UPLC-MS/MS法測定包裝材料中5種二氨基甲苯的遷移量

李靜，張居舟，劉毅，余曉娟

安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院 安徽國家農(nóng)副加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（合肥 230051）

隨著歐盟綠色包裝法規(guī)的實(shí)施，食品包裝材料中初級芳香胺（PAAs）檢測方法的研究日益受到人們的關(guān)注。二氨基甲苯類便是禁用PAAs中的一類物質(zhì)，它包括5種同分異構(gòu)體，其中2, 4-二氨基甲苯的毒性最大，它對皮膚、黏膜、呼吸道具有刺激性，為致癌物、致突變物[1]，已被歐盟法規(guī)REACH列入SVHC清單。2, 4-二氨基甲苯是由食品包裝材料中殘留的未鍵合的膠黏劑甲苯二異氰酸酯水解產(chǎn)生的[2]，它易溶于水、乙醇，極易遷移到食品中，危害人體健康。因此，歐盟（EU）2016/1416[3]與韓國法規(guī)[4]規(guī)定，復(fù)合食品包裝材料不可釋放出PAAs類物質(zhì)，特定遷移量均為10 μg/kg；我國規(guī)定，2, 4-二氨基甲苯的特定遷移量為4 μg/L[5]，該限量比歐盟的要求更嚴(yán)格，且在GB 9685—2016[6]中也未將這5種二氨基甲苯列入可允許使用的范疇。

目前，二氨基甲苯類物質(zhì)檢測方法有GCECD[7-8]、GC-MS[2,4,8,10-11]、LC-MS/MS[12-13]、實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜（DART-MS）法[14]、分子印跡-紫外光譜（MIPs-UV）法[15]等。LC-MS/MS、DART-MS定性可靠、檢出限低，具有較好的適用性，但針對食品包裝材料中5種二氨基甲苯同分異構(gòu)體的LC-MS/MS法仍鮮見報(bào)道。試驗(yàn)采用UPLC-MS/MS法，能完全分離5種同分異構(gòu)體，避免了因各同分異構(gòu)體的質(zhì)譜特征離子相同而產(chǎn)生的干擾和誤判。該方法方便、快捷、靈敏度高、特異性好，能夠?yàn)樯a(chǎn)和監(jiān)管部門提供可靠的技術(shù)保障。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290-6495超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；XPE205電子天平（梅特勒-托利多公司）；移液器（Gilson公司）；電熱恒溫箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器公司）；QY-75/126/177C遷移測試池（廣州愛測智能科技公司）；Milli-Q去離子水發(fā)生器（美國Milli-Q公司）。

2, 4-二氨基甲苯（2, 4-TDA，純度99.8%）、2, 3-二氨基甲苯（2, 3-TDA，純度99.7%）、2, 5-二氨基甲苯（2, 5-TDA，純度99.4%）、2, 6-二氨基甲苯（2, 6-TDA，純度98.9%）、3, 4-二氨基甲苯（3, 4-TDA，純度99.3%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；2, 4-二氨基甲苯-d3（2, 4-TDA-d3，純度98.2%，加拿大TRC公司）；甲酸銨（色譜級，美國ROE公司）；甲酸（LC/MS級，美國ACS公司）；甲醇（LC/MS級，美國Fisher公司）；乙酸、氨水（分析純，國藥集團(tuán)）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取10.0 mg（精確至0.01 mg）各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別置于100 mL容量瓶，用甲醇稀釋并定容至刻度，配成100 mg/L的各單標(biāo)儲備液，置于棕色瓶中，于-18 ℃保存。

同位素內(nèi)標(biāo)儲備液：稱取10.0 mg（精確至0.01 mg）2, 4-TDA-d3標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶，用甲醇稀釋并定容至刻度，配成100 mg/L的儲備液，置于棕色瓶中，于-18 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)系列中間液：分別準(zhǔn)確移取1.0 mL各單標(biāo)儲備液，置于10 mL容量瓶，用水定容至刻度，配成10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，再用水逐級稀釋成20，50，100，200，500，1 000和2 000 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列中間液，置于棕色瓶中，于2～8 ℃避光保存。

同位素內(nèi)標(biāo)中間液：精確量取100 μL同位素內(nèi)標(biāo)儲備液，用水定容至10 mL，配成1 000 μg/L的內(nèi)標(biāo)工作溶液，于2～8 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液：分別量取100 μL混合標(biāo)準(zhǔn)系列中間液，加入100 μL同位素內(nèi)標(biāo)中間液，使用空白樣品基質(zhì)定容至10 mL，配成0.2，0.5，1，2，5，10和20 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作曲線溶液。

1.3 樣品前處理

按照GB 5009.156—2016[17]的要求，取已清潔干燥的食品包裝材料，取面積大于遷移測試池密封區(qū)域的試樣，裝入預(yù)先已達(dá)到試驗(yàn)溫度的遷移測試池中，加入預(yù)先已達(dá)到試驗(yàn)溫度的4%乙酸溶液，密封。

當(dāng)被測樣品的使用溫度低于60 ℃時(shí)[5]，將裝有樣品的遷移測試池置于預(yù)先調(diào)至（60±2）℃的電熱恒溫箱里，恒溫2 h，取出，將4%乙酸溶液轉(zhuǎn)移至燒杯中，冷卻至室溫，備用。當(dāng)被測樣品使用溫度為60～120 ℃時(shí)，將裝有樣品的遷移測試池置于預(yù)先調(diào)至（120±3）℃的電熱恒溫箱里，恒溫40 min，取出，將4%乙酸溶液轉(zhuǎn)移至燒杯中，冷卻至室溫，備用。

準(zhǔn)確吸取10 mL上述遷移試驗(yàn)溶液于50 mL離心管中，加入100 μL 1 mg/L內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻，用氨水調(diào)pH為7.0～8.0，經(jīng)0.22 μm濾膜后，待儀器測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱，Waters BEH Phenyl（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相，A相為6 mmol/L甲酸銨溶液（pH 4.5），B相為甲醇；梯度洗脫程序見表1；流速，0.3 mL/min；進(jìn)樣量，5 μL；柱溫，35 ℃。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源，電噴霧離子源（AJS ESI）；掃描模式，正離子（ESI+）；采集方式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；干燥氣溫度，230 ℃；干燥氣流速，18 L/min；霧化氣壓力，35 psi；鞘氣溫度，335 ℃；鞘氣流速，12 L/min；毛細(xì)管電壓，3 000 kV；噴嘴電壓，500 V；碰撞池加速電壓，5 V；定性與定量離子對等參數(shù)見表2。

表2 待測物和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

二氨基甲苯類化合物屬于弱堿性物質(zhì)，選擇AJS ESI+掃描方式。這5種二氨基甲苯互為各同分異構(gòu)體，它們的分子離子峰[M+H]+相同，特征碎片離子也相同，需分別取各單標(biāo)工作溶液進(jìn)行全掃描和子離子掃描，并依次優(yōu)化干燥氣溫度、干燥氣流速、霧化氣壓力、鞘氣溫度、鞘氣流速、毛細(xì)管電壓和噴嘴電壓，以響應(yīng)強(qiáng)度相對較低的2, 3-二氨基甲苯優(yōu)化后的離子源參數(shù)為方法的最終質(zhì)譜條件，選取豐度較強(qiáng)的特征碎片離子分別作為定量及輔助定性離子，進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量，形成MRM方法（表2）。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

2, 4-二氨基甲苯與其同分異構(gòu)體之間的相對分子質(zhì)量相同、結(jié)構(gòu)相似、極性和溶解性相差不大、質(zhì)譜的特征離子相同，只有當(dāng)所有的色譜峰都達(dá)到基線分離，才能進(jìn)行定性定量分析。針對各個(gè)化合物的極性強(qiáng)弱及色譜保留機(jī)理，試驗(yàn)對C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、HILIC（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Amide（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、Phenyl（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱進(jìn)行了篩選，同時(shí)結(jié)合最佳流動相進(jìn)行試驗(yàn)，并進(jìn)一步比較了同填料不同品牌的Waters BEH C18、YMC-Triart C18和Thermo Hypersil-Gold的分離情況，結(jié)果表明，待測物在C18柱和Phenyl柱上均能滿足分離度要求，在其他填料的色譜柱上不保留或分離效果較差。最終選擇峰寬窄且響應(yīng)強(qiáng)度更高的Phenyl作為色譜分析柱。

2.2.2 流動相的選擇

2, 4-二氨基甲苯與其同分異構(gòu)體的極性均相對較大，且易溶于水、甲醇、乙醇等溶劑，當(dāng)使用通用的0.1%甲酸/乙腈體系時(shí)，無論選擇上述哪種類型的色譜柱，待測物均不被保留或者出現(xiàn)色譜峰重疊現(xiàn)象。當(dāng)使用5 mmol/L乙酸銨/甲醇體系時(shí)，在C18和Phenyl柱上各色譜峰峰形均較好，分離情況相同，但2, 3-二氨基甲苯和3, 4-二氨基甲苯峰難以分開；當(dāng)改變乙酸銨的濃度為10和20 mmol/L時(shí)，則峰高隨著濃度的升高而略微降低，分離度保持不變。當(dāng)使用甲酸銨/甲醇體系時(shí)，各化合物的響應(yīng)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，但分離度與乙酸銨-甲醇體系相似。于是，試驗(yàn)研究了甲酸銨濃度的影響，分別觀察5，6，7，8，10和20 mmol/L甲酸銨溶液的洗脫效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲酸銨濃度≥6 mmol/L時(shí)，隨著甲酸銨濃度的增加，各化合物的響應(yīng)強(qiáng)度已不再增大，但2, 3-二氨基甲苯和3, 4-二氨基甲苯峰仍舊重合。

2.2.3 流動相pH的選擇

為將2, 3-二氨基甲苯和3, 4-二氨基甲苯完全分離，試驗(yàn)研究了不同pH的6 mmol/L甲酸銨-甲醇體系中的分離情況。使用甲酸調(diào)低pH，當(dāng)甲酸銨溶液的pH由6.0，5.5，5.0，4.5，4.2和4.0依次降低時(shí)，待測物的峰高依次降低，出峰時(shí)間隨之加快，2, 3-二氨基甲苯和3, 4-二氨基甲苯由重合逐漸分離為兩個(gè)峰（圖1），且pH為4.5，4.2和4.0時(shí)分離度均滿足要求，考慮到低pH會降低其他化合物的響應(yīng)強(qiáng)度，并兼顧色譜柱的pH使用范圍及壽命，最終選擇流動相的pH為4.5。

圖1 不同pH的流動相對分離效果的影響

2.2.4 洗脫方式的選擇

洗脫方式會影響分離度及靈敏度，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，等度洗脫的基線平穩(wěn)，但保留時(shí)間的重現(xiàn)性不穩(wěn)定；梯度洗脫可縮短分析時(shí)間，各化合物響應(yīng)信號增強(qiáng)顯著，且峰的對稱性更好（圖2）。

圖2 總離子流（TIC）色譜圖（2.0 μg/L）

2.2.5 樣品試液pH的影響

遷移試驗(yàn)后的樣品試液為4%乙酸，用4%乙酸配制標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液分析發(fā)現(xiàn)，先出峰的2, 5-二氨基甲苯響應(yīng)強(qiáng)度降低，峰形拖尾嚴(yán)重。如果用氨水將樣品試液的pH分別調(diào)至5.0，6.0，7.0，8.0，9.0和10.0時(shí)，進(jìn)樣分析結(jié)果表明，2, 4-二氨基甲苯的響應(yīng)信號稍微增強(qiáng)，2, 5-二氨基甲苯增強(qiáng)顯著，且在試樣溶液由中性變至堿性時(shí)，強(qiáng)度趨于平緩，峰形對稱性良好，而pH對其他化合物的響應(yīng)強(qiáng)度影響程度甚小，如圖3所示。因此，將樣品試液pH調(diào)至7.0～8.0即可滿足檢測要求。

圖3 樣品試液pH對靈敏度的影響

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

樣品試液基質(zhì)能顯著影響目標(biāo)物在色譜柱上的分離行為、峰形及離子化效率等[18]。試驗(yàn)使用調(diào)pH后的4%乙酸銨溶液和空白基質(zhì)樣品試液分別配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，考察各待測物的絕對基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)對2, 4-二氨基甲苯的影響并不明顯，但對其他4種同分異構(gòu)體均有不同程度的抑制效應(yīng)，故采用空白樣品基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)加入適量2, 4-二氨基甲苯-d3作為內(nèi)標(biāo)，以消除或補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)帶來的偏差。根據(jù)各化合物在總離子流色譜圖中的響應(yīng)強(qiáng)弱，調(diào)整各化合物在混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的濃度，配制空白基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以定量離子和內(nèi)標(biāo)化合物的峰面積比為縱坐標(biāo)（Y），待測化合物和內(nèi)標(biāo)化合物的濃度比為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，內(nèi)標(biāo)法定量。在各化合物的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（r2≥0.998）。

以空白樣品基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)，按1.4小節(jié)測定，結(jié)果表明，2, 4-二氨基甲苯的檢出限（LOD，S/N≥3）和定量限（LOQ，S/N≥10）最低，分別為0.25和0.5 μg/L，其他4種同分異構(gòu)體的LOD均為0.5 μg/L，LOQ均為1.0 μg/L（表3）。

2.4 方法的回收率與精密度

以陰性食品包裝材料為樣品進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，分別添加低、中、高3個(gè)濃度水平，每個(gè)加標(biāo)濃度平行測定6次，計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（δRSD）。由表3可知各待測物的平均回收率為72%～97%，δRSD（n=6）為2.9%～9.4%。該方法的精密度和準(zhǔn)確度均能滿足痕量分析的要求。

表3 待測物的方法性能參數(shù)

2.5 實(shí)際樣品檢測

實(shí)驗(yàn)室隨機(jī)選取59種市場銷售的由紙、塑料薄膜或鋁箔經(jīng)黏合劑（聚氨酯和改性聚丙烯）復(fù)合而成的食品包裝材料，包括蒸煮袋和普通復(fù)合袋，應(yīng)用該方法進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢出4個(gè)批次的復(fù)合包裝材料中有2, 4-二氨基甲苯遷移，含量為0.5～2.0 μg/L，其余待測化合物均未檢出，陽性樣品的TIC圖如圖4所示。

圖4 陽性樣品的總離子流（TIC）色譜圖

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了食品包裝材料中2, 4-二氨基甲苯及其系列同分異構(gòu)體遷移量的UPLC-MS/MS同時(shí)測定方法。采用遷移測試池進(jìn)行遷移試驗(yàn)，遷移試液過濾膜后直接進(jìn)樣，前處理操作過程簡便快速；優(yōu)化了的色譜-質(zhì)譜條件，能夠?qū)崿F(xiàn)各同分異構(gòu)體在液相色譜柱上的有效分離，內(nèi)標(biāo)法定量。該方法定性可靠，定量準(zhǔn)確，靈敏度高，可為復(fù)合食品包裝材料的監(jiān)督抽查和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警提供技術(shù)支持。