過氧化氫對兔離體左室復極相關(guān)電生理指標及心律失常的影響*

李云云 劉萌 張雪梅 薛小臨 楊琳 嚴干新

氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時,體內(nèi)活性氧生成與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡被打亂,活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)和活性氮自由基產(chǎn)生過多和/或清除能力降低,氧化程度超出了氧化物的清除能力,從而導致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡,致機體發(fā)生一系列氧化損傷[1]。其中,ROS包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH)、過氧化氫(H2O2)等。H2O2活性較低,是一種非自由基類物質(zhì),有相對較長的半衰期,性質(zhì)比較穩(wěn)定,組織中作用范圍廣泛,可以允許其擴散至細胞膜,因此H2O2被廣泛用于氧化應激的相關(guān)實驗研究中。氧化應激時過量產(chǎn)生的ROS可通過活化絲/蘇氨酸激酶-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ?qū)蝹€心室肌細胞多種離子通道、泵、轉(zhuǎn)運體、鈣周期調(diào)控蛋白及縫隙連接蛋白等進行磷酸化修飾從而引起心肌細胞電活動紊亂,被認為是誘發(fā)病變心臟發(fā)生室性心律失常的可能的潛在的共同機制[2－5]。目前,氧化應激對心肌組織電活動影響的相關(guān)報道較少,因此筆者以冠狀動脈灌注兔左室楔形組織塊標本為研究對象[6],從組織水平上觀察H2O2對兔離體左室復極相關(guān)電生理指標及心律失常的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 臺氏液(mmol/L)：NaCl 129、KCl 4、CaCl21.8、Na H2PO4·2 H2O 0.9、MgSO4·7H2O 0.5、Na HCO320、C6H12O6·H2O 5.5。高鉀臺氏液(mmol/L)：KCl 24,余成份同臺式液。上述液體均現(xiàn)用現(xiàn)配；過氧化氫(H2O2)購于美國Sigma公司。

1.2 冠狀動脈(簡稱冠脈)灌注兔左室楔形標本制備 成年家兔,體重2.2～2.8 kg,由西安交通大學醫(yī)學院動物中心提供。經(jīng)兔耳緣靜脈注射肝素抗凝后給予30%的烏拉坦(5 ml/kg)進行麻醉,開胸取出心臟,放入4℃高鉀臺氏液中。經(jīng)左側(cè)冠脈開口,插入冠脈插管至回旋支,固定插管后,灌注低溫高鉀臺氏液,以去除冠脈內(nèi)殘留血液并使心臟停跳。修剪標本,制備左室楔形組織塊,其標本寬約1.5～2.0 cm,長約2～3 cm標本。將標本放入恒溫浴槽內(nèi),改用臺氏液灌流,臺式液溫度維持在35.7±0.1℃,灌注壓維持在35～45 mm Hg,持續(xù)向臺式液中輸入95%O2和5%CO2的混合氣。起搏電極放置于心尖部內(nèi)膜側(cè),給予約1 h頻率為1 000 ms基礎(chǔ)刺激,待穩(wěn)定后用于后續(xù)實驗。

1.3 實驗分組及刺激流程 本實驗為同一標本前后對照,首先給予標本灌注臺式液及周長為1 000 ms基礎(chǔ)刺激(basic cycle length,BCL)穩(wěn)定1 h,之后繼續(xù)灌注臺式液,且給予相應程序電刺激(對照組,n＝12),刺激周長依次為2 000、1 000、500 ms,時間依次為7、1、0.5 min。待心電生理指標穩(wěn)定(QT間期5 min內(nèi)變化小于4 ms)后,再持續(xù)灌注1.0 mmol/L H2O2的臺式液,且給予相應程序電刺激(實驗組,n＝12),刺激周長和時間同對照組。

1.4 電生理指標記錄與測量 跨壁心電圖(ECG)的記錄：將銀-氯化銀電極放置入臺氏液中,電極的正極位于標本的外膜側(cè),負極位于標本內(nèi)膜側(cè)(與正常的跨膜心電向量方向相一致),距離心室組織塊內(nèi)(Endo)、外(Epi)膜側(cè)約1.0～1.5 cm處。心室肌細胞動作電位(action potential,AP)的記錄：用浮置玻璃微電極記錄內(nèi)外膜側(cè)心肌細胞的AP。測量指標包括復極及跨壁復極離散度相關(guān)指標,QT間期為心電圖上從QRS波開始至T波下降支與等電位線交匯處的時間間期；Tp-e(Tpeak-Tend)間期為T波頂點(Tpeak)到T波終點(Tend)(下降支與等電位線交匯處)的時間間期；Tp-e/QT為校正的Tp-e；實驗組與對照組QT間期、Tp-e間期、Tp-e/QT比值的差值記錄為ΔQT、ΔTp-e、ΔTp-e/QT；實驗組與對照組相比QT間期、Tp-e間期、Tp-e/QT比值的變化百分比記錄為ΔQT%、ΔTp-e%、ΔTp-e/QT%；同時還記錄2 000 ms刺激下心內(nèi)膜(Endo)及心外膜(Epi)早后除極(early after depolarization,EAD),晚后除極(delayed after depolarization,DAD)及體表心電圖R-on-T室性早搏(簡稱室早)(頻發(fā)為大于6次/分,偶發(fā)為小于6次/分)、室性心動過速(簡稱室速)及心室顫動(簡稱室顫)等心律失常。

1.5 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。在不同BCL條件下,各電生理指標采取重復測量資料方差分析,組內(nèi)比較采用自身前后配對t檢驗,率的比較采用配對卡方檢驗的Fisher′s確切概率法。以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 不同BCL刺激時兩組電生理指標比較 兩組QT間期、Tp-e間期均隨BCL的增加而延長。然而,實驗組的慢頻率依賴性更加顯著(圖1、表1)。2 000 ms BCL刺激下與對照組相比,實驗組QT間期、Tp-e間期明顯延長。

表1 兩組QT間期、Tp－e間期隨不同基礎(chǔ)刺激周長(BCL)的變化(n＝12)

圖1 不同BCL刺激下兩組QT間期、Tp-e間期的比較(n＝12)

2.2 2 000 ms BCL刺激下兩組電生理指標比較2 000 ms BCL刺激下,對照組Tp-e/QT隨時間無明顯變化,實驗組隨H2O2作用時間延長Tp-e/QT比值呈先增大后減小的變化趨勢,其值始終大于對照組,具體表現(xiàn)為：從H2O2充分作用開始,8 min時達效應峰值,Tp-e和QT間期同時延長且ΔTp-e%較ΔQT%增加顯著,致Tp-e/QT比值隨時間增大；繼續(xù)延長觀察時間,Tp-e和QT間期同時縮短且ΔTp-e%較ΔQT%下降顯著,致Tpe/QT比值減小,但在觀察時間內(nèi)始終大于對照組(圖2、表2)。

表2 實驗組在2 000 ms BCL刺激下復極相關(guān)電生理指標隨時間的變化(n＝8)

圖2 實驗組在2 000 ms BCL刺激下QT間期、Tp-e間期時間依賴性變化(n＝8)

2.3 兩組發(fā)生EAD、DAD以及室性心律失常的比較 實驗共12例標本,實驗組有8例標本在2 000 ms BCL刺激下發(fā)生室性心律失常(vs對照組,n＝12,P＜0.001),其中6例發(fā)生EAD(2例頻發(fā)、4例偶發(fā))以及R-on-T室早,無室速及室顫發(fā)生(圖3),其余2例頻發(fā)EAD及R-on-T室早,并發(fā)生R-on-T室早觸發(fā)的多形性室速及室顫(圖4),實驗過程中伴明顯T波下降支切跡。對照組在相同的刺激條件下未觀察到EAD、DAD及R-on-T室早、室速及室顫現(xiàn)象。

圖3 2 000 ms BCL刺激下EAD、DAD及單次觸發(fā)激動

3 討論

氧化應激對心血管疾病的影響及其機制日益受到人們的廣泛關(guān)注,其嚴重影響著高血壓、心肌缺血/再灌注損傷、心力衰竭等心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展[7－8]。筆者實驗通過灌注H2O2觀察氧化應激對離體兔左室心電圖QT間期、Tp-e間期、Tp-e/QT等復極相關(guān)電生理指標的影響,并通過浮置玻璃微電極同步記錄內(nèi)外膜側(cè)心肌細胞動作電位,探索H2O2與復極相關(guān)室性心律失常發(fā)生的可能的內(nèi)在關(guān)系。

筆者利用H2O2刺激模擬體內(nèi)氧化應激,發(fā)現(xiàn)H2O2可引起心電圖QT間期、Tp-e間期延長,Tpe/QT增大,且呈現(xiàn)顯著的慢頻率依賴性,即就是心率減慢時這種變化特點更加顯著。此外,實驗同步觀察到APD較長的內(nèi)膜側(cè)心肌細胞復極時間延長顯著,2相平臺期延長,復極易損窗增大,易誘發(fā)EAD及觸發(fā)激動并向APD較短的外膜側(cè)傳導,進而利于跨室壁折返的產(chǎn)生和維持,從而促進心律失常發(fā)生。本結(jié)果提示：氧化應激狀態(tài)合并慢心室率,內(nèi)膜側(cè)EAD觸發(fā)機制可能是心律失常發(fā)生的啟動因素,跨心室壁折返機制則可能是心律失常得以維持的關(guān)鍵。

有報道[9],氧化應激可引起心肌電-機械損傷,晚鈉電流增強,細胞內(nèi)鈣超載,ATP-敏感性鉀通道活化可能與該過程有關(guān)。本實驗灌注H2O2條件下觀察到,慢頻率刺激時跨壁復極異質(zhì)性的電生理指標有先增大后減小的時間依賴性影響,其表現(xiàn)可分為三個階段：隨H2O2作用時間延長QT間期延長、T波降支延緩伴切跡,同步記錄單個心室肌細胞AP延長伴EAD、DAD及后收縮發(fā)生。繼之QT間期縮短。實驗繼續(xù)延長觀察時間,心肌細胞興奮性喪失：細胞喪失興奮性可能是由于隨細胞外鉀離子濃度升高達一定程度,靜息電位減小到一定程度,進入失活的鈉通道逐漸增多,閾電位會上移,使靜息電位與閾電位的差值增大,興奮閾值升高,細胞興奮性降低達一定程度興奮性喪失。本實驗同步觀察了跨壁心電圖、心肌細胞動作電位形態(tài)時程的變化,若能同時增加對心肌收縮力及細胞Ca2＋瞬變的觀察,對探索氧化應激時心肌電-機械活動變化的內(nèi)在機制能提供更有利的實驗證據(jù)。

總之,心血管病理狀態(tài),氧化應激水平升高,心電圖QT間期、Tp-e間期、Tp-e/QT等無創(chuàng)性復極相關(guān)電生理指標呈慢頻率依賴性變化,跨心室壁復極離散度增大,復極相關(guān)室性心律失常發(fā)生風險增加。本實驗提示臨床工作中應加強對心電圖復極相關(guān)電生理指標的嚴密觀察分析,可及早預測慢頻率或間歇依賴的復極相關(guān)心律失常發(fā)生,以便有效措施及時干預,從而降低心血管惡性事件風險及不可逆性損傷。