生鮮面優(yōu)勢腐敗菌的分離鑒定及致腐能力分析

溫青玉，張康逸,*，王燕芳，李耀強(qiáng)，李 芳

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002；2.河南省全谷物小麥制品加工國際聯(lián)合實驗室，河南 鄭州 450002；3.河南省全谷物鮮食加工工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002；4.河南省安康食品科技研究院，河南 鄭州 450006；5.新鄉(xiāng)市星河生物科技有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453600；6.白象食品股份有限公司，河南 鄭州 451162）

面條作為我國人們的傳統(tǒng)主食之一，有著悠久的歷史，且制作便捷，含有豐富的維生素、碳水化合物、蛋白質(zhì)和微量元素[1-2]。面條主要分為生鮮面、掛面和方便面等，其中生鮮面由于即做即食，口感筋道爽滑，頗受人們的喜愛，在我國占據(jù)很大的消費(fèi)市場。隨著我國食品工業(yè)的發(fā)展以及人們對食物越來越高的要求，對生鮮面的保水性、保存性和不宜腐敗性等提出了更高的要求。但由于生鮮面本身含水量高，容易因微生物的滋生而腐敗變質(zhì)，從而造成原料的大量浪費(fèi)[3-5]。因此，如何防止微生物對生鮮面品質(zhì)的損壞是提高生鮮面品質(zhì)和降低儲藏成本的重要研究方向之一。

目前，國內(nèi)外對生鮮面中的腐敗菌有一定的研究報道。許玉慧等[6]在對即食濕面條腐敗微生物的分離中得出，導(dǎo)致濕面條腐敗變質(zhì)的微生物為細(xì)菌，其主要為枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。周其中[7]在生鮮濕面儲藏技術(shù)的研究中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致腐敗的主要微生物為細(xì)菌和霉菌，另外也鑒定出了7個霉菌屬。黃斌等[8]對生鮮面進(jìn)行了危害分析和關(guān)鍵環(huán)節(jié)控制點(diǎn)的研究。劉增貴等[9]的研究表明，生鮮面條在30℃儲藏條件下，微生物迅速增殖，面條顏色逐漸變黃，得出微生物是造成面條劣變的重要因素。但目前對即食濕面條中腐敗微生物的相關(guān)研究報道相對較少，李昌文等[10]對即食濕面條的保鮮進(jìn)行了研究，但未對腐敗微生物進(jìn)行分離鑒定，而李運(yùn)通等[11]指出細(xì)菌是導(dǎo)致高水分面制品腐敗的主要微生物，會產(chǎn)生復(fù)雜的生化反應(yīng)，從而導(dǎo)致面條品質(zhì)變質(zhì)。

本研究通過形態(tài)學(xué)觀察篩選生鮮面中的優(yōu)勢腐敗菌，再利用生理生化手段和16SrDNA序列分析法對生鮮面中的優(yōu)勢腐敗菌進(jìn)行鑒定。同時，以感官評分、酸度、pH值和菌落總數(shù)為評價指標(biāo)，綜合評價優(yōu)勢腐敗菌對不同儲藏時間生鮮面的致腐能力，為生鮮面的工業(yè)化生產(chǎn)和商品流通等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

小麥粉，金龍魚高筋麥芯小麥粉；食用鹽，河南省衛(wèi)群多品種鹽有限公司產(chǎn)品。

三氯甲烷、氯化鈉、革蘭氏染劑、氫氧化鈉、丙酮、30%過氧化氫溶液、V-P試劑盒、硝酸鹽、吲哚、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基，均為北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒，西安擎科創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

YP-N型電子分析天平，上海精密儀器儀表有限公司；ST16R冷凍離心機(jī)，鄭州金友寧儀器有限公司；YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、SW-CJ-1BU超凈工作臺，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；PHS-25型pH計，上海雷磁儀器廠；WD-9413B型凝膠成像分析系統(tǒng)，北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生鮮面制作工藝

面粉、食鹽、水(質(zhì)量比100∶1∶39)→和面（慢速檔攪拌5 min，中速檔攪拌2 min）→熟化（室溫靜置15 min）→壓延（在壓輥間距為2、1.8、1.6和1.4 mm處各對折壓片5次，形成厚度為1.4 mm的面片）→切條→脫水（120℃烘干1 min）→裝袋

1.2.2 生鮮面的腐敗處理

將無菌生鮮面在25℃條件下進(jìn)行儲藏，直至腐敗變質(zhì)。

1.2.3 微生物計數(shù)

菌落總數(shù)測定：參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗 菌落總數(shù)測定》[12]規(guī)定的方法檢測；霉菌及酵母菌測定：參照GB4789.15—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》[13]規(guī)定的方法檢測。

1.2.4 生鮮面腐敗菌的分離純化

在無菌操作環(huán)境下，稱取已腐敗生鮮面樣品1 g，放入已滅過菌的研缽中，把生鮮面研碎，加入9 mL無菌水后再次進(jìn)行充分研磨，隨后取1 mL生鮮面的懸濁液進(jìn)行10倍系列梯度稀釋，選擇4個合適的稀釋度各吸取1 mL涂營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，每個濃度下進(jìn)行3次平行試驗，同時做好空白對照。涂布完成后將平板放入37℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h±2 h。待培養(yǎng)基上的細(xì)菌長出，觀察培養(yǎng)基表面的菌落生長狀況，確定優(yōu)勢腐敗菌，做好標(biāo)記。將標(biāo)記的菌落采用平板劃線法進(jìn)行分離純化，純化后的菌種低溫保藏待用。

1.2.5 優(yōu)勢腐敗菌的鑒定

1.2.5.1 生理生化鑒定

參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]運(yùn)用菌落觀察等方法對試驗中分離得到的菌株進(jìn)行初步鑒定；通過硝酸鹽還原、接觸酶、氧化酶、葡萄糖、甘露醇、木糖發(fā)酵實驗、V-P實驗、明膠水解、淀粉水解、檸檬酸鹽利用、丙酸鹽利用、吲哚實驗、耐鹽性實驗和耐熱性等鑒定試驗對分離的菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.2.5.2 分子生物學(xué)鑒定

選取在適宜條件下培養(yǎng)了24 h左右的腐敗菌制成菌懸液，10 000 r/min離心10 min后棄去上清液，然后加入100μLddH2O制得模板DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：模板DNA 2μL，引物27F 1μL，引物1541R 1μL，TaqPCR Master Mix（2×）25μL，ddH2O補(bǔ)至50μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性60 s，58℃復(fù)性60 s，72℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，隨后將擴(kuò)增產(chǎn)物送至西安擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序鑒定，并登錄NCBI網(wǎng)站，與數(shù)據(jù)庫已知序列進(jìn)行比對，獲得相似性較高的菌株序列，使用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 生鮮面腐敗菌的致腐能力測定

1.2.6.1 處理方法

生鮮面經(jīng)包裝密封后紫外殺菌，得到無菌生鮮面。首先，將分離出的幾種供試優(yōu)勢菌分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，然后放入生化培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)48 h，在無菌操作下用接種環(huán)分別挑取一定量培養(yǎng)好的菌株加入225 mL的無菌水中，充分混均，得到供試菌株菌懸液。然后將無菌生鮮面置于供試菌株菌懸液中浸泡30 s后拿出，用無菌包裝密封袋包裝后即為接種處理過的生鮮面，同時以無菌水代替供試菌株菌懸液按上述方式處理生鮮面作為空白對照（CK）。最后，將所有處理過的生鮮面樣品放入恒溫箱中25℃密封保存。每隔6 h定時取樣，對采集的樣品進(jìn)行感官評價，測定酸度、pH值和菌落總數(shù)，以評價幾種不同的菌株對生鮮面的致腐能力。

1.2.6.2 生鮮面的感官評價

根據(jù)任順成等[15]和張婉[16]的面條感官評分標(biāo)準(zhǔn)，由感官評價小組（5位經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的人員組成）對生鮮面的色澤、質(zhì)地、氣味、是否酸敗等指標(biāo)進(jìn)行評價。感官評價采用10分制，當(dāng)評分低于5分（包括5分）時，生鮮面若出現(xiàn)酸味或霉變，即不能食用。評價標(biāo)準(zhǔn)詳見表1。

表1 生鮮面感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standardsof fresh noodles

1.2.6.3 生鮮面酸度的測定

參照GB 5009.239—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測定》[17]規(guī)定的方法進(jìn)行測定。

1.2.6.4 生鮮面pH值的測定

參照GB5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》[18]規(guī)定的方法進(jìn)行測定。

1.2.6.5 生鮮面菌落總數(shù)測定

參照“1.2.3微生物計數(shù)法”進(jìn)行測定。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用3次平行試驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Origin 8.0軟件繪制數(shù)據(jù)圖。使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 生鮮面微生物計數(shù)

將腐敗的面條分別接種在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后，各培養(yǎng)基的生長情況如表2所示。

表2 培養(yǎng)基中微生物的生長情況Table 2 Growth states of microorganisms in media

由表2可知，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長出較多的微生物，大大超過了NY/T 1512—2007《綠色食品 生面食、米粉制品》[19]中生面食菌落總數(shù)≤3×105CFU/g的要求。在主要用于培養(yǎng)霉菌和酵母菌的孟加拉紅培養(yǎng)基上幾乎沒有微生物。由此可知，導(dǎo)致生鮮面腐敗的優(yōu)勢腐敗微生物主要是細(xì)菌。

2.2 生鮮面優(yōu)勢腐敗菌的分離和篩選

2.2.1 腐敗菌菌落特征及比例

圖1為1、2和3號菌的菌落特征圖，表3為各種腐敗菌菌落的特征及比例。由表3可知，1號菌在培養(yǎng)基中的比例為39.25%，2號菌為30.45%，3號菌為21.34%，3株菌占所有腐敗菌的91.04%，表明這3株菌為生鮮面中主要的優(yōu)勢腐敗菌。

表3 各種腐敗菌菌落特征及比例Table 3 Characteristics and proportionsof variousspoilage bacteria colonies

圖1 3種腐敗菌菌落特征圖Fig.1 The colony characteristics of three dominant spoilagebacteria

標(biāo)記1號菌為DX，2號菌為DY，3號菌為DZ，3株優(yōu)勢腐敗菌的生理生化特征如表4所示，由表4結(jié)果與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]初步對比可知，DX為枯草芽孢桿菌，DY為地衣芽孢桿菌，DZ為蠟狀芽孢桿菌。

表4 3株優(yōu)勢腐敗菌的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristics of three dominant spoilage bacteria

2.2.2 16 SrDNA序列測定

將分離得到的3株優(yōu)勢菌DX、DY和DZ進(jìn)行16SrDNA測序鑒定。以3株優(yōu)勢腐敗菌株的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并做凝膠電泳檢測。

3株優(yōu)勢菌株16SrDNA的PCR擴(kuò)增電泳圖譜如圖2所示。由圖2可見，擴(kuò)增產(chǎn)物在1 500 bp附近可見清晰明亮條帶。

圖2 3株優(yōu)勢菌株16SrDNA的PCR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.2 16SrDNA PCRamplification electrophoresis pattern of three dominant strains

3株優(yōu)勢菌株的16SrDNA序列同源性系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。由圖3可知，所有序列與已知序列的同源性均在97%以上，說明鑒定結(jié)果可靠。經(jīng)分子鑒定后，3株菌株分別為：DX為枯草芽孢桿菌，DY為地衣芽孢桿菌，DZ為蠟狀芽孢桿菌。

圖3 3株優(yōu)勢菌株16SrDNA序列同源性系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of three dominant strainsbased on 16SrDNA sequence homology

2.3 優(yōu)勢致腐菌對生鮮面品質(zhì)的影響

2.3.1 感官評分

感官評價法目前是食品品質(zhì)評價的主要方法[20-21]。在25℃儲藏條件下接種腐敗菌的生鮮面感官評分的變化趨勢如圖4所示。由圖4可知，在儲藏期間，感官評分起始為9.10分，隨著儲藏時間的延長，評分總體都呈下降趨勢，在儲藏12 h后生鮮面外觀明顯變暗，質(zhì)地發(fā)黏，伴隨有腐爛變質(zhì)的氣味，在儲藏30 h時感官評分達(dá)到最低，且不同微生物對生鮮面感官評價的影響程度不同。同時，隨著儲藏時間的延長，感官評價下降的程度越來越明顯，其中接種DX的生鮮面的變質(zhì)程度最大，在儲藏30 h時感官評分達(dá)到最小值，即4.20分，其次是DZ和DY，其最小值分別為4.50分和5.10分，這與趙宏強(qiáng)等[22]研究的冷藏鱸魚片中優(yōu)勢腐敗菌的感官評分變化趨勢基本一致。這主要是由于不同微生物的生長速度和致腐能力不同，進(jìn)而造成生鮮面的腐敗程度也不同。

圖4 在25℃儲藏條件下接種腐敗菌的生鮮面感官評分的變化Fig.4 Thesensory scores changes of fresh noodles after inoculated with spoilage bacteria and stored at 25℃

2.3.2 酸度

酸度的變化是判斷生鮮面腐敗變質(zhì)的重要因素。在25℃儲藏條件下接種優(yōu)勢腐敗菌的生鮮面酸度的變化趨勢如圖5所示。由圖5可知，生鮮面酸度起始為0.80 mL/10 g，隨著儲藏時間的增加，所有處理生鮮面的酸度總體都逐漸上升，在儲藏18 h后，酸度上升略微平緩，在儲藏30 h時達(dá)到最大值。接種不同微生物的生鮮面的酸度之間差異較大。其中，接種DX的生鮮面在儲藏30 h時酸度達(dá)到最大值，為4.46 mL/10 g，其次是接種DZ和DY的生鮮面，酸度分別達(dá)3.90 mL/10 g和3.70 mL/10 g。對照組的酸度整體低于接種優(yōu)勢菌株的樣品組的酸度。Li等[23]研究表明，酸度與微生物的增長有顯著的正相關(guān)關(guān)系，主要是由于在儲藏過程中，微生物的生長代謝產(chǎn)物會造成生鮮面酸敗。

圖5 在25℃儲藏條件下接種腐敗菌的生鮮面酸度的變化Fig.5 The acidity changes of fresh noodlesafter inoculated with spoilage bacteria and stored at 25℃

2.3.3 pH值

pH值的變化是判斷生鮮面腐敗變質(zhì)的關(guān)鍵因素。25℃儲藏條件下接種腐敗菌的生鮮面pH值的變化趨勢如圖6所示。由圖6可知，生鮮面pH值起始為6.72，隨著儲藏時間的增加，接種優(yōu)勢腐敗菌DX、DY和DZ的生鮮面的pH值都逐漸降低，在儲藏18 h后，pH值下降略微平緩，在儲藏30 h時pH值達(dá)到最小值。剛制備出的生鮮面的pH值在6.50左右，此條件下非常適合微生物的生長[24]。隨著儲藏時間的延長，接種DX菌的生鮮面的pH值下降速率最快，在儲藏30 h時達(dá)到最小值，即pH值為5.07。其次是接種DZ的生鮮面，最后是接種DY的生鮮面，30 h時其pH值分別為5.24和5.58。此外，未接種腐敗菌的對照組的pH值都略高于其他3種，3株優(yōu)勢腐敗菌之間對生鮮面pH值的影響呈顯著性差異（P＜0.05）。引起生鮮面pH值下降的主要原因是在儲藏期間由于微生物的大量繁殖，使得生鮮面中的淀粉等碳水化合物被充分利用，產(chǎn)生了大量的有機(jī)酸等酸性產(chǎn)物，使得生鮮面的pH值不斷下降[25]。

圖6 在25℃儲藏條件下接種腐敗菌的生鮮面pH值的變化Fig.6 The pH values changes of fresh noodles after inoculated with spoilage bacteria and stored at 25℃

2.3.4 菌落總數(shù)

微生物的生長繁殖所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物是引起生鮮面腐敗變質(zhì)的主要原因之一。其最明顯的特征就是生鮮面中菌落總數(shù)的變化，這是品質(zhì)變化的指標(biāo)之一[26-27]。在25℃儲藏條件下接種腐敗菌的生鮮面菌落總數(shù)的變化趨勢如圖7所示。由圖7可知，生鮮面菌落總數(shù)起始為2.86 lg（CFU·g-1），隨著儲藏時間的增加，菌落總數(shù)總體均呈現(xiàn)上升的趨勢，其中接種DX菌的菌落總數(shù)變化最大，在儲藏30 h時達(dá)到最大值，即7.77 lg（CFU·g-1），高于其他3組，其次是DZ組，最后是DY組，菌落總數(shù)最大值分別為6.78lg（CFU·g-1）和6.62 lg（CFU·g-1），這與高磊等[28]研究的冷鮮雞腿肉中優(yōu)勢腐敗菌的菌落總數(shù)變化趨勢基本一致。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要原因可能是由于每種微生物的生長代謝速度和致腐機(jī)制不同，從而造成菌落總數(shù)不同，其結(jié)果與3種優(yōu)勢腐敗菌在感官評分、酸度以及pH值方面對生鮮面品質(zhì)影響的結(jié)果大致相同。不同菌株的生長情況會隨著儲藏時間的不同呈現(xiàn)差異，但儲藏后期因為酸類、胺類等代謝產(chǎn)物的逐漸增多，又會反過來抑制微生物的生長[29]。

圖7 在25℃儲藏條件下接種腐敗菌的生鮮面菌落總數(shù)的變化Fig.7 Thetotal coloniesnumberschanges of fresh noodlesafter inoculated with spoilage bacteria and stored at 25℃

3 結(jié)論

本試驗通過形態(tài)學(xué)鑒定篩選出3株生鮮面中的優(yōu)勢腐敗菌，再借助生理生化手段和16SrDNA序列分析法對3株優(yōu)勢腐敗菌進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果表明3株優(yōu)勢腐敗菌分別為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌。將鑒定出的3株優(yōu)勢腐敗菌回接到生鮮面中，以不同儲藏時間生鮮面的感官評分、酸度、pH值和菌落總數(shù)為指標(biāo)，綜合評價優(yōu)勢腐敗菌對生鮮面致腐能力的大小。結(jié)果表明3株優(yōu)勢腐敗菌的致腐能力為：枯草芽孢桿菌＞蠟狀芽孢桿菌＞地衣芽孢桿菌。這為生鮮面的保鮮提供了依據(jù)。