NaCl 脅迫對轉(zhuǎn)BADH- 反義4CL 基因二色胡枝子盆栽苗的影響

解小娟

（山西省投資咨詢和發(fā)展規(guī)劃院，山西 太原 030009）

二色胡枝子（Lespedeza bicolor）是豆科胡枝子屬（Lespedeza）多年生落葉灌木，具有生物量大、枝葉營養(yǎng)豐富，耐旱、耐寒、耐瘠薄、萌蘗能力強(qiáng)等優(yōu)良特性，是荒坡綠化、礦山生態(tài)修復(fù)的先鋒樹種，同時(shí)也是優(yōu)良的木本飼料作物、園林觀賞植物和藥用植物。盡管二色胡枝子具有較多優(yōu)點(diǎn)，但仍然存在抗鹽堿能力差、木質(zhì)素含量高等缺點(diǎn)。目前，應(yīng)用基因工程技術(shù)提高植物的抗鹽堿能力、控制木質(zhì)素的合成已在多種植物中取得成功[1]。甜菜堿被認(rèn)為是最好的滲透調(diào)物質(zhì)，甜菜堿醛脫氫酶（BADH）是甜菜堿合成的關(guān)鍵酶之一，轉(zhuǎn)入BADH 的美麗胡枝子耐鹽能力提高[2-3]。4-香豆酸輔酶A 連接酶（4CL）是控制木質(zhì)素合成的關(guān)鍵性酶，可以利用不同底物來調(diào)控木質(zhì)素的合成，轉(zhuǎn)入反義4CL 基因的楊樹木質(zhì)素含量降低。本試驗(yàn)以轉(zhuǎn)入BADH、反義4CL 基因的二色胡枝子為材料，研究不同濃度的氯化鈉處理對其生理指標(biāo)的影響，以探討外源基因的導(dǎo)入對植物滲透調(diào)節(jié)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為同時(shí)煉苗出瓶的非轉(zhuǎn)基因二色胡枝子，以及分子檢測呈陽性的轉(zhuǎn)BADH-反義4CL 基因二色胡枝子的2 個(gè)株系（67號、85號）。

所有試驗(yàn)材料經(jīng)12個(gè)月盆栽，苗木高達(dá)80～90cm時(shí)進(jìn)行NaCl 脅迫。NaCl 處理濃度分別為0、0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L，每種材料處理8 盆，每盆澆灌處理液300mL，隔4d澆灌一次，共3 次，12d后每種材料每個(gè)梯度挑選生長一致的葉片進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)的測定。

1.2 試驗(yàn)方法

BADH 活性和甜菜堿含量的測定方法：BADH 活性測定參照羅曉麗等的方法。甜菜堿含量測定采用雷氏鹽紫外分光光度計(jì)法[4]。

相關(guān)生理指標(biāo)測定方法：細(xì)胞膜透性采用電導(dǎo)儀法[5]。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法[6]。脯氨酸含量測定采用的酸性茚三酮比色法。可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法[6]?？寡趸富钚缘臏y定根據(jù)李合生法[6]。

每種指標(biāo)重復(fù)測定3 次，試驗(yàn)結(jié)果用DPS 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對BADH 活性和甜菜堿含量的影響

為了進(jìn)一步分析外源基因（BADH）的功能，對轉(zhuǎn)基因二色胡枝子2 個(gè)陽性株系進(jìn)行不同梯度的鹽脅迫處理，同時(shí)以非轉(zhuǎn)基因二色胡枝子為對照，測定鹽脅迫條件下植株的BADH 活性和甜菜堿含量（見圖1、圖2）。結(jié)果表明：隨著鹽濃度的提高，BADH活性和甜菜堿含量都有所提高。無鹽脅迫時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系與對照植株BADH 活性和甜菜堿含量含量較低，且不存在顯著性差異；NaCl 濃度為2g/L 時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系67號BADH 活性和甜菜堿含量是對照植株的2.5 倍和1.61 倍，轉(zhuǎn)基因株系85號BADH 活性和甜菜堿含量是對照植株的3 倍和1.66 倍，且轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因植株存在顯著性差異。同時(shí)BADH 活性增加的幅度高于甜菜堿含量增加幅度。因而，鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因二色胡枝子具有較強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力，降低了鹽脅迫對葉片細(xì)胞造成的傷害，抗性增強(qiáng)。

圖1 不同NaCl 濃度下BADH 的活性變化

圖2 不同NaCl 濃度下甜菜堿含量的變化

2.2 鹽脅迫對細(xì)胞膜透性和丙二醛含量的影響

鹽脅迫對非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因二色胡枝子膜透性的影響如圖3所示，隨著鹽濃度的增加，非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因二色胡枝子相對電解質(zhì)滲透率（EL）呈上升趨勢。無鹽脅迫條件下，非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因二色胡枝子相對電解質(zhì)滲透率含量較低，且不存在顯著性差異；NaCl 濃度為0.5g/L 時(shí)，與無鹽脅迫時(shí)相比，非轉(zhuǎn)基因植株的EL 增加1.67 倍，轉(zhuǎn)基因株系67號和85號分別增加0.76 倍和1.08 倍，且轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因植株存在顯著性差異；NaCl 濃度為1.0g/L 和2.0g/L，轉(zhuǎn)基因株系的EL 增加的幅度均小于非轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果表明鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因二色胡枝子EL 比非轉(zhuǎn)基因植株低，說明轉(zhuǎn)基因植株膜結(jié)構(gòu)完整性較好，膜受到傷害較小，抗鹽性強(qiáng)，說明外源基因（BADH）導(dǎo)入提高了植株的抗鹽性。鹽脅迫對非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因二色胡枝子丙二醛（MDA）含量的影響如圖4所示，隨著鹽濃度的增加，非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因二色胡枝子MDA 含量與電導(dǎo)率趨勢的一致。無鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因植株MDA 含量較低，且不存在顯著差異；NaCl 濃度為0.5g/L 時(shí)，與無鹽脅迫時(shí)相比，非轉(zhuǎn)基因植株的MDA 含量增加45%，轉(zhuǎn)基因株系67號和85號分別增加13%和9%，且轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因植株存在顯著性差異；NaCl 濃度為1.0g/L和2.0g/L，轉(zhuǎn)基因株系的MDA 含量增加的幅度均小于非轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果表明鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因二色胡枝子MDA 含量比非轉(zhuǎn)基因植株低，說明轉(zhuǎn)基因植株膜脂過氧化程度較低，膜結(jié)構(gòu)傷害的程度較小，進(jìn)一步說明外源基因（BADH）導(dǎo)入提高了植株的抗鹽性。

圖3 不同NaCl 濃度下電導(dǎo)率的變化

圖4 不同NaCl 濃度下丙二醛的變化

2.3 鹽脅迫對脯氨酸含量的影響

鹽脅迫對非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因二色胡枝子脯氨酸（Pro）含量的影響如圖5所示，隨著鹽濃度的增加，非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因二色胡枝子Pro 含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。無鹽脅迫時(shí)，非轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因各株系間的脯氨酸含量較低，且不存在差異顯著；NaCl 濃度為0.5g/L 時(shí)，與無鹽脅迫時(shí)相比，非轉(zhuǎn)基因植株的Pro含量增加0.48 倍，轉(zhuǎn)基因株系67號和85號分別增加2.97 倍和2.47 倍，且轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因植株存在顯著性差異；NaCl 濃度為1.0g/L 時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系的Pro 含量增加的幅度仍大于非轉(zhuǎn)基因植株；非NaCl 濃度為2.0g/L 時(shí)，脯氨酸含量下降，但轉(zhuǎn)基因株系的Pro 含量仍高于非轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果表明，鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因二色胡枝子的Pro 含量高于非轉(zhuǎn)基因植株，說明鹽脅迫下轉(zhuǎn)BADH 二色胡枝子滲透調(diào)節(jié)能力較強(qiáng)。

圖5 不同NaCl 濃度下脯氨酸含量的變化

2.4 鹽脅迫對可溶性蛋白含量的影響

鹽脅迫對非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因二色胡枝子可溶性蛋白含量的影響如圖6所示，隨著鹽濃度的增加，非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因二色胡枝子可溶性蛋白含量呈現(xiàn)下降的趨勢。無鹽脅迫時(shí)，非轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因各株系間的可溶性蛋白含量較高，且不存在差異顯著；NaCl 濃度為0.5g/L 時(shí)，與無鹽脅迫時(shí)相比，非轉(zhuǎn)基因植株的可溶性蛋白含量降低了30.4%，轉(zhuǎn)基因株系67號和85號分別降低了17.9%和14.4%，且轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因植株存在顯著性差異；NaCl 濃度為1.0g/L 和2.0g/L 時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系可溶性蛋白的含量降低的幅度仍小于非轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果表明，鹽脅迫條件轉(zhuǎn)BADH 二色胡枝子可溶性蛋白含量高于非轉(zhuǎn)基因植株，說明在鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因二色胡枝子比非轉(zhuǎn)基因植株蛋白質(zhì)分解速度慢、抗性強(qiáng)。

圖6 不同NaCl 濃度下可溶性蛋白的變化

2.5 鹽脅迫對抗氧化酶活性的影響

鹽脅迫對非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因二色胡枝子過氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性的影響如圖7～圖9 所示，隨著鹽濃度的增加，非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因二色胡枝子SOd活性呈現(xiàn)上升的趨勢，POD、CAT 活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。無鹽脅迫時(shí)，非轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因株系的SOD、POD、CAT 活性較低，且不存在顯著性差異；NaCl 濃度為0.5g/L 時(shí)，非轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因株系的SOd活性增強(qiáng)幅度較小，67號與非轉(zhuǎn)基因植株不存在顯著性差異，85號與非轉(zhuǎn)基因植株存在顯著差異，非轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因株系的POd活性也增強(qiáng)幅度較小，且轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因植株不存在顯著性差異，而非轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因株系的CAT 活性也增強(qiáng)幅度較大，轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因株系存在顯著性差異；NaCl 濃度為1.0g/L 時(shí)，與非轉(zhuǎn)基因植株相比，非轉(zhuǎn)基因植株的SOd活性增強(qiáng)0.56 倍，轉(zhuǎn)基因株系67號和85號分別增強(qiáng)0.99 倍和0.83 倍，非轉(zhuǎn)基因植株的POd活性增強(qiáng)0.89 倍，轉(zhuǎn)基因株系67號和85號分別增強(qiáng)2.21倍和2.06 倍，非轉(zhuǎn)基因植株的CAT 活性增強(qiáng)1.35 倍，轉(zhuǎn)基因株系67號和85號分別增強(qiáng)1.61 倍和1.74 倍；NaCl 濃度為2.0g/L時(shí)，非轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因株系的SOd活性仍呈增強(qiáng)趨勢，且轉(zhuǎn)基因株系SOd活性增加的幅度大于非轉(zhuǎn)基因植株，而非轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因株系的POd和CAT 活性卻降低，但轉(zhuǎn)基因株系的POd和CAT 活性仍高于非轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果表明，鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)BADH 基因二色胡枝子的抗氧化酶活性高于非轉(zhuǎn)基因植株，說明鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因二色胡枝子抗氧化酶活性維持在較高水平，其抗性較強(qiáng)。

圖7 不同NaCl 濃度下SOd活性的變化

圖8 不同NaCl 濃度下POd活性的變化

圖9 不同NaCl 濃度下CAT 活性的變化

3 討論

甜菜堿作為一種非毒性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物受到環(huán)境脅迫時(shí)在細(xì)胞內(nèi)積累并降低滲透勢，還能作為一種保護(hù)物質(zhì)具有極為重要的“非滲透調(diào)節(jié)”功能，維持生物大分子的結(jié)構(gòu)和完整性，維持其正常的生理功能，解除高濃度鹽對酶活性的毒害和保護(hù)呼吸酶及能量代謝的過程[7]。大量研究結(jié)果表明，本試驗(yàn)采用NaCl 對轉(zhuǎn)基因二色胡子BADH 基因進(jìn)行誘導(dǎo)。Ishitani 等在300mmol·L-1NaCl 脅迫條件下的大麥葉片中，BADH 的mRNA 含量比對照增加了8 倍，在無鹽條件下，BADHmRNA 的量就恢復(fù)到接近正常的狀態(tài)。McCue 等發(fā)現(xiàn)當(dāng)NaCl 的濃度從零逐漸增加到500mmol·L-1時(shí)，菠菜葉片中的BADH 的mRNA 含量增加3～4倍。本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這點(diǎn)，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因二色胡枝子BADH 表達(dá)明顯增加，NaCl 濃度為2%時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系67號BADH 活性和甜菜堿含量是對照植株的2.5 倍和1.61 倍，轉(zhuǎn)基因株系85號BADH 活性和甜菜堿含量是對照植株的3 倍和1.66倍，這與其他鹽脅迫條件下誘導(dǎo)BADH 基因表達(dá)的相關(guān)報(bào)道一致[8]。上述研究結(jié)果表明，甜菜堿含量的積累與鹽脅迫誘導(dǎo)密切相關(guān)，甜菜堿在合成的過程中相關(guān)基因的表達(dá)可能受鹽濃度調(diào)控；此外不同株系間BADH 活性和甜菜堿含量也存在一定差異，可能與外源BADH 基因插入的位點(diǎn)及甲基化程度有關(guān)。

植物受到鹽脅迫情況下，將發(fā)生離子區(qū)域化作用，即植物細(xì)胞將吸收的大量鹽離子貯存于液泡從而降低細(xì)胞質(zhì)中的鹽濃度，減少鹽離子對細(xì)胞的毒害，但隨著液泡和細(xì)胞質(zhì)之間的滲透勢差增大，最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)失水，造成機(jī)械損傷；同時(shí)植物在抗逆脅迫下細(xì)胞內(nèi)自由基如羥自由基、超氧自由基、單線態(tài)氧等會(huì)引發(fā)膜脂過氧化，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷，膜透性增加，使細(xì)胞內(nèi)的大量的無機(jī)離子和氨基酸、可溶性糖等小分子外滲[9]。本試驗(yàn)證明，轉(zhuǎn)BADH-反義4CL 基因二色胡枝子在鹽脅迫下膜結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，膜透性變化較小，MDA 積累較少，膜脂過氧化程度較低，受到的傷害較小，因而抗鹽性較強(qiáng)。

脯氨酸是一種很好的相容性溶質(zhì)，作為滲透調(diào)節(jié)劑和滲透保護(hù)劑的效應(yīng)十分廣泛和顯著，不僅起著降低細(xì)胞內(nèi)水勢的作用，而且能有效地保護(hù)和穩(wěn)定各種酶系以及復(fù)合體四級蛋白的四級結(jié)構(gòu)，并能維持細(xì)胞膜系統(tǒng)在逆境中的穩(wěn)定性，充當(dāng)活性氧的清除劑，降低膜脂過氧化等。在正常環(huán)境中脯氨酸含量較低，只有在鹽脅迫等逆境條件下脯氨酸的合成反應(yīng)才被激活。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因二色胡枝子葉片中脯氨酸含量顯著高于對照，這與耐鹽程度的高低與脯氨酸含量呈正相關(guān)的報(bào)道相一致。但有些研究卻表明，脯氨酸的積累與耐鹽程度成負(fù)相關(guān)[10]。也有些人則認(rèn)為脯氨酸的積累是傷害的結(jié)果，不能作為抗性篩選的指標(biāo)，更適宜作為一個(gè)脅迫傷害指標(biāo)[11]。

植物在逆境脅迫條件下，可溶性蛋白分解速度加快，合成減少，因而蛋白質(zhì)含量下降，氨基酸含量增多。劉世琦曾報(bào)道植物可溶性蛋白中50%以上是酶蛋白，其含量的高低可間接反映代謝活動(dòng)的強(qiáng)弱[12]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，在鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株可溶性蛋白的含量高于非轉(zhuǎn)基因植株，間接說明轉(zhuǎn)基因植株代謝活動(dòng)比非轉(zhuǎn)基因植株強(qiáng)。

CAT、POd和SOd均為植物內(nèi)源的自由基清除劑，屬于保護(hù)酶系統(tǒng)。植物在正常條件下，自由基水平較低不會(huì)引起傷害，此時(shí)自由基的產(chǎn)生與清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡之中，但在高鹽濃度脅迫條件下，這種動(dòng)態(tài)平衡受到破壞，自由基產(chǎn)生積累，膜脂過氧化。因此，鹽脅迫下只有保護(hù)酶活性增強(qiáng)或維持較高水平，才能清除活性氧自由基使其保持較低水平，防止生物膜的破壞，從而保持一定的耐鹽性。本研究結(jié)果表明，鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因株系CAT、POd和SOd活性均高于非轉(zhuǎn)基因植株，但鹽濃度增加到2.0%時(shí)，保護(hù)酶的活性有所下降，這可能與高鹽濃度下植物的保護(hù)酶系統(tǒng)受到破壞有關(guān)。