棉鈴蟲(chóng)小分子熱激蛋白sHSP22.0基因的克隆及表達(dá)譜分析

楊朔 劉少凱 趙少軒 朱宇辰 徐磊 李童云 劉曉光 安世恒 魏紀(jì)珍

摘要 ：棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，本文旨在研究小分子熱激蛋白在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程、抵御高溫及Cry1Ac殺蟲(chóng)蛋白中的功能。利用PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆了棉鈴蟲(chóng)sHSP22.0（small heat shock protein 22.0）基因，通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析了棉鈴蟲(chóng)sHSP22.0基因序列，利用實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR分析了該基因在棉鈴蟲(chóng)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和組織中的表達(dá)模式;并分析了該基因受高溫及Cry1Ac全長(zhǎng)蛋白的誘導(dǎo)效應(yīng)。獲得了棉鈴蟲(chóng)sHSP22.0（GenBank登錄號(hào)： XP_021196802.1） 761 bp cDNA片段，其開(kāi)放閱讀框576 bp，編碼191個(gè)氨基酸，具有小分子熱激蛋白典型的α-晶體結(jié)構(gòu)域（α-crystallin domain，ACD）。sHSP22.0在棉鈴蟲(chóng)4齡和5齡期特異性表達(dá)，尤其在5齡幼蟲(chóng)的表皮、中腸和后腸內(nèi)特異性表達(dá)。該小分子熱激蛋白受溫度和Cry1Ac全長(zhǎng)蛋白的誘導(dǎo)后顯著高表達(dá)。sHSP22.0不僅在暴食期及腸道內(nèi)特異性表達(dá)，而且響應(yīng)Cry1Ac全長(zhǎng)蛋白的誘導(dǎo)，表明它在棉鈴蟲(chóng)消化吸收及抵御外源物的活動(dòng)中可能起到重要的作用。

關(guān)鍵詞 ：棉鈴蟲(chóng); 小分子熱激蛋白; sHSP22.0; 溫度; Cry1Ac全長(zhǎng)蛋白

中圖分類(lèi)號(hào)：

Q 966

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020009

Molecular cloning and expression profiling of small heat shock protein 22.0 in

Helicoverpa armigera （Lepidoptera： Noctuidae）

YANG Shuo， LIU Shaokai， ZHAO Shaoxuan， ZHU Yuchen， XU Lei， LI Tongyun，

LIU Xiaoguang， AN Shiheng， WEI Jizhen*

（State Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science， College of Plant Protection， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China）

Abstract

Helicoverpa armigera is an important agricultural pest. This study aims to explore the functions of small heat shock protein 22.0 gene （sHSP22.0） in the growth and development of cotton bollworm， and its role in suffering the high temperature and Cry1Ac protein. The full-length cDNA sequence of sHSP22.0 gene was cloned from H.armigera by using PCR and RACE （rapid amplification of cDNA ends） technology， and the sHSP22.0 gene was analyzed by bioinformatics related molecular software. Real-time quantitative PCR （qRT-PCR） was used to assess the expression patterns of sHSP22.0 in different developmental stages and tissues of cotton bollworm. Meanwhile， the expression levels of sHSP22.0 were also checked in the larval after heat and full-length Cry1Ac protein treatments. The results showed that the full-length cDNA sequence of sHSP22.0 （GenBank accession no： XP_021196802.1） was 761 bp with an open reading frame （ORF） 576 bp in length， encoding 191 amino acids， and it had the typical α-crystallin domain （ACD）. The sHSP22.0 gene was specially expressed in 4th and 5th instar larvae， and especially expressed in midgut， hindgut and cuticle of 5th instar larvae. After the heat and full-length Cry1Ac protein treatments， sHSP22.0 showed special expression in 5th instar larvae. The sHSP22.0 gene specially expresses in the gluttony period and gut of H.armigera， and importantly， it is induced by full-length Cry1Ac protein. All the results indicate sHSP22.0 may participate in the activities of the digestion and absorption， and may have the function in defensing against exogenous substrates.

Key words

Helicoverpa armigera; small heat shock protein; sHSP220; temperature; full-length Cry1Ac protein

熱激蛋白（heat shock proteins，HSPs）在生物體內(nèi)廣泛存在，以應(yīng)激蛋白和分子伴侶的方式響應(yīng)外界生物和非生物因子的壓力，參與蛋白質(zhì)的裝配、折疊和跨膜傳導(dǎo)等眾多的生物過(guò)程[12]。按照序列的同源性及分子量的大小，熱激蛋白常被分為4類(lèi)：HSP90（85～90 kDa）、HSP70（68～73 kDa）、HSP60和小分子量sHSP家族[3]。在自然界中，昆蟲(chóng)個(gè)體較小又是變溫動(dòng)物，由于長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境的變化，昆蟲(chóng)體內(nèi)進(jìn)化出了種類(lèi)繁多的熱激蛋白[4]。其中小分子熱激蛋白（sHSP）的數(shù)目尤為繁多，它們具有保守的α-晶狀體結(jié)構(gòu)域，但相對(duì)于大分子的熱激蛋白，其序列不保守且功能復(fù)雜。小分子熱激蛋白的發(fā)現(xiàn)也較晚，1974年科學(xué)家才從黑腹果蠅Drosophila melanogaster中發(fā)現(xiàn)了小分子熱激蛋白[5]，對(duì)小分子熱激蛋白的研究較少。后隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，更多的小分子熱激蛋白被鑒定出來(lái)，例如在家蠶Bombyx mori中發(fā)現(xiàn)了16種sHSP，小菜蛾P(guān)lutella xylostella中鑒定出15種sHSP，另外棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera中也發(fā)現(xiàn)了8種sHSP[68]。研究發(fā)現(xiàn)這些小分子熱激蛋白在生物體內(nèi)表達(dá)模式多種多樣，推測(cè)它們可能在昆蟲(chóng)的發(fā)育過(guò)程和各種生理活動(dòng)中具有重要的功能，例如調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖[912]、抵御溫度變化[1315]、參與昆蟲(chóng)的滯育[1617]和抵御農(nóng)藥的危害等[18]。

棉鈴蟲(chóng)是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，為害棉花、玉米、花生等幾百種農(nóng)作物[1920]。近20多年來(lái)，人們主要通過(guò)種植轉(zhuǎn)蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis（Bt）殺蟲(chóng)蛋白基因的作物來(lái)防治棉鈴蟲(chóng)。然而，棉鈴蟲(chóng)的發(fā)生隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整產(chǎn)生了明顯的變化，玉米、花生、蔬菜等非Bt作物種植面積增加，棉鈴蟲(chóng)寄主植物發(fā)生了轉(zhuǎn)變，從而致使其種群密度不斷增加，為害加重[21]。因此對(duì)棉鈴蟲(chóng)的研究和防治仍然任重而道遠(yuǎn)。

在棉鈴蟲(chóng)中，不同分子量的熱激蛋白逐漸被鑒定出來(lái)，但是具體每種熱激蛋白的功能研究還處于初級(jí)階段。棉鈴蟲(chóng)熱激蛋白HSP70和HSP21.4基因在棉鈴蟲(chóng)滯育蛹的腦中高表達(dá)[2223]，隨后研究發(fā)現(xiàn)熱效應(yīng)因子HSF1（heat shock factor 1）在棉鈴蟲(chóng)滯育階段調(diào)控Hsp70的上調(diào)表達(dá)，參與了棉鈴蟲(chóng)滯育[24]。棉鈴蟲(chóng)熱激蛋白Hsp19.5、Hsp19.7、Hsp22.0、Hsp272、Hsp60、HSC70、Hsp200、Hsp20.7、Hsp20.8、Hsp21.4、HSC90基因響應(yīng)光脅迫，這些熱激蛋白以不同的方式協(xié)調(diào)保護(hù)昆蟲(chóng)免受紫外線(xiàn)的傷害[8]。經(jīng)37℃到42℃熱激處理后，棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)唾液腺中，Hsp70和Hsp64高豐度表達(dá)，但在幼蟲(chóng)的馬氏管、睪丸和脂肪體中Hsp70幾乎不表達(dá)而Hsp64高水平表達(dá)[25]，這預(yù)示著不同的熱激蛋白在不同的組織中可能發(fā)揮不同的功能。棉鈴蟲(chóng)Hsp70和Hsp90在溫度高于38℃時(shí)表達(dá)量會(huì)隨溫度的升高逐漸升高，這可能與環(huán)境溫度適應(yīng)相關(guān)[26]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，棉鈴蟲(chóng)HSP70可與Cry1Ac蛋白結(jié)合[27]，Cry1Ac殺蟲(chóng)蛋白處理后，棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)HSP70基因的表達(dá)量降低[28]。

上述對(duì)棉鈴蟲(chóng)熱激蛋白的鑒定和功能研究在一定程度上豐富了熱激蛋白的研究。但是隨著氣溫的變化及轉(zhuǎn)cry1Ac基因的棉花在我國(guó)的全面推廣等，來(lái)自外界的環(huán)境壓力迫使棉鈴蟲(chóng)快速適應(yīng)環(huán)境變化，而熱激蛋白在棉鈴蟲(chóng)抵御環(huán)境壓力中的功能還急需研究，這對(duì)棉鈴蟲(chóng)的種群控制具有重要的意義。在本研究中，我們通過(guò)分子生物學(xué)手段，克隆了棉鈴蟲(chóng)的一個(gè)小分子熱激蛋白sHSP22.0基因，分析了它在棉鈴蟲(chóng)不同發(fā)育歷期和組織中的表達(dá)譜，并比較了其在受到高溫和Cry1Ac全長(zhǎng)蛋白誘導(dǎo)時(shí)的表達(dá)情況，為豐富棉鈴蟲(chóng)熱激蛋白的研究及棉鈴蟲(chóng)的防控提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試棉鈴蟲(chóng)及Bt殺蟲(chóng)蛋白

本研究中供試棉鈴蟲(chóng)為未接觸任何生物殺蟲(chóng)劑或化學(xué)殺蟲(chóng)劑的棉鈴蟲(chóng)敏感種群LF品系（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所棉花害蟲(chóng)組梁革梅研究員贈(zèng)予），幼蟲(chóng)取食棉鈴蟲(chóng)人工飼料，成蟲(chóng)取食10%的糖水，于室內(nèi)相對(duì)濕度（75±10）%，溫度（27±2）℃和光周期L∥D=14 h∥10 h條件下連續(xù)飼養(yǎng)15年[29]。

Cry1Ac全長(zhǎng)蛋白購(gòu)于北京綻諾思特生物科技有限公司。

1.2 樣品準(zhǔn)備

1.2.1 棉鈴蟲(chóng)各發(fā)育階段和組織樣品的準(zhǔn)備

飼養(yǎng)棉鈴蟲(chóng)，分別收集1齡（20頭）、2齡（10頭）、3齡（5頭）、4齡（3頭）、5齡（3頭）、蛹（3頭）和成蟲(chóng)（3頭），為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用于研究sHSP22.0基因在棉鈴蟲(chóng)各發(fā)育階段的表達(dá)模式。取5齡第2天棉鈴蟲(chóng)10頭，在冰上解剖棉鈴蟲(chóng)的前腸、中腸、后腸、馬氏管和表皮。解剖后，前腸、中腸和后腸用4℃預(yù)冷的0.7% NaCl溶液洗去內(nèi)含物，用濾紙吸干水分后保存?zhèn)溆?，用于比較不同組織中sHSP22.0基因的表達(dá)差異。上述樣品一經(jīng)處理后，立即放入液氮冷凍，再轉(zhuǎn)放到-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 高溫處理樣品的準(zhǔn)備

取27℃正常飼養(yǎng)的5齡棉鈴蟲(chóng)，放入40℃培養(yǎng)箱，處理1 h和2 h后，立即放入液氮中冷凍，再轉(zhuǎn)存到-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｍ瑯尤∩L(zhǎng)狀況一致的棉鈴蟲(chóng)，于27℃分別處理1 h和2 h為對(duì)照。每個(gè)處理包括4次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取樣3頭。

1.2.3 Cry1Ac處理樣品的準(zhǔn)備

飼養(yǎng)棉鈴蟲(chóng)，取5齡第1天棉鈴蟲(chóng)，饑餓24 h后，轉(zhuǎn)到含30 μg/mL Cry1Ac全長(zhǎng)蛋白（經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，該濃度是處理5齡棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)7 d后LC30的劑量）或不含Cry1Ac全長(zhǎng)蛋白的人工飼料上，飼喂1 h和2 h后，立即轉(zhuǎn)移到冰上解剖取中腸，步驟同1.2.1。每個(gè)處理包括4次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取樣10頭。

1.3 總RNA的提取和cDNA合成

以上各備用樣品總RNA的提取采用TRIzol法，按Invitrogen的操作說(shuō)明提取。RACE擴(kuò)增所用的cDNA模板的合成參考SMART-RACE cDNA Amplification Kit 說(shuō)明書(shū)操作，樣品為棉鈴蟲(chóng)5齡幼蟲(chóng)的中腸組織。熒光定量qRT-PCR所用cDNA模板依照SuperReal PreMix（Probe）說(shuō)明書(shū)合成。

1.4 棉鈴蟲(chóng)sHSP22.0全長(zhǎng)基因克隆

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)室得到的棉鈴蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[30]，獲得sHSP22.0的部分序列，利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性5′RACE引物sHSP22.0-RACE-5′（表1），以敏感棉鈴蟲(chóng)cDNA為模板，擴(kuò)增其5′端序列。PCR的反應(yīng)體系為25 μL：1 μL cDNA，2.5 μL 10×Buffer， 0.25 μL LATaq，0.5 μL sHSP22.0-RACE-5′引物（10 mmol/L），2.5 μL UPM，18.25 μL無(wú)菌水。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s，72℃ 延伸3 min， 循環(huán)5次;94℃變性30 s，70℃ 退火30 s， 72℃延伸3 min，循環(huán)5次;94℃變性30 s，68℃ 退火30 s， 72℃延伸3 min，循環(huán)35次;72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切割目的條帶，送北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序成功后拼接序列，設(shè)計(jì)特異性引物sHSP22.0-ORF-F和sHSP22.0-ORF-R（表1），以棉鈴蟲(chóng)中腸cDNA為模板，擴(kuò)增其開(kāi)放閱讀框，PCR的反應(yīng)體系為25 μL： 1 μL cDNA， 0.5 μL sHSP22.0-ORF-F引物（10 mmo/L）和0.5 μL sHSP22.0-ORF-R引物（10 mmo/L），1 μL dNTPs，2.5 μL 10×EasyTaq Buffer，0.25 μL EasyTaq E，19.25 μL無(wú)菌水。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次;72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，如上述方法檢測(cè)并測(cè)序。

1.5 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

利用基因探索者軟件分析sHSP22.0基因，預(yù)測(cè)其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度，并對(duì)閱讀框進(jìn)行翻譯;利用在線(xiàn)軟件（https：∥web.expasy.org/compute pi/）和SWISS-MODEL分析該小分子熱激蛋白的相對(duì)分子量、等電點(diǎn)和結(jié)構(gòu)域;再在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTp 同源序列分析，選取同源性較高的不同昆蟲(chóng)的小分子熱激蛋白，利用MEGA 7（7014）軟件，選用Jones-Taylor-Thornton（JTT）模型，利用最大相似法（maximum likelihood method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.6 熒光定量RT-PCR分析

根據(jù)上述擴(kuò)增得到的棉鈴蟲(chóng)sHSP22.0的cDNA序列，送Invitrogen公司設(shè)計(jì)并合成Taqman探針sHSP22.0-RTPCR-P（5′端用FAM標(biāo)記，3′端用MGB標(biāo)記）及熒光定量RT-PCR的特異性引物sHSP22.0-RTPCR-F和sHSP22.0-RTPCR-R（表1）。熒光定量采用雙內(nèi)參法，內(nèi)參基因分別為棉鈴蟲(chóng)Actin基因（GenBank 登錄號(hào)：X97615.1） 和glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH基因）（GenBank 登錄號(hào) JF417983.1）。20 μL RT-PCR反應(yīng)體系包括正向和反向引物（10 μmol/L）各0.6 μL，探針（10 μmol/L）0.4 μL，MaximaR Probe/ROX qPCR Master Mix（2×）10 μL，cDNA2 μL和無(wú)菌水6.4 μL。于7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min;95℃變性3 s，60℃退火/延伸30 s，循環(huán)40次。qRT-PCR進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。數(shù)據(jù)分析使用相對(duì)定量分析方法，計(jì)算公式采用2-ΔΔCt法[31]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用DPS7.05軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，其中不同發(fā)育階段，不同組織，溫度或Cry1Ac全長(zhǎng)蛋白不同處理時(shí)間之間的方差分析采用單因素Tukey法，在P<0.05水平進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉鈴蟲(chóng)sHSP22.0基因序列及系統(tǒng)進(jìn)化位置

從棉鈴蟲(chóng)中腸組織cDNA中擴(kuò)增得到一條761 bp的基因序列，開(kāi)放閱讀框?yàn)?76 bp，編碼191個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)為XP_021196802.1。在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)其蛋白分子量為22.0 kDa，等電點(diǎn)為6.54。同時(shí)對(duì)該基因結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)分析表明它具有可變的N-末端區(qū)域（氨基酸殘基1—49），小分子熱激蛋白保守的α-晶狀體結(jié)構(gòu)域（氨基酸殘基 50—159），以及C-末端區(qū)域（氨基酸殘基160—191）（圖1），屬于典型的小分子熱激蛋白，我們將其命名為sHSP22.0。

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTp 同源序列分析，棉鈴蟲(chóng)sHSP22.0的氨基酸序列與其他18種昆蟲(chóng)的序列同源性較高，與小分子熱激蛋白具有類(lèi)似的α-晶狀體結(jié)構(gòu)域（圖2）。但是，棉鈴蟲(chóng)sHSP22.0與不同昆蟲(chóng)的sHSPs比較，N端差異顯著（圖2）;同時(shí)，sHSP22.0與不同分子量的熱激蛋白間C-端也存在較大差異（圖2）。通過(guò)比對(duì)分析，棉鈴蟲(chóng)sHSP22.0的氨基酸序列與斜紋夜蛾Spodoptera litura l（2）efl（protein lethal（2）essential for life-like，l（2）efl，同屬小分子的熱激蛋白家族基因）氨基酸序列同源性在90%以上;與其他被比較的鱗翅目夜蛾科昆蟲(chóng)的氨基酸同源性在70%以上（圖2）。

利用MEGA 7（7. 0.14）軟件，采用最大似然法進(jìn)一步分析了棉鈴蟲(chóng)sHSP 22.0基因的進(jìn)化關(guān)系，我們以白符跳Folsomia candida為外群，將棉鈴蟲(chóng)sHSP22.0氨基酸序列與18種昆蟲(chóng)的相近基因的氨基酸序列進(jìn)行了進(jìn)化樹(shù)分析（圖3）。結(jié)果表明，棉鈴蟲(chóng)sHSP22.0與鱗翅目昆蟲(chóng)的sHSP聚在了同一進(jìn)化支上，其中與已經(jīng)鑒定的斜紋夜蛾S.litura l（2）efl的進(jìn)化關(guān)系最近，其次是煙草天蛾M.sexta l（2）efl（圖3）。這與上述氨基酸序列同源性分析結(jié)果一致。

2.2 sHSP22.0在棉鈴蟲(chóng)不同發(fā)育期和組織中的表達(dá)

通過(guò)qRT-PCR分析，sHSP22.0的表達(dá)主要在幼蟲(chóng)4齡和5齡階段，在幼蟲(chóng)的低齡期、蛹和成蟲(chóng)中均未檢測(cè)到sHSP22.0的表達(dá)（圖4a）。進(jìn)一步分析sHSP22.0基因在棉鈴蟲(chóng)5齡幼蟲(chóng)各組織中表達(dá)的情況，發(fā)現(xiàn)該基因在中腸、后腸和表皮中均有表達(dá)，后腸中表達(dá)量最高，其次是表皮和中腸中，但是在前腸和馬氏管中沒(méi)有檢測(cè)到其表達(dá)（圖4b）。

2.3 sHSP22.0在棉鈴蟲(chóng)受高溫和Cry1Ac全長(zhǎng)蛋白誘導(dǎo)時(shí)的表達(dá)差異

40℃處理后，sHSP22.0基因的表達(dá)顯著上調(diào)，特別是在處理1 h時(shí)，表達(dá)量顯著上調(diào)6 240.28倍（F=365.16， P=0.000 1）（圖5a）。除此之外，sHSP22.0基因的表達(dá)還受到Cry1Ac全長(zhǎng)蛋白的誘導(dǎo)，棉鈴蟲(chóng)在取食Cry1Ac全長(zhǎng)蛋白后1 h和2 h，該基因均顯著上調(diào)表達(dá)（F=22.185，P=0.000 3），最高在1 h時(shí)表達(dá)量上調(diào)20.53倍（圖5b）。

3 討論

通過(guò)分析棉鈴蟲(chóng)熱激蛋白sHSP22.0的基因序列，發(fā)現(xiàn)其是典型的小分子熱激蛋白家族的基因，也具有α-晶狀體結(jié)構(gòu)域。小分子熱激蛋白的N端多變[3]，同源序列分析表明不同熱激蛋白分子間的N端差異也較大。本研究中棉鈴蟲(chóng)sHSP22.0與其他被比較的小分子量熱激蛋白間C-端也存在較大差異，這可能是由于被鑒定的小分子熱激蛋白數(shù)量有限，sHSP22.0與被比較的其他鱗翅目昆蟲(chóng)的sHSP之間在分子量上存在差異，也可能是由于小分子熱激蛋白的多樣性造成的[4]。盡管被比較的小分子熱激蛋白存在一定的差異，但是棉鈴蟲(chóng)sHSP22.0與其他鱗翅目昆蟲(chóng)的小分子熱激蛋白仍具有較高的同源性，并聚為一支。

在棉鈴蟲(chóng)1齡、2齡和3齡幼蟲(chóng)，蛹和成蟲(chóng)，以及在5齡期的馬氏管和前腸均沒(méi)有檢測(cè)到sHSP22.0基因的表達(dá)。這種小分子熱激蛋白基因在某些發(fā)育階段或組織中不表達(dá)的現(xiàn)象在小菜蛾中也有報(bào)道，其中sHSP18.8在小菜蛾幼蟲(chóng)3齡和4齡階段不表達(dá)，sHSP19.23和sHSP23.4在卵中不表達(dá)[32]。熱激蛋白在一些發(fā)育階段不表達(dá)可能預(yù)示著它們沒(méi)有參與這個(gè)階段的生理生化活動(dòng)。sHSP22.0基因在棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)4齡和5齡期特異性表達(dá)，這種小分子熱激蛋白在特定的幼蟲(chóng)期表達(dá)的現(xiàn)象在其他昆蟲(chóng)中也普遍存在。例如，地中海實(shí)蠅Ceratitis capitata的2個(gè)hsp23基因在幼蟲(chóng)階段高表達(dá)[33]。組織特異性分析發(fā)現(xiàn)sHSP22.0基因在5齡棉鈴蟲(chóng)中腸和后腸中特異性表達(dá)，這種組織特異性表達(dá)同樣也有報(bào)道，例如家蠶的sHSP20.4在中腸內(nèi)特異性高表達(dá)[17]，小菜蛾的4個(gè)小分子熱激蛋白基因sHSP19.5、sHSP20.1、sHSP21.6和sHSP21.8在腸道內(nèi)的表達(dá)高于其他組織[32]。基因的階段性或組織特異性表達(dá)往往預(yù)示著它可能參與到了該階段或組織中的生命活動(dòng)。棉鈴蟲(chóng)作為重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，主要危害階段是幼蟲(chóng)期，尤其4齡和5齡是棉鈴蟲(chóng)的暴食階段，也是棉鈴蟲(chóng)重要營(yíng)養(yǎng)階段。棉鈴蟲(chóng)sHSP22.0基因在這個(gè)階段的特異性表達(dá)，尤其在腸道內(nèi)的相對(duì)高表達(dá)，表明sHSP22.0基因在棉鈴蟲(chóng)消化吸收以及抵御外源物等活動(dòng)中可能起到重要的作用。sHSP22.0基因除了在腸道內(nèi)特異性表達(dá)外，還在棉鈴蟲(chóng)表皮中表達(dá)。小分子熱激蛋白在表皮中特異性表達(dá)的現(xiàn)象在小菜蛾中也有報(bào)道，Chen 等[32]在小菜蛾中鑒定到了5種小分子熱激蛋白在表皮中超表達(dá)。表皮是昆蟲(chóng)抵御外界侵入的重要保護(hù)屏障，sHSP22.0基因在表皮中的特異性表達(dá)，再次表明它可能參與昆蟲(chóng)抵御外源物過(guò)程。根據(jù)熱激蛋白的功能研究，推測(cè)它可能通過(guò)維持昆蟲(chóng)正常的器官功能或作為蛋白質(zhì)的重要分子伴侶保護(hù)蛋白質(zhì)的正常功能的方式抵御外界侵害[35]。

熱激蛋白分子受高溫誘導(dǎo)表達(dá)的反應(yīng)是昆蟲(chóng)適應(yīng)溫度變化的重要保護(hù)機(jī)制。熱激蛋白的表達(dá)受溫度的誘導(dǎo)，但是表達(dá)一般具有瞬時(shí)性，短則幾分鐘就可以檢測(cè)到昆蟲(chóng)體內(nèi)熱激蛋白表達(dá)量增加，長(zhǎng)則在1～2 h時(shí)積累量會(huì)達(dá)到高峰，隨后會(huì)顯著下降[36]。棉鈴蟲(chóng)熱激蛋白sHSP22.0具有熱激蛋白分子典型的小分子結(jié)構(gòu)[3738]，而且我們發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平在受溫度誘導(dǎo)1 h后顯著上調(diào)6 240.28倍。高溫可以誘導(dǎo)小分子熱激蛋白的表達(dá)，這種現(xiàn)象在其他昆蟲(chóng)中也較為常見(jiàn)，例如高溫可以顯著誘導(dǎo)小菜蛾12種小分子熱激蛋白基因表達(dá)[32]，腰腹長(zhǎng)體繭蜂Macrocentrus cingulum的Hsp23.8和柞蠶Antheraea pernyi的Hsp21經(jīng)熱激后也可迅速上調(diào)表達(dá)[3940]。自然界中，溫度在調(diào)控生物的生理生化過(guò)程中起著重要的作用，尤其對(duì)于昆蟲(chóng)這種變溫動(dòng)物。棉鈴蟲(chóng)熱激蛋白sHSP22.0快速顯著地響應(yīng)溫度的誘導(dǎo)，表明它在幫助棉鈴蟲(chóng)適應(yīng)不利條件，保護(hù)自身正常生理活動(dòng)中起到非常重要的作用。

本研究中棉鈴蟲(chóng)sHSP22.0也響應(yīng)Cry1Ac全長(zhǎng)蛋白的誘導(dǎo)，1 h時(shí)表達(dá)可上調(diào)20.53倍。據(jù)報(bào)道云杉夜蛾Choristoneura fumiferana取食亞致死劑量的Cry1Ab全長(zhǎng)蛋白后，HSP90的表達(dá)量顯著上調(diào)[41]。這表明棉鈴蟲(chóng)sHSP22.0在抵御Cry1Ac全長(zhǎng)蛋白的作用過(guò)程中可能起到重要的作用。然而，另有研究報(bào)道棉鈴蟲(chóng)取食Cry1Ac全長(zhǎng)蛋白后，HSP70的表達(dá)量降低[28]。這顯示小分子熱激蛋白與大分子熱激蛋白的功能可能存在差異，對(duì)于棉鈴蟲(chóng)sHSP220具體在棉鈴蟲(chóng)抵御高溫和Cry1Ac全長(zhǎng)蛋白中如何發(fā)揮功能還需要進(jìn)一步的深入研究。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）