楊梅果酒發(fā)酵工藝的優(yōu)化及香氣成分分析

高甜甜 ，陽(yáng)秀蓮，曾琦鵬，李高陽(yáng), ，劉偉, *，張菊華, *

1.湖南大學(xué)研究生院隆平分院（長(zhǎng)沙 410125）；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所（長(zhǎng)沙 410125）；3.果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（長(zhǎng)沙 410125）；4.湖南瑞生源生物科技有限公司（冷水江 418400）

楊梅（MyricarubraSieb.& Zucc.）富含碳水化合物、有機(jī)酸、可溶性糖、礦物質(zhì)、維生素和酚類物質(zhì)等[1-2]營(yíng)養(yǎng)成分，還具有多種生理功效，是良好的果蔬加工原料。目前，市面上有果汁飲料、楊梅罐頭、楊梅干和楊梅酒等產(chǎn)品，大大延長(zhǎng)了楊梅的保質(zhì)期，拓寬了其加工領(lǐng)域，豐富了果蔬制品市場(chǎng)。楊梅酒因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用效果[3]以及獨(dú)特的風(fēng)味，有極大的市場(chǎng)潛力。但是，目前關(guān)于楊梅酒的發(fā)酵工藝研究較少，工藝較為落后，導(dǎo)致產(chǎn)品的整體口感和品質(zhì)不高，尤其是風(fēng)味不足的問(wèn)題，限制了楊梅果酒的發(fā)展。

此次試驗(yàn)以酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面法試驗(yàn)，對(duì)影響楊梅酒發(fā)酵生產(chǎn)的主要工藝參數(shù)（酵母接種量、發(fā)酵溫度、加糖量、初始pH）進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)最優(yōu)工藝所得的楊梅成品酒的香氣成分進(jìn)行了分析，以期為楊梅酒的發(fā)酵工藝的優(yōu)化和產(chǎn)品品質(zhì)的提升提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：RY1菌株（Saccharomyces cerevisiae）為課題組前期篩選所得。

楊梅汁：將成熟度良好的新鮮楊梅原料洗凈壓榨，過(guò)濾后將楊梅汁用干凈的塑料罐進(jìn)行分裝，在-40 ℃的冰箱內(nèi)保存。

焦亞硫酸鉀（食品級(jí)），淄博長(zhǎng)城化工有限公司；其他試劑為實(shí)驗(yàn)室常用AR級(jí)試劑。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HWS型智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠制造；6890-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；SHA-B型恒溫水浴振蕩器，金壇市醫(yī)療儀器廠；50/30 μm固相萃取儀，德國(guó)CNW公司。

1.3 方法

1.3.1 楊梅果酒釀造工藝流程

楊梅→清洗→榨汁→調(diào)整成分→添加偏重亞硫酸鈉，室溫放置6～8 h→接種→發(fā)酵→二次加糖→發(fā)酵→倒罐過(guò)濾→后發(fā)酵→陳釀→下膠→過(guò)濾→灌裝殺菌→成品

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以酒精度為主要指標(biāo)，在其他工藝條件保持一致的條件下，分別調(diào)整酵母菌接種量、發(fā)酵溫度、加糖量和pH進(jìn)行單因素試驗(yàn)。試驗(yàn)梯度設(shè)計(jì)：接種量1%，3%，5%，7%和9%；發(fā)酵溫度18，21，24，27和30 ℃；加糖量150，170，190，210和230 g/L；pH 2.5，3.0，3.5，4.0和4.5。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以加糖量、接種量、pH、發(fā)酵溫度為響應(yīng)因素，酒精度為響應(yīng)值，進(jìn)一步進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平編碼

1.3.4 香氣成分的測(cè)定

1.3.4.1 樣品制備

參照文獻(xiàn)[4]的方法，略作修改。將10 mL楊梅酒樣品放入20 mL頂空瓶，再加1.5 g NaCl進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4.2 GC-MS條件

GC條件，參照文獻(xiàn)[5]的方法，略作修改。氣相色譜柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣是高純氦氣，流速是1.67 mL/min。采用無(wú)分流模式進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL。進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱溫箱升溫程序：40 ℃保持3 min，然后以3 ℃/min的速率升溫到160 ℃，保持2 min，然后再以8 ℃/min的速率升溫到220 ℃保持10 min。

MS條件：離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離方式EI，離子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍33～550 U。

1.4 數(shù)據(jù)處理

主要使用Excel 2016、Origin 2018處理數(shù)據(jù)，用Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)并分析發(fā)酵楊梅酒的最佳工藝條件。所有數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 最佳接種量的確定

控制加糖量190 g/L、發(fā)酵溫度24 ℃、楊梅汁pH 3.0，分析接種量對(duì)楊梅果酒酒精度的影響。由圖1可知，酒精度的大小受酵母接種量的影響。接種量太少，發(fā)酵周期被延長(zhǎng)，酒精度低。隨著發(fā)酵菌株接種量增加，酒精度先上升后下降。在接種量7%的條件下，酒精度達(dá)到最高值9.0%vol。當(dāng)接種量過(guò)高時(shí)，發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)難以滿足酵母自生快速增殖擴(kuò)代，且大部分用于酵母的增殖使得酒精度低，同時(shí)還會(huì)引起果酒澄清度降低，酵母味過(guò)。因此，選擇接種量5%，7%和9%作為后續(xù)試驗(yàn)參數(shù)。

圖1 接種量對(duì)楊梅酒酒精度的影響

2.1.2 最佳發(fā)酵溫度的確定

控制加糖量190 g/L、楊梅汁pH 3.0、接種量5%，分析發(fā)酵溫度對(duì)楊梅果酒酒精度的影響。由圖2可知，發(fā)酵溫度對(duì)酒精度有影響，隨著發(fā)酵溫度的增加，酒精度呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，在24 ℃條件下，酒精度最高。這是由于溫度可以顯著地影響發(fā)酵菌種活性，從而影響其發(fā)酵性能[6]。溫度較低時(shí)，菌株活性較低，發(fā)酵速率較慢，發(fā)酵周期被延長(zhǎng)。隨著溫度的升高，酒精度增大，但是溫度過(guò)高時(shí)，酒精度減小。這可能是由于菌株在高溫環(huán)境下，對(duì)于酒精的毒害作用更加敏感[7]，發(fā)酵能力降低。因此，選擇發(fā)酵溫度21，24和27 ℃作為后續(xù)試驗(yàn)參數(shù)。

圖2 溫度對(duì)楊梅酒酒精度的影響

2.1.3 最佳加糖量的確定

控制發(fā)酵溫度24 ℃、楊梅汁pH 3.0、接種量5%，分析加糖量對(duì)楊梅果酒酒精度的影響。由圖3可知，加糖量較低時(shí)，酵母發(fā)酵糖源較少，酒精度較低，隨著加糖量增加，酒精度也有所上升，當(dāng)加糖量為230 g/L時(shí)，酒精度最大。但是在230 g/L的條件下，發(fā)酵速度放慢，且發(fā)酵產(chǎn)物的可溶性固形物含量比其他4個(gè)水平高，這表明發(fā)酵菌株在該條件下沒(méi)有將發(fā)酵液中的糖利用完全。而前4個(gè)水平條件下的發(fā)酵產(chǎn)物的可溶性固形物含量相等，且在加糖量210 g/L時(shí)，酒精度最高，這表明其為最優(yōu)水平。因此，選擇加糖量190，210和230 g/L作為后續(xù)試驗(yàn)參數(shù)。

圖3 加糖量對(duì)楊梅酒酒精度的影響

2.1.4 最佳pH的確定

控制發(fā)酵溫度24 ℃、接種量5%、加糖量190 g/L，分析楊梅汁pH對(duì)楊梅果酒酒精度的影響。由圖4可知，pH 2.5時(shí)，酒精度較小，在pH 3.0的條件下，酒精度顯著增大，之后隨著pH的增加，發(fā)酵產(chǎn)物酒精度變化較小，考慮到pH會(huì)對(duì)楊梅果酒的顏色產(chǎn)生顯著影響，且在酸性條件下，果酒的色澤最好，因此選擇pH 2.5，3.0和3.5作為后續(xù)試驗(yàn)參數(shù)。

圖4 pH對(duì)楊梅酒酒精度的影響

2.2 RY1菌株發(fā)酵楊梅果酒響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.6軟件，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 模型、方差及交互作用分析

通過(guò)軟件分析，擬合A（pH）、B（加糖量）、C（接種量）、D（溫度）后，得到關(guān)于酒精度（R）的二次多項(xiàng)回歸方程模型：R=8.76+0.20A+0.81B-0.25C-0.008 333D+0.28AB+0.18AC+0.05AD+0.10BC+0.20BD+0.32CD+0.31A2-0.23B2-0.24C2+0.52D2。

由表3可知，二次方程模型極顯著（p＜0.000 1）；失擬項(xiàng)p值0.241 8＞0.05，說(shuō)明該模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小，可以用于預(yù)測(cè)不同變量條件下的響應(yīng)值。對(duì)模型系數(shù)的顯著性分析表明，因素B對(duì)果酒酒精度的影響極顯著（p＜0.01），因素C對(duì)果酒酒精度影響顯著（p＜0.05），各項(xiàng)單因素對(duì)果酒酒精度的影響的顯著性由大到小依次是加糖量（B）＞接種量（C）＞pH（A）＞發(fā)酵溫度（D）。

表3 回歸模型方差分析及參數(shù)估計(jì)

由圖5可知，在4個(gè)因素中，兩兩之間的交互作用較弱，且各交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響均不顯著。運(yùn)用軟件Design-Expert 8.0.6，結(jié)合二次回歸模型的數(shù)學(xué)分析，可以得到楊梅果酒發(fā)酵工藝的最佳工藝參數(shù)：接種量8.47%、發(fā)酵溫度27 ℃、pH 3.5、加糖量為229.95 g/L。在此發(fā)酵條件下，酒精度均值為11.1%vol。

圖5 響應(yīng)曲面圖

2.3 發(fā)酵前后楊梅果酒香氣成分分析

發(fā)酵前后楊梅汁樣品中香氣成分見(jiàn)圖6。通過(guò)對(duì)各組分的鑒定分析，發(fā)酵前后的樣品中共檢出46種主要香氣成分，主要是17種酯類、12種醇類、3種酸類、5種烯烴類、2種烷烴類及7種其他化合物，其中乙酸乙酯、3-己烯醇、庚醇、1-辛醇、3-壬烯-7-醇、芳樟醇、石竹烯等10種化合物在發(fā)酵前后樣品中均有檢出，發(fā)酵過(guò)程新增加了16種化合物，以酯類和醇類為主。

圖6 發(fā)酵前后楊梅汁樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總離子流圖

在發(fā)酵前的楊梅汁中，共檢測(cè)到30種香氣成分，占總峰面積的96.73%。其中，烯烴類（33.83%）、酯類（17.09%）含量較高。烯烴類物質(zhì)大多具有水果香、花香，且閾值較低，對(duì)楊梅汁的風(fēng)味起著重要作用。特征成分β-石竹烯占總揮發(fā)性香氣成分的29.69%，是楊梅汁的主要風(fēng)味物質(zhì)，賦予楊梅汁辛香、木香及丁香香氣。張楊等[8]、Cheng等[9]、徐磊等[10]、程喚[11]的研究結(jié)果均顯示石竹烯是楊梅汁最主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，這與此次試驗(yàn)結(jié)果一致。

楊梅酒中共有27種香氣成分，占總峰面積的96.75%。主要的香氣成分是酯類（32.88%）和醇類化合物（61.57%），烯萜類相對(duì)含量下降了32.36%，其特征成分石竹烯在發(fā)酵后基本損失殆盡，這與侍崇娟等[12]的研究結(jié)果一致。

酯類物質(zhì)多數(shù)具有明顯的花香味，對(duì)楊梅果酒香氣的形成占主要貢獻(xiàn)。經(jīng)發(fā)酵的楊梅酒樣品，其酯類物質(zhì)明顯增多，其中辛酸乙酯（11.12%）、癸酸乙酯（11.91%）、乙酸乙酯（4.85%）和月桂酸乙酯（2.7%）是楊梅酒果香的主要呈味物質(zhì)，新檢測(cè)出癸酸乙酯、3-壬烯酸乙酯、3-己烯酸乙酯、辛酸乙酯等。辛酸乙酯具有果香、白蘭地酒香味、脂肪味；癸酸乙酯具有果香和白蘭地酒香[13]；乙酸乙酯有明顯的的酯香和水果香氣。

醇類物質(zhì)是楊梅果酒香氣的主要成分之一。經(jīng)發(fā)酵的楊梅酒樣品，醇類物質(zhì)相對(duì)含量明顯提高，主要是乙醇（41.92%）、1-辛醇（4.35%）、芳樟醇（4.39%）、3-己烯醇（2.41%）、異戊醇（2.26%）、庚醇（2.13%）。乙醇賦予楊梅酒甜香的風(fēng)味特征；芳樟醇具有清新而強(qiáng)烈的鈴蘭花香氣，其閾值較低，香氣值較高，影響果酒的整體香氣。楊梅汁經(jīng)發(fā)酵，其醇類、酯類風(fēng)味化合物相對(duì)含量增加，烯萜類風(fēng)味化合物降低，這表明對(duì)于楊梅酒的風(fēng)味來(lái)說(shuō)，三者之間的平衡較為重要。

表4 主發(fā)酵前后楊梅果酒香氣成分的變化

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，以酒精度作為指標(biāo)，優(yōu)化楊梅酒的發(fā)酵工藝參數(shù)，得到RY1發(fā)酵楊梅酒最佳工藝條件：接種量8.47%、pH 3.5、發(fā)酵溫度27 ℃、加糖量229.95 g/L。在此條件下，楊梅酒酒精度為11.1%vol。采用SPME-GC-MS分析發(fā)酵前后楊梅汁的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，楊梅汁中共檢測(cè)出30種香氣成分，以烯烴類（33.83%）和酯類（17.09%）化合物為主，特征成分β-石竹烯占總香氣成分的29.69%，是楊梅汁的主要風(fēng)味物質(zhì)。發(fā)酵后楊梅酒中共檢測(cè)出27種香氣成分，醇類（61.57%）和酯類（32.88%）化合物相對(duì)含量提高，發(fā)酵后新增加了辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯等16種化合物，烯萜類相對(duì)含量下降了32.36%。正是這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化，相互協(xié)調(diào)與平衡，賦予了楊梅酒香味濃郁怡人的風(fēng)味品質(zhì)。