樓蔥不同極性提取液對(duì)水果采后病原菌的抑菌活性

楊文博，張 強(qiáng)，劉 慧，呂真真，劉杰超，張光弟，焦中高，*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

新鮮水果采摘后易受病原菌侵染而導(dǎo)致腐爛，從而造成巨大的資源浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)果蔬產(chǎn)量位居世界第一，每年果蔬采后損耗約為25%～30%，直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)700億元[1]。引起水果采后致病性腐爛的主要病原菌有青霉屬（Penicilliumspp.）、灰葡萄孢屬(Botrysisspp.)、鏈格孢屬(Alternariaspp.)、根霉屬(Rhizopusspp.)等[2]。其中青霉屬中的擴(kuò)展青霉、意大利青霉是引起水果采后青霉病的主要病原菌，常見于蘋果、梨等仁果類果實(shí)的采后貯藏中[3-4]。葡萄、草莓、獼猴桃等漿果類果實(shí)的采后灰霉病主要是由灰葡萄孢菌侵染引起的[5-7]。鮮棗、瓜類采后易受鏈格孢菌侵染而導(dǎo)致黑斑病[8-9]。根霉軟腐病是導(dǎo)致桃、杏、櫻桃等核果類果實(shí)采后腐爛的主要病原菌[10-12]。水果采后病原菌不僅導(dǎo)致果品品質(zhì)下降，由其產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物如鏈格孢酚[13]、棒曲霉素[14]等，具有致癌、致畸和免疫毒性，存在嚴(yán)重的食品安全隱患。

針對(duì)水果采后病害，目前國(guó)內(nèi)外主要以化學(xué)防腐保鮮為主，常用的化學(xué)防腐劑有抗菌靈、仲丁胺、特克多等。但長(zhǎng)期使用化學(xué)防腐劑存在殘留期長(zhǎng)、病原菌抗藥性增強(qiáng)等缺點(diǎn)。隨著人們對(duì)果品質(zhì)量安全要求的提高和環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，公眾迫切需要尋找安全、無毒的新型防腐保鮮劑。近年來，一些藥用植物提取物因含有豐富的抗氧化和抑菌成分，如黃酮、酚類、多糖、揮發(fā)油、生物堿等，能有效抑制微生物入侵和生長(zhǎng)，而成為開發(fā)天然保鮮劑的研究熱點(diǎn)[15-18]。王婷[19]發(fā)現(xiàn)丁香提取物對(duì)灰霉菌有明顯的抑菌作用，并顯著降低了草莓腐爛率。陶永元等[20]利用茶多酚的抑菌作用有效延長(zhǎng)了櫻桃果實(shí)的貯藏期。

現(xiàn)代藥理研究表明，蔥屬植物具有抗腫瘤[21]、抗癌[22]、抑菌[23]和抗氧化[24]等功能活性，富含潛在的抑菌活性成分。樓蔥（Allium cepaLinn.var.proliferumRegel）為百合科（Liliaceae）蔥屬（Allium）洋蔥的變種，主要分布于我國(guó)東北、華北、西北等地，是我國(guó)北方傳統(tǒng)蔬菜和重要經(jīng)濟(jì)作物[25]。本研究以樓蔥全株為原料，對(duì)其不同極性溶劑提取液的總酚含量、類黃酮含量、抗氧化活性、抑菌活性進(jìn)行測(cè)定及相關(guān)性分析，探明了樓蔥最佳抑菌活性部位，為挖掘天然植物抑菌成分，創(chuàng)制新型保鮮劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

新鮮樓蔥購(gòu)于寧夏。供試菌株為灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）、黑根霉（Rhisopus nigricans）、鏈格孢菌（Alternaria alternata），均為實(shí)驗(yàn)室從水果中篩選獲得的優(yōu)勢(shì)病原菌。PDA培養(yǎng)基、瓊脂粉，均購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限公司。Folin-C試劑、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%）、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%）、抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%），均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、碳酸鈉、氯化鈉、乙醇、甲醇、二甲基亞砜（DMSO）均為分析純級(jí)，購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

RE-2000型旋蒸蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；JY2002型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Alpha 2-4 LSCplus型冷凍干燥機(jī)，德國(guó)CHRIST公司；JYL-G12E榨汁攪拌機(jī)，中國(guó)九陽(yáng)股份有限公司；DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHP-9052型生化培養(yǎng)箱，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；H1406632型電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；WFJ 7200型紫外分光光度計(jì)，尤尼柯上海儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樓蔥不同極性提取液的制備

將新鮮樓蔥清洗、晾干、切段后稱取1 100 g，放入榨汁攪拌機(jī)中打碎，然后用80%乙醇和水作為提取溶劑對(duì)樓蔥進(jìn)行梯次提取，料液比為1∶4（m/V），每種提取溶劑浸泡3次，每次浸泡3 d，過濾后合并浸出液，減壓濃縮后得到樓蔥乙醇提取物和水提取物。樓蔥乙醇提取物加蒸餾水充分溶解后，依次用正丁醇、乙酸乙酯、石油醚梯次萃取，每種溶劑重復(fù)萃取3次后合并萃取液，減壓濃縮后得到正丁醇相、乙酸乙酯相、石油醚相及水相4個(gè)不同極性部位。因此，共得到樓蔥5個(gè)不同極性部位提取物。

1.2.2 樓蔥不同極性部位提取物中總酚、類黃酮含量及抗氧化活性的測(cè)定

將樓蔥5個(gè)不同極性部位提取物分別溶于甲醇中，并稀釋至適宜濃度。

總酚含量：采用Folin-Ciocalteu法[26]測(cè)定，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)曲線，總酚含量換算為μg GAE/mg。

類黃酮含量：采用硝酸鋁比色法[27]測(cè)定，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)曲線，類黃酮含量換算為μg CA/mg。

抗氧化活性：參考Geng等[28]的方法略做改動(dòng)，以抗壞血酸DPPH·清除率為標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果換算為μg VC/mg。

1.2.3 菌種懸浮液的制備

將4株供試菌株接到PDA斜面培養(yǎng)基中，28℃活化48 h后，在無菌條件下，加入5 mL無菌生理鹽水中振蕩搖勻，將菌種懸浮液稀釋到1×105個(gè)/mL（血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)），置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 牛津杯法測(cè)定抑菌圈直徑

取樓蔥不同極性部位各1mg，溶于1mL 5%DMSO溶液中即為待測(cè)樣品，4℃冰箱保存待測(cè)。將PDA固體培養(yǎng)基滅菌后，倒入一次性培養(yǎng)皿中，待冷卻凝固后，每皿各取100μL菌種懸浮液，用一次性滅菌涂布棒均勻涂布、晾干后，用無菌鑷子在固體培養(yǎng)基上放置直徑為6 mm的牛津杯，然后每個(gè)牛津杯中加入待測(cè)樣品溶液100μL，同時(shí)每個(gè)培養(yǎng)皿用0.5%DMSO設(shè)置一個(gè)溶劑對(duì)照組，每組待測(cè)溶液設(shè)置3組重復(fù)，放入4℃冰箱擴(kuò)散12 h后，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑[29]。

1.2.5 樓蔥不同極性部位提取物對(duì)4種病原菌最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測(cè)定

采用二倍稀釋法[30]，準(zhǔn)確稱取樓蔥不同極性部位添加到PDA培養(yǎng)基中，搖勻，制成最終濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0 mg/mL的含藥培養(yǎng)基。將含藥培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，冷凝后加入100μL濃度為1×105的孢子懸浮液，涂布。每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)組。然后置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察，以無菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。將無菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)48 h后觀察，以無菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿的最低濃度為最小殺菌濃度（MBC）。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定3個(gè)平行，方差及相關(guān)性用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照“1.2.2”方法測(cè)定的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=0.009 7X+0.013 8,回歸系數(shù)R2=0.999 8，線性關(guān)系良好。兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.008 9X-0.014 5，回歸系數(shù)R2=0.999 3,線性關(guān)系良好?？箟难酓PPH·清除率標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.512 6X+6.777 7，回歸系數(shù)R2=0.999 4，線性關(guān)系良好。其中X分別為測(cè)試溶液中沒食子酸、兒茶素含量及抗壞血酸DPPH·清除率，Y為反應(yīng)溶液的吸光度。

2.2 樓蔥不同極性部位提取物得率、總酚、類黃酮含量及抗氧化活性的比較

表1為樓蔥不同極性部位得率、總酚、類黃酮含量及抗氧化活性方差分析。對(duì)比樓蔥各部位得率可知，樓蔥水相和水提物得率最高，分別為3.14%和8.71%，約占樓蔥總提取物的90%。正丁醇相、乙酸乙酯相和石油醚相得率較低，且無顯著差異（P＜0.05）。說明樓蔥中水溶性物質(zhì)較多，可能主要以水溶性多糖為主[31]。比較樓蔥5個(gè)不同極性部位的總酚、類黃酮含量可知，樓蔥乙酸乙酯相總酚及類黃酮含量顯著高于其他部位（P＜0.05），分別為（534.23±8.93）μg GAE/mg和（172.80±2.25）μg CA/mg，其次為正丁醇相、石油醚相、水提物和水相，并有顯著差異（P＜0.05）。另外，樓蔥不同極性部位均有抗氧化活性，且有顯著差異（P＜0.05）。其中乙酸乙酯相抗氧化活性最高，為（1 463.19±3.68）μg VC/mg，其抗氧化活性明顯高于抗壞血酸。水提物和水相抗氧化活性最低，分別（79.14±0.23）μg VC/mg和（20.82±0.40）μg VC/mg。對(duì)比總酚、類黃酮含量及抗氧化活性大小發(fā)現(xiàn)，抗氧化活性變化趨勢(shì)與總酚、類黃酮含量成正比。

表1 樓蔥不同極性部位提取物得率、總酚、類黃酮含量及抗氧化活性（n=3）Table1 Theyield,total phenol,total flavonoid and antioxidant activities of variouspolar extract of Alliumcepa Linn.var.proliferum Regel(n=3)

2.3 樓蔥不同極性部位提取物對(duì)4種病原菌的抑菌圈直徑

表2為樓蔥不同極性部位對(duì)同一菌株抑菌活性方差分析，由表2可知，樓蔥正丁醇相、乙酸乙酯相和石油醚相對(duì)灰葡萄孢菌、擴(kuò)展青霉、黑根霉及鏈格孢菌均有抑菌圈，而水相和水提物對(duì)4種病原菌均無抑菌圈。對(duì)比不同極性部位對(duì)同一菌株的抑菌圈直徑可知，乙酸乙酯相的抑菌圈直徑顯著高于其他極性部位（P＜0.05）。正丁醇相對(duì)擴(kuò)展青霉、黑根霉和鏈格孢菌的抑菌圈直徑均顯著高于石油醚相（P＜0.05），但這兩個(gè)極性部位對(duì)灰葡萄孢菌的抑菌圈直徑無顯著差異。綜上所述，樓蔥水相和水提物對(duì)4種病原菌均無抑菌活性，正丁醇相、乙酸乙酯相和石油醚相抑菌活性較好，且乙酸乙酯相抑菌活性最強(qiáng)，這可能與該部位總酚、類黃酮物質(zhì)含量較高有關(guān)。

表2 樓蔥不同極性部位提取物抑菌圈直徑（n=3）Table2 Theantimicrobial circlediameter of variouspolar extractsof Alliumcepa Linn.var.proliferum Regel(n=3) 單位：mm

2.4 樓蔥不同極性部位提取物對(duì)4種病原菌的最小抑菌濃度及最小殺菌濃度

由于樓蔥水相和水提物對(duì)灰葡萄孢菌、擴(kuò)展青霉、黑根霉和鏈格孢菌均無抑菌活性，因此該部分只對(duì)正丁醇相、乙酸乙酯相和石油醚相進(jìn)行MIC和MBC測(cè)定。由表3可知，乙酸乙酯相對(duì)灰葡萄孢菌、擴(kuò)展青霉、黑根霉和鏈格孢菌均有最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，且對(duì)黑根霉有最低值，分別為1.56、6.25 mg/mL，對(duì)鏈格孢菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度分別為3.12、12.05 mg/mL，對(duì)灰葡萄孢霉和擴(kuò)展青霉的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度均為25.00mg/mL和50.00 mg/mL。說明樓蔥乙酸乙酯相對(duì)4種病原菌的抑菌效果不同，黑根霉對(duì)該極性部位更敏感。

表3 樓蔥不同極性部位提取物的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)Table 3 Minimal inhibitory concentrations(MIC)and minimal bactericidal concentration(MBC)of variouspolar extractsof Alliumcepa Linn.var.proliferum Regel(n=3) 單位：mg/mL

正丁醇相對(duì)4種病原菌的抑菌活性均弱于乙酸乙酯相，同樣對(duì)黑根霉的抑菌活性最強(qiáng)，最小抑菌濃度和最小殺菌濃度分別為3.13、25.00 mg/mL，其次為鏈格孢菌，分別為12.50、25.00 mg/mL。而對(duì)灰葡萄孢霉和擴(kuò)展青霉只有最小抑菌濃度，均為25.00 mg/mL。

另外，由表3可知，當(dāng)含藥培養(yǎng)基中石油醚相添加濃度為25.00 mg/mL時(shí)，才能抑制黑根霉的生長(zhǎng)，該部位對(duì)鏈格孢菌、灰葡萄孢菌和擴(kuò)展青霉的抑制作用更弱，最小抑菌濃度分別為50.00、100.00和100.00 mg/mL。該極性部位對(duì)4種病原菌均無最小殺死濃度。

綜上所述，樓蔥正丁醇相、乙酸乙酯相和石油醚相均能有效抑制灰葡萄孢菌、擴(kuò)展青霉、黑根霉和鏈格孢菌的生長(zhǎng)，其中乙酸乙酯相抑菌活性最強(qiáng)。黑根霉對(duì)這3個(gè)不同極性部位最敏感，最小抑菌濃度和最小殺菌濃度值最低，這與不同極性部位抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果一致。

2.5 樓蔥不同極性部位提取物理化指標(biāo)與生物活性相關(guān)性分析

利用SPSS軟件對(duì)樓蔥不同極性部位的總酚、類黃酮含量、抗氧化活性及抑菌活性進(jìn)行相關(guān)性分析。如表4所示，樓蔥不同極性部位的總酚含量、類黃酮含量與其抗氧化活性之間呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），說明樓蔥中不同部位的多酚和類黃酮物質(zhì)含量是影響其抗氧化活性的主要因素。另外，樓蔥中總酚含量、類黃酮含量與4種病原菌的抑菌圈直徑均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（P＜0.05），說明不同部位的總酚和類黃酮含量對(duì)其抑菌活性有顯著影響。

表4 樓蔥不同極性部位提取物總酚、類黃酮含量與其抗氧化活性、抑菌活性的相關(guān)性分析Table4 Correlation analysisbetween total phenol,flavonoid contents and antioxidant and antimicrobial activities of variouspolar extractsof Alliumcepa Linn.var.proliferum Regel

3 討論與結(jié)論

本研究以新鮮樓蔥為原料，對(duì)其不同極性部位進(jìn)行分離制備，并對(duì)其得率、總酚含量、類黃酮含量、抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)，選取4種常見水果采后病原菌為供試菌株，對(duì)樓蔥不同極性部位的抑菌活性進(jìn)行探討，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，樓蔥不同極性部位提取物的總酚、類黃酮含量是影響其抗氧化活性的主要因素，說明樓蔥中酚類、類黃酮類物質(zhì)是主要的抗氧化活性物質(zhì)，水溶性部位主要以多糖為主，抗氧化活性較低，這與李璐等[32]研究結(jié)果一致。除水溶性部位對(duì)各試驗(yàn)菌株無抑菌活性，其余部位均有不同的抑菌活性，這與楊粟艷[33]研究結(jié)果相同，結(jié)合表1試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑菌活性與總酚、類黃酮含量呈正相關(guān)性，表4結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。張金桐等[34]研究結(jié)果顯示類黃酮物質(zhì)中的羥基基團(tuán)具備一定的抗菌活性。魏國(guó)華等[35]研究表明，植物多酚能通過酚羥基與酶蛋白形成多點(diǎn)結(jié)合，從而改變微生物酶的活性并破壞其蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，抑制微生物繁殖。說明酚類、類黃酮的抑菌活性與其羥基官能團(tuán)有直接關(guān)系，羥基數(shù)量越多，抑菌活性越強(qiáng)，這與本試驗(yàn)結(jié)果研究一致。另外，Xue等[36]的研究結(jié)果顯示羥基可以通過清除自由基，降低水果細(xì)胞膜損傷，阻止微生物與生物體之間的物質(zhì)交換，從而抑制微生物生長(zhǎng)，說明樓蔥活性成分的抑菌活性與其抗氧化活性有一定相關(guān)性，其抑菌機(jī)制可能與膜物質(zhì)交換和抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)合成有關(guān)，但是還需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，樓蔥中的多酚和類黃酮物質(zhì)是潛在的天然植物抑菌劑，且乙酸乙酯部位是挖掘樓蔥功能活性物質(zhì)的主要極性部位，可作為目標(biāo)活性部位進(jìn)行后續(xù)分離單體化合物，并探究其抑菌機(jī)制，為挖掘天然植物抑菌成分、開發(fā)新型植物抑菌劑提供理論依據(jù)。