響應(yīng)面優(yōu)化酶法制備高粱醇溶蛋白DPP-IV抑制肽參數(shù)

蔡曉，戴凌燕，姜鵬，阮長青, ，張東杰, ，李志江, *

1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院（大慶 163319）；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院（大慶 163319）；3.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心（大慶 163319）；4.國家雜糧工程技術(shù)研究中心（大慶 163319）

二肽基肽酶-IV（DPP-IV）抑制肽是一類具有促進(jìn)胰島素分泌功能的生物活性肽，通過抑制DPP-IV對胰高血糖素樣肽-1和抑胃肽（GIP）在內(nèi)的葡萄糖抑制多肽的降解，提高胰島素的分泌量[1]，被廣泛應(yīng)用于Ⅱ型糖尿病的治療中。糖尿病是由代謝紊亂引起的慢性疾病[2]，表現(xiàn)為血糖水平過高，易引發(fā)中風(fēng)、心肌梗死等問題，嚴(yán)重時(shí)會(huì)危及生命[3]。據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會(huì)統(tǒng)計(jì)，在2017年底，糖尿病患者達(dá)到4.25億[4]，其中Ⅱ型糖尿病占95%以上[5]。目前，人工合成的DPP-IV抑制劑已推廣應(yīng)用，如維達(dá)列汀、西格列汀等，但在降低血糖的同時(shí)也引發(fā)了腹瀉、過敏等副作用[6]。因此，開發(fā)天然、安全的DPP-IV抑制肽引起了重視，成為研究的熱點(diǎn)。

高粱是世界五大種植作物之一[7]。高粱具有產(chǎn)量高、耐貧瘠等優(yōu)勢，使其在全世界均有大量的種植。高粱的蛋白質(zhì)含量為6%～18%，由清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白組成[8]，醇溶蛋白占60%～80%[9]，含有大量疏水性氨基酸。有研究表明DPP-IV抑制肽通常具有高比例的疏水性氨基酸，疏水性氨基酸可能會(huì)加強(qiáng)與DPP-IV活性位點(diǎn)的相互作用[10]。因此，從高粱醇溶蛋白水解物中獲得DPP-IV抑制肽，成為開發(fā)糖尿病藥物的新方向。

由于高粱醇溶蛋白的消化性較差，近年來對高粱醇溶蛋白的研究主要以生物膜制備[11]及包埋荷載能力[12-13]為方向，制備生物活性肽的相關(guān)研究較少，其中制備抗氧化活性肽的研究較為活躍[14-15]，但制備DPP-IV抑制肽的相關(guān)研究尚無報(bào)道。研究利用木瓜蛋白酶，優(yōu)化制備高粱醇溶蛋白DPP-IV抑制肽的最佳工藝參數(shù)，為高粱醇溶蛋白的開發(fā)與利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料和試劑

高粱，龍米糧1號(hào)（蛋白質(zhì)含量9.2%），黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種研究所王黎明研究員饋贈(zèng)；木瓜蛋白酶（酶活800 U/mg）、堿性蛋白酶（酶活200 U/mg）、風(fēng)味蛋白酶（酶活30 U/mg）、牛血清白蛋白，索萊寶科技有限公司；中性蛋白酶（酶活100 U/mg），源葉生物科技有限公司；二肽基肽酶IV、甘氨酰-脯氨酰-對硝基苯胺對甲苯磺酸鹽，Sigma公司；Folin-酚試劑，北京鼎國生物科技有限公司；乙醇、石油醚等有機(jī)溶劑，分析純，沈陽試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Varioskan Flash酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾科技公司；CHRISTALpha型冷凍干燥機(jī)，CHRIST公司；PHS.2C型精密pH計(jì)，美國METTLER TOLEDO公司；Cary60分光光度計(jì)，美國安捷倫公司；AB204-N型分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；TDZ5-WS型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SENCO恒溫水浴鍋，上海申生科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高粱醇溶蛋白的制備

取粉碎后的高粱，按1∶5的比例加石油醚進(jìn)行脫脂，再將100 g脫脂高粱粉在65 ℃下，加入900 mL含有0.3 g偏亞硫酸氫鈉的體積分?jǐn)?shù)70%含水乙醇提取1 h，期間通過自動(dòng)攪拌器不斷攪拌。在3 300g，15 min條件下離心，取上清液。將溶劑稀釋至體積分?jǐn)?shù)40%乙醇水溶液并在4 ℃保持過夜以促進(jìn)蛋白質(zhì)沉淀[16]。在上述條件下離心后回收蛋白質(zhì)沉淀，進(jìn)行冷凍干燥，于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 高粱醇溶蛋白酶解物的制備

將1 g高粱醇溶蛋白溶解于裝有25 mL去離子水的錐形瓶中，制備出蛋白質(zhì)懸浮液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%）。向懸浮液中添加蛋白酶，用橡膠塞密封燒瓶。預(yù)熱至酶解溫度后，轉(zhuǎn)移到水浴搖床中[17]。反應(yīng)結(jié)束后，于95 ℃水浴15 min滅酶，冷卻至室溫。用離心機(jī)按3 500g離心25 min，收集上清液，即為水解產(chǎn)物。

1.2.3 最適用酶的篩選

試驗(yàn)共選用4種蛋白酶酶解高粱醇溶蛋白，其最適作用條件如表1所示。通過改變酶解時(shí)間，測定高粱醇溶蛋白酶解液的DPP-IV抑制率，比較4種酶的酶解情況，確定最適用酶對其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 不同蛋白酶酶解的用量及反應(yīng)條件

1.2.4 DPP-IV抑制率的測定

通過底物發(fā)色法對DPP-IV抑制率進(jìn)行測定[18]。將試驗(yàn)分為4組，分別為陰性對照組（酶10 μL+緩沖液40 μL+底物50 μL）、空白對照組（底物50 μL+緩沖液50 μL）、試驗(yàn)組（酶解液40 μL+酶10 μL+底物50 μL）和試驗(yàn)空白對照組（酶解液40 μL+緩沖液10 μL+底物50 μL）。反應(yīng)在96孔板內(nèi)進(jìn)行，DPP-IV質(zhì)量濃度為100 ng/mL，發(fā)光底物甘氨酰-脯氨酰-對硝基苯胺對甲苯磺酸鹽濃度為100 μmol/L，所用溶解液為100 mmol/L Tris-buffer緩沖液（pH 8.0）[19]。按照酶解液、蛋白酶、緩沖液、底物的順序依次加入后，在37 ℃下預(yù)熱1 h，在405 nm處測定吸光度，根據(jù)式（1）計(jì)算抑制率[20]。

式中：ΔA0為陰性對照組吸光度-空白對照組吸光度；ΔAx為試驗(yàn)組吸光度-試驗(yàn)空白對照組吸光度。

1.2.5 可溶性蛋白含量的測定

在試管中加入1 mL待測樣品（稀釋后），再加入5 mL Folin-酚試劑甲，室溫下靜置10 min，加入0.5 mL Folin-酚試劑乙，搖勻，室溫下靜置30 min，在500 nm條件下測定吸光度?？瞻滓? mL蒸餾水代替，其余操作相同。將測定的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算其蛋白濃度[21]。

1.2.6 單因素試驗(yàn)

酶解時(shí)間的確定。選用木瓜蛋白酶，按1.2.2節(jié)的方法進(jìn)行酶解。將酶解時(shí)間控制在1，2，3，4，5和6 h，在溫度50 ℃，pH 6.5，酶添加量6 000 U/g條件下酶解。

酶解溫度的確定。選用木瓜蛋白酶，按1.2.2節(jié)的方法進(jìn)行酶解。將酶解溫度控制在40，45，50，55和60 ℃，在時(shí)間3 h，pH 6.5，酶添加量6 000 U/g條件下酶解。

pH的確定。選用木瓜蛋白酶，按1.2.2節(jié)的方法進(jìn)行酶解。將酶解pH控制在5，5.5，6，6.5和7，在時(shí)間3 h，溫度50 ℃，酶添加量6 000 U/g條件下酶解。

加酶量的確定。選用木瓜蛋白酶，按1.2.2節(jié)的方法進(jìn)行酶解。將加酶量控制在3 000，6 000，9 000，12 000和15 000 U/g，在時(shí)間3 h，溫度50 ℃，pH 5.5條件下酶解。

1.2.7 酶解工藝優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以酶解時(shí)間（A）、溫度（B）、pH（C）、酶添加量（D）為響應(yīng)因素，酶解液DPP-IV抑制率（Y）為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素和編碼水平見表2。結(jié)果運(yùn)用Design-Expert.V 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和響應(yīng)曲面分析。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素及水平設(shè)計(jì)

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有指標(biāo)檢測均選取3次結(jié)果取平均值。所得數(shù)據(jù)采用SPSS 25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，以α=0.05和α=0.01作為差異顯著水平，結(jié)果用X±SD表示。若有顯著性差異（p＜0.05），則采用Duncan進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。用Graph Pad Prism作圖軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 高粱DPP-IV肽水解酶的篩選

分別對比了4種蛋白酶水解高粱醇溶蛋白水解產(chǎn)物的DPP-IV抑制效果，結(jié)果如圖1所示。測定了4種蛋白酶酶解液DPP-IV抑制率，其中木瓜蛋白酶酶解的酶解液DPP-IV抑制率最大。蛋白酶對水解底物的專一性表現(xiàn)在各種蛋白酶作用位點(diǎn)的不同，這可能使4種蛋白酶水解高粱醇溶蛋白后，產(chǎn)生具有明顯差異的組成和特性的酶解產(chǎn)物[22]。因此，蛋白酶解液顯示出DPP-IV抑制活性差異明顯的現(xiàn)象。

圖1 4種水解酶處理不同水解時(shí)間得到水解樣品的DPP-IV抑制率

2.2 高粱醇溶蛋白酶解單因素條件研究

2.2.1 不同時(shí)間梯度對酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制活性及可溶性蛋白含量的影響

測定在不同的酶解時(shí)間下高粱醇溶蛋白水解產(chǎn)物的DPP-IV抑制效果和可溶性蛋白含量的變化，結(jié)果見圖2。當(dāng)酶解時(shí)間為1～3 h時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長，DPP-IV抑制活性及可溶性蛋白含量均以較快速率遞增，伴隨酶解時(shí)間的不斷延長，在達(dá)到3 h時(shí)，酶解產(chǎn)物的DPP-IV抑制活性為73.67%。隨后在3～6 h時(shí)間段內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的延長，DPP-IV抑制活性的變化趨勢基本穩(wěn)定，表現(xiàn)為緩慢增長后下降，無顯著性差異（p＞0.05）?？扇苄缘鞍缀康淖兓才cDPP-IV抑制活性的變化趨勢同步，表現(xiàn)為緩慢增加，無顯著性差異（p＞0.05）。甲承立[23]在使用胰蛋白酶酶解乳白蛋白制備DPP-IV抑制肽時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著酶解時(shí)間的積累，乳白蛋白酶解產(chǎn)物的DPP-IV抑制活性呈現(xiàn)出先升高后緩慢下降，在出現(xiàn)拐點(diǎn)的位置達(dá)到最佳抑制活性，因此該時(shí)間點(diǎn)為最優(yōu)水解時(shí)間。出現(xiàn)拐點(diǎn)后DPP-IV抑制活性略有下降的原因，可能是伴隨酶活力的下降以及加熱時(shí)間的延長，水解產(chǎn)物中肽段出現(xiàn)了重新聚合現(xiàn)象，導(dǎo)致最終產(chǎn)物中的有效成分減少。這是由于酶解反應(yīng)啟動(dòng)后，伴隨時(shí)間延長，蛋白質(zhì)水解生成的短鏈多肽含量增多，活性肽的抑制活性和可溶性蛋白含量也隨之增大。當(dāng)活性達(dá)到最大值后，隨著酶解反應(yīng)的繼續(xù)，蛋白質(zhì)水解成的短鏈多肽會(huì)進(jìn)一步水解，可能產(chǎn)生小部分氨基酸，抑制肽的數(shù)量就會(huì)隨之減少。試驗(yàn)考慮到在3 h后DPP-IV抑制活性和可溶性蛋白均無顯著性差異（p＞0.05），故直接選擇3 h為最佳酶解時(shí)間進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 時(shí)間對酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制活性和可溶性蛋白的影響

2.2.2 不同溫度梯度對酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制活性及可溶性蛋白含量的影響

測定在不同的溫度條件下高粱醇溶蛋白水解產(chǎn)物的DPP-IV抑制效果和可溶性蛋白含量的變化，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)酶解溫度在40～50 ℃范圍內(nèi)變化時(shí)，可溶性蛋白含量和DPP-IV抑制率表現(xiàn)出遞增趨勢。當(dāng)酶解溫度升高至50 ℃時(shí)，DPP-IV抑制率達(dá)到最大值。在50～60 ℃，伴隨著溫度的上升，DPP-IV抑制率呈下降趨勢，可溶性蛋白含量則是逐漸趨于穩(wěn)定。吉薇等[24]通過響應(yīng)面優(yōu)化法確定動(dòng)物蛋白酶水解南極磷蝦制備DPP-IV抑制肽的最佳酶解工藝，其中，溫度對酶解效果也呈現(xiàn)上升后下降的趨勢?？赡苡捎诿附鉁囟容^低，酶活性則較小，導(dǎo)致水解速度較慢，使酶解產(chǎn)物的DPP-IV抑制率和可溶性蛋白含量都較低；當(dāng)反應(yīng)溫度升高后，酶的活性會(huì)增強(qiáng)，同時(shí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開，促使酶與底物進(jìn)行充分反應(yīng)，使水解速度加快，則酶解產(chǎn)物的DPP-IV抑制率和可溶性蛋白含量都有所上升；但當(dāng)溫度進(jìn)一步升高，伴隨著酶活性的逐漸失去，水解效果也逐漸變差，酶解釋放的活性多肽減少，從而使DPP-IV抑制率呈現(xiàn)下降趨勢。

圖3 溫度對DPP-IV抑制活性和可溶性蛋白的影響

2.2.3 不同pH梯度對酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制活性及可溶性蛋白含量的影響

測定在不同pH條件下高粱醇溶蛋白水解產(chǎn)物的DPP-IV抑制效果和可溶性蛋白含量的變化，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)pH在5.0～5.5范圍變化時(shí)，隨著pH升高，水解產(chǎn)物的DPP-IV抑制率呈現(xiàn)上升趨勢，并在pH 5.5時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)pH為5.5～6.5時(shí)，隨著pH的增大，DPP-IV抑制率逐漸變小?？赡苡捎趐H的改變對蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致酶解產(chǎn)生的有效肽段在類型和數(shù)量上有明顯差異，從而呈現(xiàn)出酶解產(chǎn)物的DPP-IV抑制率的差異變化。可溶性蛋白含量在此變化范圍內(nèi)則無顯著性變化，證明在此pH變化范圍內(nèi)水解速度未發(fā)生明顯變化，這與木瓜蛋白酶的pH可適應(yīng)范圍有一定的關(guān)系。

圖4 pH對酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制活性和可溶性蛋白的影響

2.2.4 蛋白酶添加量不同對酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制活性及可溶性蛋白含量的影響

測定在不同的加酶量條件下高粱醇溶蛋白水解產(chǎn)物的DPP-IV抑制效果和可溶性蛋白含量的變化，結(jié)果如圖5所示。在蛋白酶添加量3 000～6 000 U/g范圍內(nèi)，DPP-IV抑制率和可溶性蛋白含量隨著酶添加量的增加呈現(xiàn)上升趨勢，并且在6 000 U/g時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)酶添加量超過6 000 U/g之后，在加酶量成倍增長的條件下，DPP-IV抑制率和可溶性蛋白含量均保持穩(wěn)定的趨勢，沒有顯著性的差異變化。這與周建敏等[25]通過堿性蛋白酶制備高粱醇溶蛋白ACE抑制肽試驗(yàn)中的結(jié)論類似。在蛋白酶添加量較少時(shí)，水解產(chǎn)物的DPP-IV抑制效果與加酶量呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)加酶量繼續(xù)增大時(shí)，DPP-IV抑制率逐漸趨于穩(wěn)定。這是由于在酶添加量較少的情況下，伴隨酶量的增加，蛋白質(zhì)逐漸分解完全，DPP-IV抑制率和可溶性蛋白含量也隨著逐漸增大，當(dāng)?shù)鞍酌傅奶砑恿窟_(dá)到6 000 U/g時(shí)，相對于底物而言，酶用量已趨向飽和，DPP-IV抑制率和可溶性蛋白含量達(dá)到峰值，繼續(xù)增加蛋白酶用量，并沒有多余的底物能與之結(jié)合，最終使DPPIV抑制率和可溶性蛋白含量的數(shù)值處于相對穩(wěn)定。

圖5 酶添加量對酶解產(chǎn)物DPP-IV抑制活性和可溶性蛋白的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化酶解條件

2.3.1 中心組合試驗(yàn)結(jié)果

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平及結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

按照表2設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表3。根據(jù)表3的結(jié)果，設(shè)定DPP-IV抑制率為響應(yīng)值，使用Design-Expert.V 8.0.6軟件對響應(yīng)值和各因素的編碼值進(jìn)行回歸擬合分析，得到二次多元回歸方程：

Y=89.77+2.91A+3.82B-1.28C+6.02D-0.58AB+0.36AC-0.39AD+0.96BC+0.023BD+0.43CD-2.26A2-8.79B2-3.56C2-4.44D2

對回歸方程的方差分析結(jié)果見表4。從表4中可以看出，對DPP-IV抑制率所建立的回歸方程模型的顯著性（p＜0.000 1）極高，失擬項(xiàng)（p=0.077 9＞0.05）不顯著，模型的調(diào)整系數(shù)R2=0.940 1，表明該模型與實(shí)際試驗(yàn)的擬合較好，自變量與響應(yīng)面之間的線性關(guān)系較為顯著，試驗(yàn)的誤差較小，因此，可以運(yùn)用該回歸模型來分析和預(yù)測高粱醇溶蛋白制備DPP-IV抑制肽工藝效果。在回歸方程中，各因素的系數(shù)值是直接反映每個(gè)試驗(yàn)因子與指標(biāo)值的影響效果。由各因素的均方值可知，各因素對高粱醇溶蛋白DPP-IV抑制率的影響順序?yàn)槊柑砑恿浚緶囟龋緯r(shí)間＞pH。從表4可以看出，方程中的一次項(xiàng)A、B、C、D與二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2均是極顯著的；交互項(xiàng)均不顯著。綜上所述，響應(yīng)值的變化十分復(fù)雜，各具體的試驗(yàn)因素對DPP-IV抑制率的影響并非是簡單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系。分別將模型中的A（時(shí)間）、B（溫度）、C（pH）、D（酶添加量）因素其中的2個(gè)固定在0水平，可以得到另外2個(gè)因素的交互作用對DPPIV抑制率的子模型，通過觀察模型得到三維曲面圖，可以發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)的交互項(xiàng)均對抑制率無顯著影響。通過中心組合試驗(yàn)所得的結(jié)果與二次多項(xiàng)回歸擬合方程，通過軟件Design-Expert.V 8.0.6得出獲得最高DPP-IV抑制率時(shí)各因素的最佳蛋白酶解條件：時(shí)間3.56 h、溫度50.97 ℃、pH 5.46、酶添加量7 947.45 U/g。在此條件下，高粱醇溶蛋白酶解產(chǎn)物的DPP-IV抑制率的理論值為92.96%。

表4 回歸模型的方差分析

2.3.2 響應(yīng)面模型最佳條件的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性，并考慮到操作過程中試驗(yàn)的具體可實(shí)施性，在時(shí)間3.6 h、溫度51 ℃、pH 5.5、酶添加量8 000 U/g條件下進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，通過重復(fù)3組平行試驗(yàn)，得到的高粱醇溶蛋白的DPPIV抑制率平均值為91.97%，與預(yù)測值92.96%的誤差在1%以內(nèi)，表明采用該響應(yīng)面優(yōu)化得到的酶解工藝參數(shù)模型可靠，對高粱醇溶蛋白DPP-IV抑制肽的制備具有意義。

3 結(jié)論

應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白水解酶水解高粱醇溶蛋白制備DPP-IV抑制肽的工藝參數(shù)，結(jié)果顯示，模型擬合度較高，可用于高效的高粱醇溶蛋白DPP-IV抑制肽的制備預(yù)測與優(yōu)化。酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解pH、酶添加量均對DPP-IV抑制作用顯著。該工藝參數(shù)條件為時(shí)間3.56 h、溫度50.97 ℃、pH 5.46、酶添加量7 947.45 U/g。在此條件下，高粱醇溶蛋白的DPP-IV抑制率為91.97%，與預(yù)測值92.96%誤差為0.99%。研究為高粱醇溶蛋白DPP-IV抑制肽的高效制備和功能性研究提供了參考，為高粱醇溶蛋白進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。