破格救心湯加減對心力衰竭模型大鼠心肌能量代謝的干預作用及機制研究*

王月峰，張翠利，張?zhí)鞐?，趙小順

(1.新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院藥學部，河南 新鄉(xiāng) 453000； 2.黃河科技學院醫(yī)學院，鄭州 450063)

心力衰竭是指由于心臟的收縮功能或舒張功能障礙，不能將靜脈回心血量充分排出心臟，引發(fā)靜脈系統(tǒng)血液瘀積，動脈系統(tǒng)血液灌注不足，最終導致心臟循環(huán)障礙的一種疾病，此病表現(xiàn)為肺瘀血、腔靜脈瘀血[1]。研究認為，心力衰竭的發(fā)生與心肌細胞凋亡、心肌能量代謝相關，此病發(fā)生后心肌能量代謝顯著降低，雖然已經(jīng)有研究證實心力衰竭與心肌能量代謝相關，但其具體作用機制尚不完全明確，僅有研究顯示[2-3]，心肌能量代謝與能量代謝底物的利用、氧化磷酸化所產(chǎn)生的能量以及能量ATP的轉(zhuǎn)運、利用有關。臨床常規(guī)西醫(yī)治療心力衰竭并不能完全治愈，部分患者預后復發(fā)率較高，目前逐漸將關注熱點轉(zhuǎn)移至中醫(yī)藥治療此病上。中醫(yī)學認為心力衰竭屬于“驚悸”“心痹”等范疇，治療此病應重視扶陽，以溫陽利水為治療原則[4]?；谏鲜霰尘?，在本文中將破格救心湯加減應用于心力衰竭模型中，以分析對大鼠心肌能量代謝的影響及具體作用機制，明確破格救心湯加減治療心力衰竭的作用機制，為破格救心湯臨床加減在心力衰竭治療中提供參考。本研究已通過我院實驗動物倫理委員會審查，倫理委員會批號WYZLL[2019]1601。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取SPF級SD健康大鼠30只，鼠齡(3.9±0.6)個月，體質(zhì)量(225.8±11.5)g，雌雄各半，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所提供，實驗動物號SCXK(京)2019-0011，所有大鼠均于我院清潔級實驗動物房適應性飼養(yǎng)1周，5只/籠，采用光照定時裝備，提供晝夜光變化周期(12 h光照，12 h黑暗)，溫度為20～23 ℃，相對濕度為40%～60%，以清潔木屑為墊料，使用標準飼料飼養(yǎng)，自由飲水進食。

1.2 主要試劑

小鼠抗大鼠SIRT1抗體(品牌：Abnova，貨號MAB21871)艾美捷科技有限公司；兔抗大鼠PGC-1α抗體(上海恒斐生物科技有限公司，品牌：CST，貨號PGC1α Antibody)，Na+-K+-ATP酶 ELISA試劑盒(上海圻明生物科技有限公司，品牌：KA&M-BIO，貨號mEA-R31772)，Ca+-ATP酶 ELISA試劑盒(上海振譽生物科技有限公司，品牌：elabscience，貨號E-EL-M0209 km)。

1.3 分組與建模

隨機選取10只大鼠作為空白組，另外20只大鼠參照Ahemed LA等[5]研究方法，將阿霉素配制成2 mg/mL的溶液，連續(xù)6周注射于大鼠腹腔(4 mg/kg)建立慢性心力衰竭大鼠模型。造模結(jié)束后，使用10%水合氯醛麻醉大鼠，使大鼠仰臥在操作臺上，固定并剃除胸前區(qū)毛發(fā)，測定左心室射血分數(shù)(LVEF)，左心射血分數(shù)<60%則表示心力衰竭大鼠模型建立成功。將建模成功的20只大鼠隨機分為模型組、給藥組各10只。

1.4 給藥

破格救心湯加減組方：附子150 g，山萸凈肉120 g，炙甘草、干姜各60 g，生龍牡粉、活磁石粉、高麗參(另煎)各30 g，黃芪20 g，丹參15 g，枳殼9 g，麝香(沖)0.5 g。上述藥物組成破格救心湯加減組方，加水2000 ml使用文火煎煮，取400 ml。造模成功后給藥組大鼠使用10 mL/kg破格救心湯加減灌胃，空白組和模型組使用等劑量生理鹽水灌胃，每天2次，連續(xù)治療6周。

1.5 切片及染色

隨機選取各組中1只大鼠斷頭立即取出心肌組織，40 mL/L的多聚甲醛固定，常溫下使用15%的EDTA脫鈣，脫水后行石蠟包埋，制作3 μm的組織切片，行HE染色處理，使用光學顯微鏡觀察大鼠心肌組織病理表現(xiàn)。

1.6 心功能檢測

隨機選取各組中4只大鼠10%水合氯醛麻醉，剃除局部毛發(fā)，使用高分辨率小動物超聲系統(tǒng)測定3組大鼠左心室舒張內(nèi)徑(LVEDD)、收縮末內(nèi)徑(LVESD)、LVEF以及左心室短軸縮短率(FS)，測量連續(xù)完整的4個心動周期，取平均值并同時記錄大鼠心率(HR)。

1.7 血流動力學檢測

在大鼠完成心功能檢測后，分離大鼠右側(cè)頸動脈，插入連接高精度壓力換能器的PE-50型聚乙烯心導管至大鼠左心室，對3組大鼠左心室收縮末壓(LVESP)、舒張末壓(LVEDP)以及左心室內(nèi)壓上升、下降速率(±dp/dt)進行檢測。檢測完成后將3mL10%氯化鉀液注射于大鼠靜脈中，促使大鼠心臟在舒張末期停止搏動，之后迅速打開胸腔取出心臟，冷生理鹽水沖洗后，將心臟外結(jié)締組織、大血管以及心房取出，將右心室沿室間隔剪去，濾紙吸干后稱取左心室質(zhì)量(LVAM)，計算左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)：LVMI=LVMI/大鼠體質(zhì)量。

1.8 心肌能量代謝指標檢測

取各組中剩余的5只大鼠斷頭法處死，迅速取出心肌組織冰上剪碎，行超聲裂解，4 ℃ 13500 r/min離心30 min取上清液，按照試劑盒操作說明檢測大鼠心肌組織中Na+-K+-ATP酶、Ca+-ATP酶活性，按每小時每毫克心肌組織內(nèi)ATP酶催化ATP時所釋放的1μmoL無機磷作為單個ATP酶的計量單位。使用ELISA方法檢測3組大鼠心肌組織中ATP、AMP、FFA含量。

1.9 SIRT1/PGC-1α通路蛋白檢測

Western blot法檢測3組大鼠心肌組織中SIRT1/PGC-1α通路蛋白表達。將采集到的標本研磨后加入蛋白緩沖液常規(guī)蛋白提取，BCA法進行定量分析。50μg的蛋白樣品上樣，SDS-PAGE電泳，通過蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜，在5%的脫脂奶粉TBST中避光封閉1 h，洗滌后加一抗稀釋溶液(SIRT1、PGC-1α按照1∶1000比例進行稀釋)，4 ℃過夜，洗滌后加二抗稀釋溶液(SIRT1、PGC-1α按照1∶5000比例進行稀釋)，溫床中孵育1 h后再次洗滌，加入發(fā)光液ECL，曝光2～3次取重疊值。使用軟件分析蛋白條帶灰度值，將GAPDH設置為內(nèi)參蛋白。

1.10 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 病理組織學觀察

圖1示，空白組大鼠心肌纖維排列整齊，心肌細胞形態(tài)、大小正常。模型組大鼠心肌纖維排列較為混亂，心肌細胞間質(zhì)、管壁外明顯可見有炎細胞浸潤，心肌細胞增大。給藥組心肌纖維排列相比較模型組整齊，部分心肌細胞形態(tài)、大小恢復正常，心肌細胞間質(zhì)、管壁外僅有少量炎細胞浸潤。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色比較(×100)

2.2 破格救心湯加減對大鼠心功能的影響

表1示，模型組大鼠LVEDD、HR高于空白組，LVEDD、LVEF、FS低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；給藥組大鼠LVEDD、HR低于模型組，LVEDD、LVEF、FS高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 破格救心湯加減對大鼠心功能的影響

2.3 破格救心湯對大鼠血流動力學的影響

表2示，模型組大鼠LVMI、LVEDP高于空白組，+dp/dt、-dp/dt低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；給藥組大鼠LVMI、LVEDP低于模型組，+dp/dt、-dp/dt高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 破格救心湯對大鼠血流動力學的影響

2.4 破格救心湯加減對大鼠心肌能量代謝的影響

表3示，模型組大鼠心肌組織中ATP含量、Na+-K+-ATP酶、Ca+-ATP酶活性低于空白組，AMP、FFA、AMP/ATP高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；給藥組大鼠心肌組織中ATP含量、Na+-K+-ATP酶、Ca+-ATP酶活性高于模型組，AMP、FFA、AMP/ATP低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 破格救心湯加減對大鼠心肌能量代謝的影響

2.5 破格救心湯加減對大鼠心肌組織中SIRT1/PGC-1α通路蛋白的影響

表4圖2示，模型組大鼠心肌組織中SIRT1、PGC-1α蛋白表達量低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；給藥組大鼠心肌組織中SIRT1、PGC-1α蛋白表達量高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 破格救心湯加減對大鼠心肌細胞中SIRT1/PGC-1α通路蛋白的影響

圖2 Sirt1/PGC-1α通路蛋白WB條帶圖

3 討論

中醫(yī)認為心力衰竭屬于“水腫”“驚悸”“喘癥”“心痹”等范疇?！督饏T要略》中記載有“心水”病證，認為本虛標實為其病機，是由心氣虛發(fā)展成為心陽虛、心陰虛以及心陰陽兩虛等，而水飲、痰、瘀為標實，治療心力衰竭應重視扶陽，并以溫陽利水為治療原則。破格救心湯源于《傷寒論》，由附子、干姜、炙甘草、高麗參或紅參、生山茱萸肉、生龍骨、生牡蠣、磁石、麝香等組成，方中破格重用附子、麝香、山萸凈肉，能在急性心力衰竭陽脫陰竭之時扶正固脫、回陽救逆、益陽和陰、開竅醒神并挽救生命[6-8]。本文研究顯示，與空白組比較，心力衰竭模型大鼠心肌組織出現(xiàn)顯著的病理表現(xiàn)，且心功能、血流動力學均表現(xiàn)異常，但運用破格救心湯加減治療后的心力衰竭大鼠病理損傷得到顯著恢復，心功能、血流動力學均得到顯著改善。此結(jié)果說明破格救心湯加減可有效修復心力衰竭大鼠病理損傷，改善心功能和血流動力學。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，當心力衰竭發(fā)生后心肌能量代謝異常，其利用物發(fā)生改變，由利用脂肪酸變?yōu)槭紫壤闷咸烟牵笠l(fā)游離狀脂肪酸堆積。一方面抑制線粒體、胞質(zhì)酶體系、肌質(zhì)網(wǎng)等活性，損傷線粒體功能、呼吸鏈；另一方面抑制糖酵解，兩方面相互作用加劇心肌能量代謝障礙[9-11]。另外研究顯示[12]，心肌能量代謝異常后心力衰竭患者機體脂肪酸代謝作用會明顯下降，雖然在每克脂肪酸的代謝過程中會有較多的ATP產(chǎn)生，但此過程會消耗大量的氧影響糖酵解，當脂肪酸在缺氧的條件下發(fā)生氧化作用后，會對機體乳酸的形成產(chǎn)生促進作用，進而導致心肌細胞內(nèi)H+濃度的異常升高，引發(fā)心肌細胞內(nèi)Na+、Ca+的超負荷，進而加劇細胞損傷程度，最終導致心功能障礙。本文研究結(jié)果顯示，與空白組比較，心力衰竭模型大鼠ATP含量、Na+-K+-ATP酶、Ca+-ATP酶活性降低，而AMP、FFA含量升高，但運用破格救心湯加減之后的心力衰竭大鼠ATP含量、Na+-K+-ATP酶、Ca+-ATP酶活性均升高，而AMP、FFA含量降低，此結(jié)果說明破格救心湯加減通過增加Na+-K+-ATP酶、Ca+-ATP酶活性改善心肌能量代謝。

SIRT1屬于一種酵母染色質(zhì)沉默子SIRT2的同源體1，是第三類組蛋白去乙?；窼irtuins家族的重要成員，一方面與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、沉默、細胞生長周期有關，另一方面SIRT1還可對心肌細胞能量代謝、細胞自噬、細胞死亡、血管生成等過程具有調(diào)節(jié)作用[13]。PGC-1α能夠?qū)€粒體生物合成產(chǎn)生促進作用，增強有氧呼吸，并與線粒體所參與的新陳代謝、心臟能量的生成過程有關[14]。SIRT1能夠通過乙?；饔脤GC-1α激活，促進線粒體生物合成，對線粒體功能進行調(diào)節(jié)，進而對心肌細胞能量障礙、心臟收縮、舒張功能進行調(diào)控，最終起到保護心肌的作用，說明SIRT1/PGC-1α通路所調(diào)控能量代謝在心血管疾病中有著重要的作用[15-16]。在本文研究中，對大鼠心肌組織中SIRT1/PGC-1α通路蛋白進行檢測，結(jié)果顯示運用破格救心湯加減治療后，心力衰竭大鼠SIRT1/PGC-1α通路蛋白的異常表達顯著得到改善，此結(jié)果說明破格救心湯加減可能是通過作用于SIRT1/PGC-1α通路，增加Na+-K+-ATP酶、Ca+-ATP酶活性，最終起到改善心肌能量代謝的作用。

綜上所述，破格救心湯加減可顯著改善心力衰竭大鼠心功能及心肌能量代謝，其機制可能與作用于SIRT1/PGC-1α信號通路，通過增加SIRT1活性對PGC-1α所介導的線粒體能量代謝有關。但因本文研究樣本量較少，統(tǒng)計數(shù)據(jù)及研究結(jié)果可能會存在一定的偏倚，因此還需臨床后續(xù)研究進一步證實。