小米糠結合酚的提取工藝

李曉君 ，張梅，成悅，張建豐，丁東源，渠志燦*

1.中北大學化學工程與技術學院（太原 030051）；2.山西納安生物科技股份有限公司（太原 030006）

我國谷子的年種植面積約140萬 hm2，產(chǎn)量450萬 t。小米糠是谷子加工產(chǎn)生的副產(chǎn)物，不僅含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，而且富含黃酮、多酚等生物活性物質(zhì)，既可起到延緩衰老的作用[1-2]，又能預防一些慢性疾病，如慢性炎癥、糖尿病、癌癥等[3]。目前，小米糠小部分被制成家畜飼料，大部分則直接焚燒，不僅造成了環(huán)境污染，還造成了資源的嚴重浪費[4]，所以開發(fā)利用小米糠有著重要的意義和廣闊的前景[5-6]。

小米糠中結合酚類化合物具有很強的抗氧化活性，可有效預防癌癥、心血管疾病、阿茨海默病及糖尿病等[7-8]。試驗以山西省7個縣區(qū)的晉谷21號小米糠為原料，對其營養(yǎng)成分進行比較研究，并以石樓縣小米糠為原料優(yōu)化了小米糠結合酚的提取工藝，同時考察小米糠游離酚和結合酚抗氧化活性的強弱，為小米糠的綜合開發(fā)利用提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選用山西省忻府區(qū)、昔陽縣、武鄉(xiāng)縣、石樓縣、沁縣、廣靈縣、五臺縣7個縣區(qū)的晉谷21號谷子加工產(chǎn)生的小米糠，過孔徑0.850 mm篩后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要藥品及試劑

濃硫酸、濃鹽酸、丙酮、甲醇、正己烷、石油醚、無水乙醇、硫酸銅、硼酸、十六烷基三甲基溴化銨、氯化鈉、氫氧化鈉、DPPH、福林-酚、硝酸鋁，均為分析純。

1.3 主要儀器與設備

DHG-9023A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；SOX406索式粗脂肪提取儀，濟南海能儀器股份有限公司；DHS-20A水分測定儀；K9840凱式定氮儀、SH220F石墨消解儀，山東海能科學儀器有限公司；JH-14-04可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；SX2-2.5-10W馬弗爐，上海一恒科學儀器有限公司；JP-040超聲波清洗機，深圳市潔盟清洗設備有限公司；ME204分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JM-B-2002電子天平，余姚市紀銘稱重有限責任公司。

1.4 小米糠中營養(yǎng)成分的測定

1.4.1 纖維素的測定

參照GB/T 9822—2008[9]的方法。

1.4.2 蛋白質(zhì)的測定

參照GB/T 5511—2008[10]的方法。

1.4.3 粗脂肪的測定

參照GB/T 5512—2008[11]的方法。

1.4.4 水分的測定

參照GB/T 5497—1985[12]的方法。

1.4.5 灰分的測定

參照GB/T 5505—2008[13]的方法。

1.4.6 多酚含量的測定

參考何志勇等[14]的方法。以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，做標準曲線?；貧w方程為A=1.313 1C-0.028 5，R2=0.996 7，通過標準曲線計算上清液中多酚的質(zhì)量分數(shù)，試驗重復3次。

1.4.7 多糖的測定

參照DB 22/T 2274—2015[15]的方法進行測定。

1.4.8 黃酮的測定

首先制作蘆丁標準曲線，以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線?；貧w方程為A=0.033 9C-0.001，R2=0.996 7，測樣品在510 nm處的吸光度，通過標準曲線計算出上清液中黃酮的質(zhì)量分數(shù)，試驗重復3次。

1.5 小米糠游離酚提取工藝

稱取Mg脫脂小米糠，按料液比1∶10（g/mL）加入70%乙醇，在40 ℃，300 W條件下超聲提取40 min。抽濾得到提取液1，準確量取濾液體積，將濾渣按料液比1∶6（g/mL）重新加入70%乙醇，超聲條件不變，結束后抽濾得提取液2；合并兩次提取液，記錄提取液總體積V，濾渣自然風干，采用1.4.6小節(jié)方法計算游離酚的質(zhì)量分數(shù)，按式（1）計算得率X。

式中：Y為提取液中游離酚的質(zhì)量分數(shù)，%；V為提取液的總體積，mL；M為小米糠原料的質(zhì)量，g。

1.6 小米糠結合酚的提取工藝

1.6.1 單因素試驗

精確稱取濾渣（由1.5小節(jié)得到的）于錐形瓶中，選取提取時間（20，30，40，50和60 min）、提取溫度（20，30，40，50和60 ℃）、料液比（1∶6，1∶8，1∶10，1∶12和1∶14 g/mL）、NaOH濃度（1，2，3，4和5 mol/L）四個因素，考察各單因素在超聲提取時對結合酚得率（計算方法同游離酚）的影響。提取時間40 min、提取溫度40 ℃、NaOH濃度3 mol/L、料液比1∶10（g/mL）為每個單因素除自身以外的固定值。

1.6.2 正交試驗優(yōu)化

由單因素試驗結果可知，4個因素對小米糠中結合酚得率均有一定的影響，因此選擇料液比、提取溫度、提取時間、NaOH濃度4個因素，以結合酚得率為指標，研究4個因素相互之間的影響關系，按L9(34)設計正交試驗，見表1。

表1 正交試驗設計表

1.7 游離酚與結合酚清除DPPH·自由基能力測定

用甲醇將游離酚與結合酚粗提物樣品稀釋至不同濃度，每個濃度的樣品取0.3 mL加入試管中，加入2.7 mL 60 μmol/L的DPPH甲醇溶液，室溫避光反應30 min，于518 nm測定吸光度。以含有0.3 mL甲醇和2.7 mL DPPH溶液為空白樣品，以VC作為陽性對照，所有試驗重復3次。按式（2）計算DPPH·自由基清除率。

式中：A0為DPPH空白對照的吸光度；As為樣品與DPPH反應后的吸光度。

1.8 小米糠結合酚結構鑒定

1) 色譜條件：Innovation Ultimate C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速0.2 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量5 μL；檢測波長325 nm；流動相A為水-甲醇=99.5∶0.5（V/V）；流動相B為水-乙腈-甲醇=19.5∶80∶0.5（V/V）。流動相洗脫程序：50 min內(nèi)B由6%升高至50%；5 min內(nèi)B由50%降低至6%；6%B維持5 min，共60 min。

2) 質(zhì)譜條件：離子源（ESI）噴霧電壓3 500 V；負離子模式掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000；干燥氣和霧化氣為氮氣；干燥氣流9 mL/min；霧化氣壓力40.0 psi；離子源溫度300 ℃。

2 結果與分析

2.1 不同縣區(qū)小米糠中的營養(yǎng)成分

不同縣區(qū)小米糠中各成分質(zhì)量分數(shù)的不同與各地氣候、溫度、濕度、施肥量等有關。由表2可知，小米糠中粗纖維質(zhì)量分數(shù)較高，均在49%以上，其中石樓縣小米糠中粗纖維質(zhì)量分數(shù)最高，為58.42%，可作為動物飼料為其提供豐富的膳食纖維。小米糠中蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)與王燈等[16]研究結果一致。武鄉(xiāng)縣小米糠脂肪質(zhì)量分數(shù)達到9.10%，石樓縣位居第二，為8.83%，可作為開發(fā)米糠油的備選原料，米糠油穩(wěn)定性較弱，應加強小米糠的儲藏管理，陳一等[17]研究表明低于4 ℃有利于小米糠中粗脂肪的保存。小米糠水分質(zhì)量分數(shù)均在6%～8%之間，除武鄉(xiāng)和沁縣以外，其他縣區(qū)小米糠水分質(zhì)量分數(shù)較穩(wěn)定，在6.5%左右，這可能是由于山西省南北降雨量不一致導致的。小米糠灰分質(zhì)量分數(shù)整體來看相差較小，質(zhì)量分數(shù)在6.60%～7.14%之間。各地小米糠游離酚質(zhì)量分數(shù)大致在0.4%～0.7%之間，其中石樓縣小米糠游離酚質(zhì)量分數(shù)最高，達到0.72%，游離酚質(zhì)量分數(shù)的高低與其抗氧化活性相關。多糖和黃酮質(zhì)量分數(shù)以石樓縣小米糠最高，分別為2.88%和0.59%。小米糠游離酚、多糖、黃酮這3種物質(zhì)集抗氧化、免疫、預防各種慢性病等各種功效，是保健品、藥品開發(fā)的首選原料。綜合考慮，后續(xù)以石樓縣小米糠為原料進行結合酚提取工藝的研究。

表2 不同縣區(qū)小米糠的營養(yǎng)成分質(zhì)量分數(shù)

2.2 小米糠結合酚的提取工藝

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 提取時間

由圖1可知，隨著提取時間的延長，結合酚得率先升高后降低。當提取時間為40 min時，結合酚得率顯著高于其他提取時間，為1.867%，提取時間再增加，結合酚得率反而下降，可能是因為結合酚已經(jīng)完全溶出，提取時間增長，結合酚得率不會再增加，還可能會由于熱效應導致其氧化分解成其他物質(zhì)導致得率下降，因此選擇40 min為最優(yōu)提取時間。

圖1 提取時間對結合酚得率的影響

2.2.1.2 提取溫度

由圖2可知，在提取時間、NaOH濃度、料液比不變的條件下，結合酚得率在一定范圍內(nèi)隨提取溫度的升高而增加，當提取溫度達到30 ℃時，結合酚得率最高，為1.893%，這可能是由于隨著溫度升高，溶劑與溶質(zhì)間的分子運動增強，料液充分接觸使結合酚溶出增加；繼續(xù)升高溫度，結合酚的得率反而下降，這可能是由于溫度過高，溶劑部分汽化，料液接觸變小，且結合酚已基本溶出，再升高溫度可能會導致結合酚氧化或分解使其得率下降。因此，選擇30 ℃為最適宜提取溫度。

圖2 提取溫度對結合酚得率的影響

2.2.1.3 料液比

由圖3可知，提取溶劑與材料之間的料液比顯著影響結合酚得率。隨著料液比的增大，提取溶劑和材料充分接觸使得結合酚的得率呈現(xiàn)增加趨勢，在料液比1∶10（g/mL）時得率最高，為1.903%；當料液比繼續(xù)增大時，結合酚得率反而下降，這可能是由于結合酚已完全溶出，再增加料液比其他雜質(zhì)的溶出導致結合酚得率降低。在實際生產(chǎn)過程中，料液比與生產(chǎn)效益呈正相關，溶劑用量越大，相對效益越低。因此，料液比選擇1∶10（g/mL）最適宜。

圖3 料液比對結合酚得率的影響

2.2.1.4 NaOH濃度

由圖4可知，隨著NaOH濃度的增加，結合酚得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當NaOH濃度為4 mol/L時，結合酚的得率達到最大，為1.918%，說明適宜的NaOH濃度可促進結合酚的溶出；當濃度繼續(xù)增加時，結合酚的得率反而下降。因此，NaOH濃度選擇4 mol/L最適宜。

圖4 NaOH濃度對結合酚得率的影響

2.2.2 正交試驗優(yōu)化

由表3可知，各因素對結合酚提取率的影響主次順序為提取溫度＞NaOH濃度＞提取時間＞料液比。結合酚的最優(yōu)提取條件為A3B2C1D2，即NaOH溶液4 mol/L，料液比1∶8（g/mL），提取溫度30 ℃，提取時間50 min。

表3 正交試驗結果

2.2.3 優(yōu)化工藝條件驗證試驗

為了驗證優(yōu)化工藝的可靠性與穩(wěn)定性，采用正交試驗得到的最優(yōu)提取條件進行3次驗證試驗。結果表明，3組平行試驗小米糠結合酚得率平均值為1.935%，相對標準偏差δRSD為0.30%，表明通過正交試驗優(yōu)化的最優(yōu)條件可行性較高。

2.3 小米糠游離酚與結合酚清除DPPH·自由基能力比較

如圖5所示，小米糠游離酚和結合酚清除DPPH·自由基的能力均隨提取物質(zhì)量濃度的增加而增大，當提取物濃度為6 g/L時，小米糠游離酚和結合酚的清除能力可達80.45%和66.43%，但均低于同等濃度下VC的清除率（93.26%）。同時，同濃度下小米糠游離酚清除DPPH·自由基的能力強于小米糠結合酚。

圖5 小米糠游離酚和結合酚及VC清除DPPH·自由基的比較

2.4 小米糠結合酚結構鑒定結果

通過小米糠結合酚化合物的離子流色譜圖，采用HPLC-ESI-MS進行定性分析，試驗質(zhì)譜分析采用（-）離子模式，各小米糠結合酚化合物的相對分子質(zhì)量即為質(zhì)荷比值加1，由此得到小米糠結合酚中各化合物的相對分子質(zhì)量。通過與相關文獻進行比對，并參考國內(nèi)外相關文獻，可初步推斷小米糠結合酚組成成分。主要峰所對應的質(zhì)譜圖如圖6～圖9所示，采用質(zhì)譜分析方法，通過高分辨質(zhì)譜擬合的分子式，對其質(zhì)荷比和相對分子質(zhì)量進行測定。

由圖6和圖7可知，物質(zhì)A的保留時間為4.01 min，質(zhì)量-電荷比為m/z121.03，高分辨質(zhì)譜擬合的分子式為C7H6O2。根據(jù)數(shù)據(jù)庫檢索和文獻報道[18]，推測該化合物為對羥基苯甲醛。

圖6 小米糠結合酚的液質(zhì)聯(lián)用色譜圖

圖7 小米糠結合酚A物質(zhì)的質(zhì)譜圖

由圖6和圖8可知，物質(zhì)B的保留時間為5.03 min，質(zhì)量-電荷比為m/z163.04，高分辨質(zhì)譜擬合的分子式為C9H7O3。根據(jù)數(shù)據(jù)庫檢索文獻報道[19]，推測該化合物為4-香豆酸。

圖8 小米糠結合酚B物質(zhì)的質(zhì)譜圖

由圖6和圖9可知，物質(zhì)C的保留時間為7.61 min，質(zhì)量-電荷比為m/z187.10，高分辨質(zhì)譜擬合的分子式為C7H8O6。根據(jù)數(shù)據(jù)庫檢索文獻報道[20]，推測該化合物為沒食子酸-水合物。

圖9 小米糠結合酚C物質(zhì)的質(zhì)譜圖

3 結論

通過比較山西省7個縣區(qū)晉谷21號谷子加工產(chǎn)生的小米糠中營養(yǎng)物質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)，其中活性物質(zhì)黃酮、游離酚均以石樓縣的質(zhì)量分數(shù)最高，進而以其為原料，通過單因素試驗和正交試驗得到小米糠結合酚的最佳提取工藝條件：料液比1∶8（g/mL）、提取溫度30 ℃、NaOH濃度4 mol/L、提取時間50 min，此時結合酚得率為1.935%；提取物具有較強的抗氧化活性，6 g/L時DPPH·自由基清除能力可達66.43%；通過HPLC-ESI-MS得出，小米糠結合酚中主要含有對羥基苯甲醛、4-香豆酸和沒食子酸-水合物。小米糠不僅營養(yǎng)豐富，且富含多酚等抗氧化活性物質(zhì)，具有開發(fā)為一種新型抗氧化劑的潛力。