利用小RNA測序技術(shù)鑒定吉林省甘薯病毒

張春雨 李小宇 劉峰 王永志

摘要 ：在吉林省7個主要甘薯種植區(qū)共采集85份甘薯葉片樣品，利用小RNA深度測序技術(shù)對混合樣品進行檢測，經(jīng)RT-PCR和測序驗證，鑒定出樣品中存在10種病毒，包括6種RNA病毒和4種DNA病毒。分別是馬鈴薯Y病毒科馬鈴薯Y病毒屬的甘薯羽狀斑駁病毒Sweet potato feathery mottle virus （SPFMV）、甘薯潛隱病毒Sweet potato latent virus （SPLV）、甘薯G病毒Sweet potato virus G （SPVG）、甘薯C病毒Sweet potato virus C （SPVC）、甘薯2號病毒Sweet potato virus 2 （SPV2）;長線形病毒科毛形病毒屬的甘薯褪綠矮化病毒Sweet potato chlorotic stunt virus （SPCSV）;雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬的甘薯曲葉病毒Sweet potato leaf curl virus（SPLCV）;玉米線條病毒屬的甘薯無癥狀1號病毒Sweet potato symptomless virus 1 （SPSMV1）;花椰菜花葉病毒科桿狀DNA病毒屬的甘薯桿狀DNA病毒B Sweet potato badnavirus B （SPBV-B）和甘薯隱癥病毒Sweet potato pakakuy virus （SPPV）。

關(guān)鍵詞 ：甘薯病毒; 小RNA深度測序; 吉林

中圖分類號：

S 435.311

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020090

Identification of viruses in sweet potato samples collected from

Jilin province by small RNA sequencing

ZHANG Chunyu， LI Xiaoyu， LIU Feng， WANG Yongzhi*

（Jilin Academy of Agricultural Sciences， Gongzhuling 136100， China）

Abstract

85 samples of sweet potato leaf were collected from seven main sweet potato areas in Jilin province. Ten species of sweet potato virus were identified， including six RNA viruses and four DNA viruses， by using small RNA deep sequencing， RT-PCR and sequencing. The 10 viruses were Sweet potato feathery mottle virus （SPFMV）， Sweet potato latent virus （SPLV）， Sweet potato virus G （SPVG）， Sweet potato virus C （SPVC） and Sweet potato virus 2 （SPV2） in genus Potyvirus， family Potyviridae; Sweet potato chlorotic stunt virus （SPCSV） in genus Crinivirus， family Closteroviridae; Sweet potato leaf curl virus （SPLCV） in genus Begomovirus， family Geminiviridae; Sweet potato symptomless virus 1 （SPSMV1） in genus Mastrevirus， family Geminiviridae; Sweet potato badnavirus B （SPBV-B） and Sweet potato pakakuy virus （SPPV） in genus Badnavirus， family Caulimoviridae.

Key words

sweet potato viruses; small RNA deep sequencing; Jilin

甘薯Ipomoea batatas （L.） Lam.，旋花科甘薯屬，是我國重要的糧食作物和經(jīng)濟作物。甘薯在吉林省廣泛種植，主產(chǎn)區(qū)在中部和西部，由于種植區(qū)特殊的地理氣候特點，甘薯生長期晝夜溫差大，品質(zhì)高，口味佳，深受老百姓喜愛，是重要的經(jīng)濟作物，種植面積逐年增加。甘薯為無性繁殖作物，病毒病危害嚴重，造成產(chǎn)量質(zhì)量受損，種質(zhì)退化等。目前，全世界已鑒定出能夠侵染甘薯的病毒共32種，分屬于9個科[12]。在我國已發(fā)現(xiàn)侵染甘薯的病毒至少達15種[24]，報道最多的是甘薯羽狀斑駁病毒Sweet potato feathery mottle virus （SPFMV）、甘薯褪綠矮化病毒Sweet potato chlorotic stunt virus （SPCSV）和雙生病毒科的甘薯曲葉病毒Sweet potato leaf curl virus（SPLCV）等。近年來調(diào)查發(fā)現(xiàn)吉林省甘薯病毒病害日趨嚴重，但相關(guān)報道幾乎沒有。本研究對吉林省主要甘薯種植區(qū)進行采樣調(diào)查，利用小RNA深度測序和RT-PCR對樣品進行鑒定，對病毒種類進行初步了解，為今后甘薯病毒病的防控和脫毒育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

調(diào)查吉林省甘薯主要種植區(qū)松原市長嶺縣、乾安縣，白城市洮南市，長春市，遼源市，白山市撫松縣，四平市梨樹縣等7個地區(qū)的大田和苗地病毒病發(fā)生情況，采集甘薯病毒病顯癥葉片及無癥（健康）葉片樣品共85份，-80℃冰箱保存。

1.2 總RNA提取

采集的甘薯葉片混合樣品參照TRIzol說明書提取總RNA，測定濃度。

1.3 小RNA文庫建立、測序及分析

混合樣品總RNA由北京諾禾致源科技股份有限公司檢測，樣品檢測合格后使用Small RNA Sample Pre Kit構(gòu)建文庫，文庫構(gòu)建完成后先使用Qubit 2.0初步定量，再使用Agilent 2100對文庫的insert size進行檢測，insert size符合預期后使用qPCR對文庫有效濃度進行準確定量，以保證文庫質(zhì)量。文庫檢測合格后進行HiSeq/MiSeq測序，采用無參考基因組寄主病毒sRNA分析流程進行候選病毒評估。

1.4 RT-PCR驗證

根據(jù)小RNA測序獲得的結(jié)果，設計病毒引物（表1），以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行RT-PCR擴增。50 μL PCR反應體系：2×SanTaq PCR Mix 25 μL，引物各2 μL，模板cDNA 0.5 μL，ddH2O 20.5 μL。擴增條件：94℃預變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的片段由吉林省庫美生物科技有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

采集的甘薯混合葉片提取的總RNA濃度為1 459 ng/μL，對其進行質(zhì)量分析，符合建庫要求。樣本共獲得26 418 427個reads，去除含有接頭的、低質(zhì)量的reads，獲得clean reads 26 160 127個，其長度分布見圖1。由于病毒感染的植物，富集的viral sRNAs長度主要是3個class，21 nt（15.91%），22 nt（23.69%）和24 nt（24.36%），因此篩選18～26 nt的sRNA進行后續(xù)分析。

用bowtie將數(shù)據(jù)過濾后的sRNA與GenBank Virus RefSeq核酸數(shù)據(jù)庫進行比對，初步鑒定樣品感染病毒的list，其中能比對到參考序列的reads數(shù)占總reads數(shù)的4.06%。通過PFOR和velvet拼接，獲得6 082個contigs，長度分布見圖2。將拼接所得的contigs進行分類注釋，其中與已知的甘薯病毒相關(guān)的有11種，見表2。

為驗證sRNA注釋結(jié)果的可靠性，根據(jù)拼接序列設計了10種病毒的特異性引物，其中甘薯上海曲葉病毒Sweet potato leaf curl Shanghai virus（SPLCShV）和甘薯加納利曲葉病毒Sweet potato leaf curl Canary virus（SPLCCV）同為菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus成員，因此設計了一對該屬的通用引物。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進行RT-PCR檢測，均擴增出與預期大小一致的片段（圖3）。

其中甘薯褪綠矮化病毒Sweet potato chlorotic stunt virus SPCSV條帶較弱，將回收的PCR產(chǎn)物測序，結(jié)果通過NCBI進行BLASTn分析，擴增片段均符合目的病毒序列，表明深度測序結(jié)果準確。

3 討論

本研究利用小RNA測序技術(shù)，從采集的甘薯葉片混合樣本cDNA文庫中檢測到SPFMV、SPLV、SPVG、SPVC、SPV2、SPCSV、SPLCShV、SPLCCV、SPSMV1、SPBV-B、SPPV等共11種病毒，并應用RT-PCR進行了驗證。

其中SPFMV、SPLV、SPVG、SPVC、SPV2為馬鈴薯Y病毒科Potyviridae馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus成員。SPFMV是近年來報道侵染甘薯的病毒中分布最廣泛，危害最大的病毒，被其單獨侵染的植株多數(shù)不表現(xiàn)癥狀或葉片呈輕度斑駁。SPFMV通常與線性病毒科Closteroviridae毛形病毒屬Crinivirus的SPCSV共同侵染，產(chǎn)生的病害簡稱甘薯病毒病害sweet potato virus diseases（SPVD）[5]。SPVD造成植株叢生矮化，葉片變小，扭曲畸形，葉綠素含量降低，嚴重時造成70% 以上的減產(chǎn)，甚至絕收，其發(fā)生癥狀與病毒積累量有一定關(guān)系，潛伏期可長達3年[6]。

SPLCV為雙生病毒科Geminiviridae菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus成員。田間被SPLCV侵染的植株并不常表現(xiàn)典型的曲葉癥狀，或者表現(xiàn)癥狀維持的時間很短[7]，但會對某些品種的甘薯造成嚴重的產(chǎn)量損失。例如Clark等[8]，Ling等[9]發(fā)現(xiàn)SPLCV侵染甘薯品種‘Beauregard雖不表現(xiàn)典型的曲葉癥狀，卻導致甘薯產(chǎn)量損失26%及63%。目前，侵染甘薯的Begomovirus病毒共分為13個正式種，本研究中小RNA深度測序比對到的Begomovirus病毒有2種，分別為SPLCShV和SPLCCV，其中SPLCShV為暫定種。設計了一對該屬病毒的通用引物，對RT-PCR獲得的片段測序分析，鑒定為甘薯曲葉病毒Sweet potato leaf curl virus。在后續(xù)試驗中，會進一步對單個樣品感染的Begomovirus病毒進行序列分析鑒定。

SPBV-B和SPPV為花椰菜花葉病毒科Caulimoviridae桿狀病毒屬Badnavirus成員，其中SPBV-B為暫定種。

本文首次對吉林省的甘薯病毒病進行了初步普查，利用小RNA深度測序方法鑒定出分屬4個科的10種病毒，為甘薯脫毒繁育提供了重要的理論依據(jù)。

參考文獻

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（責任編輯：田 喆）