轉(zhuǎn)Cry1Ia基因抗蟲大豆對(duì)鱗翅目靶標(biāo)害蟲的抗性分析

單大鵬，王曉云，洪志鵬，王子葉，馮廣慧，孟凡立

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

大豆因富含蛋白質(zhì)和油脂等營(yíng)養(yǎng)成分，在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用于食品加工、動(dòng)物飼料及工業(yè)原料等行業(yè)[1]。近年來，隨著人們對(duì)生活品質(zhì)和保健等方面意識(shí)增強(qiáng)，大豆市場(chǎng)需求逐漸增加。然而，我國(guó)自產(chǎn)大豆無法滿足生產(chǎn)生活需求，仍需大量進(jìn)口。提高大豆產(chǎn)量、減少大豆因蟲害、病害帶來的經(jīng)濟(jì)損失已成為世界關(guān)注熱點(diǎn)。

鱗翅目害蟲引起玉米、大豆、油菜、棉花等作物減產(chǎn)，對(duì)我國(guó)乃至全球農(nóng)業(yè)發(fā)展造成巨大損失[2]。蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生由cry和cyt基因編碼的殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs）[3]，其對(duì)鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、半翅目、直翅目、膜翅目害蟲具有特異活性[4]。2010~2012年，巴西和阿根廷先后開始商業(yè)化種植Bt大豆。2017年巴西研發(fā)一個(gè)表達(dá)Cry1Ac、Cry1F和膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT）蛋白的Bt大豆品種DAS814192（ConkestaTM技術(shù)），該品種對(duì)鱗翅目昆蟲具有較高抗性[5]。過表達(dá)Cry1A蛋白轉(zhuǎn)基因大豆顯著降低鱗翅目昆蟲種群密度，尤其是大豆夜蛾、大豆尺蠖夜蛾和長(zhǎng)須夜蛾[6]。Bernardi等發(fā)現(xiàn)Bt大豆（表達(dá)Cry1Ac蛋白的MON 87701×MON 87788）在實(shí)驗(yàn)室對(duì)鱗翅目昆蟲大豆尺蠖夜蛾（夜蛾科）和大豆夜蛾（鱗翅目：直立目）具有抗性[7]。

Ruizde Escudero等研究已表明，Cry1Ia39蛋白對(duì)紅腹溞幼蟲毒性作用不顯著，但產(chǎn)生一定體重抑制作用[8]。Quemada等將Cry1Ia基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯中，成功減弱馬鈴薯麥蛾危害[9]。Silva等將Cry1Ia基因轉(zhuǎn)入棉花，提高轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)鱗翅目害蟲棉鈴蟲和黏蟲抗性，且產(chǎn)生與受體植株同樣表型花和種子[10]。Boncheva等在生物測(cè)定中發(fā)現(xiàn)蘋果蠹蛾對(duì)Cry1Ia1敏感性[11]。Cry1Ia7、Cry1Ia10、Cry1Ia12和Cry1Ia13對(duì)草地貪夜蛾有毒性[12]。因此，開發(fā)具有Cry1Ia蛋白轉(zhuǎn)基因植物對(duì)控制鱗翅目害蟲具有重要應(yīng)用前景。本研究對(duì)轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆株系KE1分析鱗翅目害蟲抗性，為培育抗鱗翅目靶標(biāo)害蟲大豆新品系提供基礎(chǔ)性材料。

1 材料與方法

1.1 供試植物材料

轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆，轉(zhuǎn)基因大豆KE1表達(dá)Cry1Ia抗蟲蛋白，同時(shí)以Bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，供試用轉(zhuǎn)基因大豆材料由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。非轉(zhuǎn)基因親本對(duì)照種子墾農(nóng)18由黑龍江省八一農(nóng)墾大學(xué)朱洪德教授提供。

1.2 供試?yán)ハx

本試驗(yàn)中室內(nèi)和大田所用昆蟲為大豆靶標(biāo)害蟲。黏蟲卵、斜紋夜蛾卵、甜菜夜蛾卵從河南省濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司購(gòu)買并在實(shí)驗(yàn)室孵化為一齡幼蟲；大豆食心蟲幼蟲2019年8月15日采集于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)。

1.3 轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1遺傳穩(wěn)定性分析

1.3.1 植物基因組DNA提取

將轉(zhuǎn)基因株系KE1的T3~T5代種子同時(shí)在溫室中種植，選取長(zhǎng)勢(shì)較好再生植株幼嫩葉片，選用康為世紀(jì)生物科技有限公司DNA提取試劑盒提取葉片總DNA，用于PCR檢測(cè)陽性植株。

1.3.2 利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物

利用Primer 5.0設(shè)計(jì)目的基因Cry1Ia引物序列如下，Cry1Ia-F：GGCATCTGTGACTTGTCTAGAA TTCGG，Cry1Ia-R：TCAAGGAGACTTGTACCATC CCCATG，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為200 bp。利用Primer 5.0設(shè)計(jì)篩選標(biāo)記基因Bar引物序列如下，Bar-F：GCGGTACCGGCAGGCTGAAG，Bar-R：CCGCAGG AACCGCAGGAGTG，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為238 bp。

1.3.3 轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1的PCR檢測(cè)

提取大豆葉片總DNA后，分別用Cry1Ia和Bar基因特異引物在Eppendorf PCR儀上擴(kuò)增。模板為植物基因組總DNA，陽性對(duì)照為pCAMBIA3301-Cry1Ia質(zhì)粒，陰性對(duì)照為未轉(zhuǎn)入Cry1Ia基因植株DNA。以ddH2O為空白對(duì)照。兩個(gè)基因擴(kuò)增反應(yīng)體系相同。反應(yīng)體系如下，Cry1Ia基因PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；35個(gè)循環(huán)；94℃變性30 min，50℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃終延伸10 min；4℃終止反應(yīng)。Bar基因PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；35個(gè)循環(huán)；94℃變性30 min，58℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃終延伸10 min；4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物檢測(cè)：取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，加1μL 6×loading Buffer混勻，2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外分析儀觀察并拍照。

1.3.4 轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1的Western blot檢測(cè)

從田間選取轉(zhuǎn)基因陽性植物和對(duì)照植株新鮮未成熟葉片、花、籽粒和莢皮組織，提取總蛋白。12%SDS-PAGE上分離轉(zhuǎn)基因植株總蛋白（約40μg）。分離后蛋白使用轉(zhuǎn)膜設(shè)備轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF膜）上。然后利用脫脂牛奶對(duì)PVDF膜上的非特異性位點(diǎn)作封閉。一抗為鼠抗Cry1Ia蛋白抗血清，稀釋濃度為1∶100；另一個(gè)為鼠抗Bar-PAT蛋白單克隆抗體，稀釋濃度為1∶10 000。二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠抗體，稀釋濃度隨一抗的稀釋濃度成倍遞增或遞減。經(jīng)蛋白雜交和洗膜后，使用化學(xué)發(fā)光蛋白質(zhì)印跡試劑盒中A、B液（1∶1）在膜上直接顯色，1 min后利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)照相。

1.3.5 轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1的ELISA檢測(cè)

在大豆生長(zhǎng)結(jié)莢期，從田間采集轉(zhuǎn)基因陽性植株和對(duì)照植株新鮮葉片、花、子粒和莢皮部位組織，用錫紙包裹后立即放入液氮，用研缽將樣品充分研磨，離心并適當(dāng)稀釋上清液后，按照廠商說明書作雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA法），分析外源蛋白Cry1Ia和Bar在轉(zhuǎn)基因陽性植株不同組織中表達(dá)水平。通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中Cry1Ia和Bar蛋白濃度。

1.4 甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、黏蟲室內(nèi)抗蟲性鑒定

當(dāng)室內(nèi)種植轉(zhuǎn)基因材料KE1的T3和T4代以及受體材料墾農(nóng)18第4個(gè)三出復(fù)葉完全展開時(shí)，取大豆植株頂部展開第3個(gè)三出復(fù)葉置于培養(yǎng)皿濕濾紙上，葉柄一端用濕棉花包裹，外包封口膜防止葉片失水，每個(gè)材料重復(fù)測(cè)定4次。幼蟲培養(yǎng)方式、光照周期等處理參考徐曉麗等[13]。在接蟲后3 d利用葉面積儀測(cè)定幼蟲取食大豆品種葉面積，計(jì)算葉面積損失率，同時(shí)記錄幼蟲死亡率和體重。取食3 d時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)基因材料KE1和受體品種葉面積損失率和抗性作分級(jí)，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 葉片損害鑒定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table1 Classification criteria for bladedamageidentification

食用轉(zhuǎn)基因品種KE1和墾農(nóng)18幼蟲平均校正死亡率、平均體重抑制百分率計(jì)算參考文獻(xiàn)[14]。采用方差分析法比較轉(zhuǎn)基因抗蟲大豆品種KE1和對(duì)應(yīng)非轉(zhuǎn)基因大豆品種墾農(nóng)18幼蟲平均校正死亡率和平均體重抑制百分率差異。

1.5 大豆食心蟲田間抗蟲性鑒定

2019年5 月上旬將KE1 T3代和T4代轉(zhuǎn)基因材料和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧蠅ㄞr(nóng)18播種于抗蟲網(wǎng)室內(nèi)。大豆食心蟲田間抗蟲性鑒定方法和單株蟲食率計(jì)算參考錢雪艷等方法[15]。

表2 大豆食心蟲田間抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)Table2 L.glycinivorella Matsumura resistancein thefield evaluation criteria

1.6 數(shù)據(jù)整理與分析

運(yùn)用Microsoft Excel 2016和SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1遺傳穩(wěn)定性分析

2.1.1 轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1的PCR檢測(cè)

分別利用Cry1Ia和Bar基因引物對(duì)轉(zhuǎn)基因株系KE1的T3~T5代植株作PCR檢測(cè)，在轉(zhuǎn)基因株系KE1的T3~T5代植株中均檢測(cè)到200 bpCry1Ia目的條帶和238 bpBar目的條帶（見圖1），表明轉(zhuǎn)基因株系KE1中目的基因Cry1Ia和篩選基因Bar在T3~T5代中連續(xù)穩(wěn)定遺傳。

2.1.2 轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1的Western blot檢測(cè)

為分析轉(zhuǎn)錄的Cry1Ia和Bar是否翻譯成蛋白質(zhì)以及在葉片、花、未成熟籽粒和莢皮等不同組織中蛋白質(zhì)表達(dá)是否存在差異，利用武漢上成公司制備的Cry1Ia和Bar蛋白多克隆抗體對(duì)T4代開花結(jié)莢期根、莖、葉、花和莢皮不同組織中目的基因及標(biāo)記基因表達(dá)蛋白作Western blot雜交分析。Western blot雜交表明，外源蛋白Cry1Ia在轉(zhuǎn)基因大豆中獲得表達(dá)，Cry1Ia蛋白約為81.05 ku，與預(yù)期一致。在KE1的T4代根、莖、葉片和莢皮中均檢測(cè)到81 ku蛋白條帶，與預(yù)期Cry1Ia蛋白一致，而受體墾農(nóng)18未檢測(cè)到81 ku蛋白條帶（見圖2），說明整合到墾農(nóng)18大豆基因組上的Cry1Ia在根、莖、葉片和莢皮中均翻譯成蛋白。

圖1 轉(zhuǎn)基因大豆PCR檢測(cè)Fig.1 PCR detection of genetically modified soybeans

圖2 轉(zhuǎn)基因大豆Cry1Ia蛋白Western blot檢測(cè)Fig.2 Detection of Cry1Ia protein in transgenic soybean by Western blot

Western blot雜交表明，外源蛋白Bar在轉(zhuǎn)基因大豆中獲得表達(dá)，Bar蛋白約為21 ku，與預(yù)期一致。在KE1的T4代根、莖、葉片、花、莢皮中均檢測(cè)到21 ku蛋白條帶，與預(yù)期Bar蛋白一致，而受體墾農(nóng)18未檢測(cè)到21 ku蛋白條帶（見圖3），說明整合到墾農(nóng)18大豆基因組上的Bar在根、莖、葉片、花、莢皮中均翻譯成蛋白。

圖3 轉(zhuǎn)基因大豆Bar蛋白Western blot檢測(cè)Fig.3 Detection of Bar protein in transgenic soybean by Western blot

2.1.3 轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1的ELISA檢測(cè)

利用ELISA試劑盒對(duì)轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1中Cry1Ia蛋白定量分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.2416x+0.2437（R2=0.9958）。結(jié)果表明，Cry1Ia蛋白在轉(zhuǎn)基因大豆KE1生長(zhǎng)不同時(shí)期及不同組織部位均表達(dá)（見表3）。T3代Cry1Ia蛋白在苗期（V3）根、莖和葉片中表達(dá)含量分別為0.105±0.000、1.350±0.001和1.967±0.067μg·g-1。Cry1Ia蛋白在開花結(jié)莢期（R2）根、莖、葉片、花和莢皮中分別為0.242±0.008、0.873±0.052和0.632±0.035、0.221±0.040和0.157±0.020μg·g-1。在鼓粒期（R6）根、莖、葉片和籽粒中分別為0.081±0.024、1.240±0.195、2.630±0.089和2.020±0.031μg·g-1。在成熟期（R8）根、莖、葉片和籽粒中分別為0.146±0.024、2.287±0.189、5.308±0.280和6.020±0.634μg·g-1。分析T3和T4連續(xù)2代4個(gè)時(shí)期不同組織中Cry1Ia蛋白含量，結(jié)果表明Cry1Ia蛋白在轉(zhuǎn)基因大豆器官樣品中均可檢測(cè)到，不同器官中目的蛋白含量具有一定變化，總體說，大豆籽粒Cry1Ia蛋白含量相對(duì)最高，根中含量相對(duì)較低。

表3 Cry1Ia蛋白在轉(zhuǎn)基因株系KE1 T 3~T 4代4個(gè)時(shí)期不同組織表達(dá)量分析Table3 Analysis of Cry1Ia protein expression in different tissuesof transgenic line KE1 T 3-T 4 in four periods

利用ELISA分析標(biāo)記蛋白Bar（PAT）表達(dá)水平表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.1888x+0.033（R2=0.9947）。Bar在轉(zhuǎn)基因大豆KE1生長(zhǎng)不同時(shí)期及不同組織部位均表達(dá)（見表4）。T3代Bar蛋白在苗期（V3）根、莖和葉片中表達(dá)含量分別為0.537±0.001、0.698±0.035和0.882±0.045μg·g-1。Bar蛋白在開花結(jié)莢期（R2）根、莖、葉片、花和莢皮中分別為2.350±0.021、2.690±0.032、2.970±0.102、1.120±0.078和3.153±0.315μg·g-1。在鼓粒期（R6）根、莖、葉片和籽粒中別為1.450±0.001、2.530±0.002、2.460±0.005和3.470±0.003μg·g-1。在成熟期（R8）根、莖、葉片、花和籽粒中分別為3.450±0.357、4.950±0.561、4.490±0.256、4.050±0.376和4.160±0.236μg·g-1。分析T3和T4連續(xù)2代4個(gè)時(shí)期不同組織中Bar蛋白含量，結(jié)果表明Bar蛋白在轉(zhuǎn)基因大豆器官樣品中均可檢測(cè)到，不同器官中目的蛋白含量有一定時(shí)空變化。

表4 Bar蛋白在轉(zhuǎn)基因株系KE1 T 3~T4代4個(gè)時(shí)期不同組織表達(dá)量分析Table 4 Analysis of Bar protein expression in different tissues of T 3-T 4 generation of transgenic line KE1 in four periods

2.2 甜菜夜蛾抗性分析

本試驗(yàn)利用KE1 T5代陽性植株R1期離體葉片與受體墾農(nóng)18葉片分別喂食一齡甜菜夜蛾幼蟲，作甜菜夜蛾室內(nèi)生測(cè)，鑒定結(jié)果表明，甜菜夜蛾一齡幼蟲取食KE1葉片3 d后，T5代轉(zhuǎn)基因大豆KE1葉片損失率為9.76%±2.49%，表現(xiàn)為高抗性，而對(duì)照葉片損失率為81.29%±12.54%，表現(xiàn)為感性（見圖4）。KE1 T5代校正死亡率為85.57%±8.08%。同時(shí)KE1 T5代平均體重抑制百分率為26.21%±7.74%。因此，轉(zhuǎn)基因大豆KE1葉片對(duì)甜菜夜蛾幼蟲抗性顯著高于受體墾農(nóng)18，對(duì)甜菜夜蛾幼蟲表現(xiàn)較高抗性。

2.3 斜紋夜蛾抗性分析

本試驗(yàn)利用KE1 T5代陽性植株R1期離體葉片與受體墾農(nóng)18葉片分別喂食一齡斜紋夜蛾幼蟲，作斜紋夜蛾室內(nèi)生測(cè)，鑒定結(jié)果表明，斜紋夜蛾一齡幼蟲取食KE1葉片3 d后，T5代轉(zhuǎn)基因大豆KE1葉片損失率分別為6.11%±4.56%，表現(xiàn)為高抗性，而對(duì)照葉片損失率為85.12%±14.08%，表現(xiàn)為感性（見圖5）。KE1 T5代校正死亡率為83.78%±12.18%。同時(shí)KE1 T5代平均體重抑制百分率為57.15%±19.51%。因此，轉(zhuǎn)基因大豆KE1葉片對(duì)斜紋夜蛾幼蟲表現(xiàn)較高抗性。

2.4 黏蟲抗性分析

本試驗(yàn)室利用KE1 T5代陽性植株R1期離體葉片與受體墾農(nóng)18葉片分別喂食一齡黏蟲，作黏蟲室內(nèi)生測(cè)，鑒定結(jié)果表明，黏蟲幼蟲取食KE1葉片3 d后，T5代轉(zhuǎn)基因大豆KE1葉片損失率為6.48%±3.49%，表現(xiàn)高抗性，而對(duì)照葉片損失率為74.08%±11.08%，表現(xiàn)為感性（見圖6）。KE1 T5代校正死亡率為80.51%±8.99%。同時(shí)KE1 T5代平均體重抑制百分率為35.73%±16.27%。因此，轉(zhuǎn)基因大豆KE1葉片對(duì)黏蟲幼蟲表現(xiàn)較高抗性。

2.5 大豆食心蟲田間抗性分析

在抗蟲網(wǎng)室內(nèi)種植KE1 T2~T3代陽性植株和受體墾農(nóng)18，8月初放入大豆食心蟲成蟲，轉(zhuǎn)基因陽性植株成熟后，分析KE1株系和受體墾農(nóng)18抗蟲性狀，鑒定表明，KE1蟲食率為0.3%~2.7%，顯著低于對(duì)照受體品種（21.6%~35.6%）。表明KE1對(duì)大豆食心蟲抗性表現(xiàn)為高抗，且抗蟲水平顯著高于受體品種（見表5）。連續(xù)兩代抗蟲性鑒定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因大豆KE1對(duì)大豆食心蟲田間抗性穩(wěn)定遺傳。

圖4 甜菜夜蛾幼蟲取食T 5代轉(zhuǎn)基因大豆KE1和墾農(nóng)18葉片情況Fig.4 Feeding statusof S.exigua larvae on theleaves of T 5 generation of transgenic line KE1 and Kennong 18

圖5 斜紋夜蛾幼蟲取食T 5代轉(zhuǎn)基因大豆KE1和墾農(nóng)18葉片情況Fig.5 Feeding status of S.litura larvae on theleaves of T 5 generation of transgenic line KE1 and Kennong 18

圖6 黏蟲幼蟲取食T 5代轉(zhuǎn)基因大豆KE1和墾農(nóng)18葉片情況Fig.6 Feeding status of Mythimna separata W.larvaeon the leaves of T 5 generation of transgenic line KE1 and Kennong 18

表5 轉(zhuǎn)基因大豆KE1田間大豆食心蟲抗性分析Table 5 Analysis of L.glycinivorella Matsumura resistance in the field

3 討論與結(jié)論

隨著基因工程技術(shù)進(jìn)步，轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種類和耕種面積迅速增長(zhǎng)，研究轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物安全性至關(guān)重要。轉(zhuǎn)基因作物安全性評(píng)價(jià)主要分為食品安全性和環(huán)境安全性兩個(gè)層次[16]。轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全性評(píng)價(jià)主要包括對(duì)靶標(biāo)害蟲和非靶標(biāo)害蟲的影響，其中對(duì)靶標(biāo)害蟲的影響是環(huán)境安全評(píng)價(jià)主要內(nèi)容。

本研究對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆KE1作ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆在生長(zhǎng)不同時(shí)期及不同組織部位均表達(dá)，且不同器官中目的蛋白含量存在一定時(shí)空變化，與邵宇鵬等研究結(jié)果一致[17]。本文選取東北地區(qū)常見鱗翅目靶標(biāo)害蟲檢測(cè)生物活性，分別統(tǒng)計(jì)葉面積損失率、平均體重抑制百分率和蟲食率等重要參數(shù)，試驗(yàn)方法與宋苗等采用方法一致[18]。

本研究所用轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1株系中目的基因Cry1Ia和標(biāo)記基因Bar在T3~T5代中連續(xù)三代穩(wěn)定遺傳。Cry1Ia基因在葉片、花、未成熟籽粒和莢皮中均翻譯成相應(yīng)蛋白。大豆籽粒Cry1Ia蛋白含量相對(duì)最高，根中含量相對(duì)較低。選用T5代轉(zhuǎn)基因與對(duì)照植株墾農(nóng)18葉片分析鱗翅目害蟲幼蟲抗性，證明轉(zhuǎn)基因大豆KE1供試鱗翅目害蟲幼蟲具有較高抗性。因此，轉(zhuǎn)基因KE1株系顯著提高受體大豆墾農(nóng)18對(duì)鱗翅目靶標(biāo)害蟲抗性，可用于培育抗鱗翅目靶標(biāo)害蟲大豆新品系。后續(xù)試驗(yàn)可通過對(duì)非靶標(biāo)昆蟲的安全性評(píng)價(jià)，通過生物素標(biāo)記結(jié)合方法以及Ligand blot配給雜交方法，探究靶標(biāo)昆蟲中腸BBMV蛋白是否存在Cry1Ia蛋白特異性受體，為解釋轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆殺蟲機(jī)制奠定基礎(chǔ)。