEL-7402 細(xì)胞內(nèi)的蓄積6 孔板中放置蓋玻片，將BEL-7402 細(xì)胞接種于蓋玻片上，培養(yǎng)24 h 后分別加入FITC 和FITC-HSA-SRF-NPS，培養(yǎng)12 h 后PBS 清洗，室溫下固定，DAPI 染色。將蓋玻片放在載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察（20×）。

1.4.5 IncuCyte ZOOM實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)細(xì)胞成像將BEL-7402 細(xì)胞接種于96 孔板培養(yǎng)24 h，棄去上清，分別加入1.5、3、6 μmol/L 索拉非尼和HSA-SRF-NPS，每組3 個(gè)復(fù)孔，置于IncuCyte ZOOM 系統(tǒng)內(nèi)，根據(jù)設(shè)定好的程序（每孔采集3 張不同視野的圖像，采集間隔4 h，10×鏡頭）收集6 d 的數(shù)據(jù)，用系統(tǒng)自動(dòng)分析圖像中細(xì)胞的區(qū)域，計(jì)算細(xì)胞融合率。

1.4.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)將BEL-7402 細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)24 h，不加藥或分別加入12.0 μmol/L 索拉非尼和HSA-SRF-NPs，每組3 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。消化細(xì)胞，1×PBS洗滌，室溫離心收集細(xì)胞，重復(fù)洗滌3 次；加入預(yù)冷的1×binding buffer 重懸細(xì)胞，分別加入5 μL 的Annexin V-FITC 和PI 染色，室溫避光孵育，混勻上機(jī)，采用flowjo7.6 軟件進(jìn)行凋亡分析，計(jì)算細(xì)胞凋亡百分比。

1.4.7 Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Cl-PARP的表達(dá)BEL-7402 細(xì)胞培養(yǎng)24 h，不加藥或分別加入13.5 μmol/L 的索拉非尼和HSA-SRF-NPs，每組3 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后棄去培養(yǎng)基，裂解、收集細(xì)胞，低溫離心并取上清液，-80 ℃保存。取40 μg 樣品上樣，60 V 恒壓電泳后，恒流200 mA 轉(zhuǎn)膜90 min，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h。一抗PARP（1∶1 000）和β-tubulin（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜，二抗（1∶5 000）繼續(xù)室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光并于暗室中顯影、定影，檢測(cè)目標(biāo)條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSA-SRF-NPs的表征HSA-SRF-NPs的水合粒徑為（75.8±2.6）nm（圖1A），多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）為0.129；Zeta 電位為-（19.00 ±1.02）mV（圖1B），絕對(duì)值較高，穩(wěn)定性較好（圖1）。由圖1 C 的TEM 圖可知，HSA-SRF-NPs 呈球形，大小在100 nm 左右。最終測(cè)得HSA-SRF-NPs 的載藥量和包封率分別為（4.23 ± 0.03）%和（92.52 ±2.40）%。

圖1 HSA-SRF-NPs 的表征Fig.1 Characterization of HSA-SRF-NPs

2.2 FITC-HSA-SRF-NPS 在BEL-7402 細(xì)胞內(nèi)的蓄積見(jiàn)圖2，活細(xì)胞不會(huì)主動(dòng)吞噬FITC，因此對(duì)照組和FITC 組BEL-7402 細(xì)胞中均無(wú)綠色熒光；FITC-HSA-SRF-NPS 組BEL-7402 細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光，可能是其通過(guò)內(nèi)吞作用將納米粒轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞，從而提高胞內(nèi)索拉非尼的含量。

圖2 熒光顯微鏡觀察FITC 和FITC-HSA-SRF-NPS 在BEL-7402 細(xì)胞內(nèi)的蓄積情況（20×）Fig.2 Observation of accumulation of FITC and FITC-HSA-SRF-NPS in BEL-7402 cells by fluorescence microscope（20×）

2.3 動(dòng)態(tài)細(xì)胞增殖試驗(yàn)未用藥物處理的BEL-7402 細(xì)胞從2 d 開始逐漸進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，6 d 后細(xì)胞融合率接近100 %；索拉非尼處理后，各濃度組均顯示出對(duì)BEL-7402 細(xì)胞的增殖抑制作用（圖3A），同樣的變化在HSA-SRF-NPs 組也能觀察到（圖3B）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后比較索拉非尼和HSA-SRFNPs 處理BEL-7402 細(xì)胞的融合率，發(fā)現(xiàn)HSA-SRFNPs 在各濃度組對(duì)BEL-7402 細(xì)胞的增殖抑制作用均顯著強(qiáng)于索拉非尼（圖3C）。隨著藥物處理時(shí)間延長(zhǎng)，HSA-SRF-NPs 對(duì)BEL-7402 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞比索拉非尼更加明顯（圖4）。

圖4 各樣品處理后BEL-7402 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化Fig.4 Morphological changes in BEL7402 cells after treatment with each sample

圖3 IncuCyte ZOOM 動(dòng)態(tài)細(xì)胞增殖試驗(yàn)Fig.3 The dynamic cell proliferation test by IncuCyte ZOOM

2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)凋亡結(jié)果見(jiàn)圖5。對(duì)照組僅有5 %的BEL-7402 細(xì)胞發(fā)生凋亡，而索拉非尼組和HSA-SRF-NPs 組分別為14.5 %和23.2 %（包括早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞），三組之間凋亡細(xì)胞百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

圖5 索拉非尼和HSA-SRF-NPs 對(duì)BEL-7402 細(xì)胞的促凋亡作用及三組細(xì)胞凋亡Fig.5 Comparison of the effects of sorafenib and HSA-SRFNPs on apoptosis of BEL-7402 cells and a column chart of apoptosis percentage in three groups

2.5 Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Cl-PARP的表達(dá)PARP的分子量為116 KDa，剪切后的Cl-PARP分子量為89 KDa，凋亡過(guò)程發(fā)生時(shí)，PARP被剪切成Cl-PARP，推進(jìn)凋亡過(guò)程。三組PARP條帶下均有Cl-PARP條帶。Image J軟件測(cè)量圖中Cl-PARP的灰度值，并與β-tubulin 蛋白相比，計(jì)算相對(duì)蛋白表達(dá)量。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，Cl-PARP 在各組間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表達(dá)量由高到低依次為：HSA-SRF-NPs組＞索拉非尼組＞對(duì)照組。見(jiàn)圖6。

圖6 Western blotting條帶圖及Cl-PARP相對(duì)表達(dá)量柱狀圖Fig.6 Strip image of Western blotting and histogram of relative expression of Cl-PARP

3 討論

本研究采用化學(xué)交聯(lián)法成功制備出人血白蛋白-索拉非尼納米粒，測(cè)得HSA-SRF-NPs 的粒徑為（75.8±2.6）nm，Zeta 電位為-（19.00±1.02）mV，載藥量和包封率分別為（4.23 ± 0.03）%和（92.52 ±2.40）%。研究表明，粒徑大小影響納米藥物的分布。當(dāng)粒徑在30～200 nm 時(shí)，高通透性和滯留（enhance the permeability and retention，EPR）效應(yīng)增強(qiáng)［11］，藥物在腫瘤部位的蓄積量增加。SUN等［12］的研究表明，粒徑為100 nm 的牛血清白蛋白-阿霉素納米粒比250 nm 的該納米粒更容易在乳腺癌細(xì)胞中蓄積，有研究也證實(shí)，腫瘤細(xì)胞更有可能攝取較小的納米顆粒。因此，將粒徑控制在30～100 nm 有利于提高納米粒的腫瘤靶向性?，F(xiàn)有研究中索拉非尼納米粒的粒徑多在200 nm 左右［8，13］，包封率并不理想［14］。本研究通過(guò)改良工藝，制備出粒徑在100 nm 以內(nèi)、包封率高、穩(wěn)定性好的索拉非尼納米粒，能保證其良好的抗腫瘤活性。

細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)，HSA-SRF-NPs在BEL-7402細(xì)胞內(nèi)的蓄積性、對(duì)BEL-7402 細(xì)胞的增殖抑制作用以及促凋亡能力均顯著優(yōu)于索拉非尼。WAN等［14］制備的拉帕替尼人血清白蛋白納米粒克服了藥物水溶性差和口服吸收受限等問(wèn)題，但制備的納米粒并未提高藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性和促凋亡能力。RETNAKUMARI 等［15］制備的轉(zhuǎn)鐵蛋白-人血白蛋白-索拉非尼納米粒顯示出抗慢性髓系白血病的功效，但并未評(píng)價(jià)其對(duì)肝腫瘤細(xì)胞的作用。本研究制備的HSA-SRF-NPs 對(duì)肝腫瘤細(xì)胞的毒性顯著增強(qiáng)，證明白蛋白為載體具有明顯優(yōu)勢(shì)，為其在肝癌治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)，具有潛在的臨床研究?jī)r(jià)值。然而，HSA-SRF-NPs 的抗腫瘤活性仍可進(jìn)一步提高：HSA-SRF-NPs 粒徑小，白蛋白表面又具有很多活性基團(tuán)，因此可以繼續(xù)在其表面嫁接腫瘤靶向的配體，如葉酸、抗體和適體等［16］或共包載其他抗腫瘤藥物，以提高納米粒的抗肝腫瘤活性。未來(lái)還需要繼續(xù)改進(jìn)該納米制劑，同時(shí)在整體動(dòng)物水平評(píng)價(jià)其抗腫瘤活性，為其向臨床轉(zhuǎn)化打下理論基礎(chǔ)。