改良芝加哥天藍(lán)染色法在甲真菌檢測(cè)中的應(yīng)用

張紹武 馮長(zhǎng)海

(1. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院檢驗(yàn)科, 沈陽(yáng) 110032; 2. 上海皓信生物科技有限公司， 上海 201109)

甲真菌病是皮膚科常見的疾病之一，多數(shù)甲真病患者病情頑固，易交叉感染和復(fù)發(fā)，需要長(zhǎng)期治療，因此明確診斷尤其重要。直接鏡檢法及培養(yǎng)法為臨床常用的真菌檢查方法，培養(yǎng)法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。鏡檢法主要有KOH濕片鏡檢和熒光鏡檢，KOH濕片鏡檢法因操作簡(jiǎn)單快捷、成本低廉，為實(shí)驗(yàn)室普遍采用，但該法陽(yáng)性率不高[1-2]。熒光染色法檢出率較高但需要熒光顯微鏡[3-4]。芝加哥天藍(lán)染色法檢測(cè)文獻(xiàn)報(bào)道不多[5]，本試驗(yàn)通過改良芝加哥天藍(lán)染色法(即芝加哥天藍(lán)甘油染色法)和芝加哥天藍(lán)染色法對(duì)疑似真菌感染的甲標(biāo)本檢測(cè)進(jìn)行評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 試劑

10% KOH(自制)，芝加哥天藍(lán)染色液(芝加哥天藍(lán)1 g，蒸餾水100 mL)，改良芝加哥天藍(lán)染色液(芝加哥天藍(lán)1 g，甘油20 mL，蒸餾水80 mL)。

1.2 儀器

OLYMPUS顯微鏡(日本，普通光源型號(hào)CX41FR)，Olympus EP50顯微成像系統(tǒng)(德國(guó))。

1.3 標(biāo)本

200例皮膚科門診疑似甲真菌病患者提供的患處甲屑。

1.4 方法

將疑似甲真菌病患者病甲屑用75%酒精消毒清洗后取適量甲屑置于一個(gè)0.6 mL的無(wú)菌離心管中，加10% KOH溶液致甲屑完全浸沒，靜置10 min備用。芝加哥天藍(lán)染色法和芝加哥天藍(lán)甘油染色法的操作為：上述10% KOH溶液處理過的甲屑溶解液振蕩搖勻后各取理過的甲屑溶解液5 μL依次置于2塊載玻片中央，上面分別加入5 μL芝加哥天藍(lán)染色液或芝加哥天藍(lán)甘油染色液，用加樣槍頭攪拌均勻后蓋上蓋玻片后鏡檢；鏡檢時(shí)間分別為蓋上蓋玻片后1 min、4 h、8 h、24 h、1周。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示,兩組之間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩種方法顯微鏡下比較

芝加哥天藍(lán)染色法可見菌絲顏色呈淡灰藍(lán)色，背景細(xì)胞呈較淡灰紫色(見圖1)，改良芝加哥天藍(lán)染色法可見菌絲呈較深藍(lán)色，背景細(xì)胞淡灰紫色，但雜質(zhì)較芝加哥天藍(lán)染色法少(見圖2)。兩種檢測(cè)方法靜置1 min和4 h時(shí)鏡檢均可檢測(cè)出真菌菌絲。靜置8 h觀察時(shí)芝加哥天藍(lán)染色法讀片結(jié)果因干擾物較多效果較差或因水分丟失無(wú)法讀片，但改良芝加哥天藍(lán)染色法仍可讀取靜置8 h、24 h和1周時(shí)的樣本檢測(cè)結(jié)果。

圖1 芝加哥天藍(lán)染色法靜置1 min(×400) 圖2 改良芝加哥天藍(lán)染色法靜置1 min(×400)

2.2 兩種方法陽(yáng)性率的比較

200例疑似患者中，改良芝加哥天藍(lán)染色法鏡檢陽(yáng)性145 例，檢出率 72.5%，芝加哥天藍(lán)法涂片鏡檢陽(yáng)性122例，檢出率 61.0%。改良芝加哥天藍(lán)染色法與芝加哥天藍(lán)染色法檢出率結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=21.043，P<0.05)。

3 討 論

甲真菌病是一個(gè)影響人類健康的公共問題，全球患病率高達(dá)5.5%,且發(fā)病率隨著易感人群的年齡增長(zhǎng)顯著升高,甲真菌病在所有甲病中約占50%。甲真菌KOH濕片法的陽(yáng)性率較低。真菌熒光染色法在熒光顯微鏡下可見到亮藍(lán)色菌體結(jié)構(gòu)，真菌形態(tài)比KOH濕片法更易識(shí)別[6-7],但真菌在寄生過程中可導(dǎo)致宿主細(xì)胞含有部分真菌細(xì)胞壁成分，干擾真菌的識(shí)別，同樣，熒光的淬滅作用及染液水份丟失也不利于陽(yáng)性標(biāo)本的保存。

芝加哥天藍(lán)是一種重氮染料，可將真菌菌體成分染成藍(lán)色，背景細(xì)胞染成淡紫色，易于將真菌菌體和背景細(xì)胞區(qū)分開來。不同國(guó)外文獻(xiàn)中使用的染液染出的藍(lán)色菌體細(xì)胞和紫色背景細(xì)胞顏色深淺程度不同[8-10]，提示芝加哥天藍(lán)染液的質(zhì)量對(duì)菌體和背景細(xì)胞染色效果會(huì)存在較大差異。本研究顯示，按文獻(xiàn)配方配制的芝加哥天藍(lán)染液處理甲真菌病患者標(biāo)本會(huì)出現(xiàn)真菌菌體藍(lán)色較淡、背景雜質(zhì)較多現(xiàn)象，且放置時(shí)間久會(huì)影響標(biāo)本讀片結(jié)果。

甘油作為保濕劑，可減慢標(biāo)本中染液干涸的速度，利于標(biāo)本的保存；同時(shí)作為促染劑，可增強(qiáng)作用底物的著色能力，易于區(qū)分真菌菌體成分和背景細(xì)胞。本研究中將芝加哥天藍(lán)染液加入甘油配制成的改良芝加哥天藍(lán)染液處理甲真菌病患者標(biāo)后，真菌菌體成分藍(lán)色更加明亮，背景細(xì)胞淡紫色更加透明，二者的色彩對(duì)比更加明顯，且背景干凈、雜質(zhì)較少，同時(shí)染色后標(biāo)本的保存時(shí)間也較芝加哥天藍(lán)法久，提示改良芝加哥天藍(lán)染色法染色效果優(yōu)于芝加哥天藍(lán)染色法。

改良芝加哥天藍(lán)染色法對(duì)甲真菌的診斷提供了一種不需特殊檢驗(yàn)設(shè)備、穩(wěn)定性更強(qiáng)、陽(yáng)性率更高、結(jié)果更易讀取的檢查方法，適合臨床推廣應(yīng)用。