187份玉米自交系抗旱性評價及SSR標記關聯分析

鐘 源,趙小強

(甘肅農業(yè)大學甘肅省干旱生境作物學重點實驗室,甘肅 蘭州 730070)

玉米(ZeamaysL.)是全球最為重要的糧食、飼料及經濟能源作物之一，其生產安全對保障國家糧食增產、促進畜牧業(yè)發(fā)展及改善人民生活質量有重要作用。干旱是最為重要的非生物逆境脅迫之一，其嚴重影響玉米的正常生長發(fā)育，使玉米的生理生化代謝紊亂，并最終導致玉米籽粒品質下降和嚴重減產[1-3]。國內外相關研究表明[1,4-6]，干旱脅迫下玉米的株高、穗位高、穗位比、散粉-吐絲時間間隔(anthesis-silking interval, ASI)、雄穗分枝數及雌穗個數等農藝性狀比產量(grain yield, GY)具有更高的遺傳力，這些農藝性狀與玉米的抗旱性緊密相關，更適合作為玉米抗旱性鑒定的參考指標。目前CIMMITY (Centro Internacional de Mejoramientode Maizy Trigo)[7]和新疆農業(yè)科學院[8]等單位已選用上述抗旱相關農藝性狀在田間篩選出了一系列玉米優(yōu)良抗旱種質資源。此外，玉米的抗旱性是由少數主基因加多個微效基因或修飾基因共同調控，同時還顯著受環(huán)境及基因型與環(huán)境互作的影響，呈典型的數量性狀遺傳特征[9-11]。借助分子標記技術挖掘玉米這些抗旱相關農藝性狀的功能基因/數量性狀位點 (quantitative trait locus, QTL)或緊密連鎖的分子標記是進行玉米抗旱分子標記輔助選擇(marker-assisted selection, MAS)育種的基礎，是遺傳改良提高玉米抗旱性能的重要途徑。

近年來諸多學者已在多種水旱環(huán)境下對玉米的株高、穗位高、穗位比、ASI、雄穗分枝數及雌穗個數進行了QTL定位。Zhao等[1]采用CIM (composite interval mapping)法以Langhuang×TS141和Chang7-2×TS141構建了2套F2∶3群體在8種水旱環(huán)境下定位到了10個穗位比QTL，其主要位于玉米的第1、2、4、5、6、8和9號染色體上。吳建偉等[12]以A188×91黃15構建了1套F2∶3群體在水分脅迫環(huán)境下檢測到了10個QTL與株高和穗位高相關，并在8號染色體上檢測到了1個同時調控株高和穗位高的主效QTL。趙小強等[13]以TS141為共同父本，廊黃和昌7-2分別為母本開發(fā)了2套F2群體，在玉米的株高、穗位高、穗位比、ASI及雄穗分枝數等性狀間分別檢測到了11、10、9、9和8個QTL，其中株高和穗位比均受基因的加性、部分顯性及顯性遺傳效應控制，穗位高受基因的部分顯性、顯性及超顯性遺傳效應控制，ASI受基因的顯性和超顯性遺傳效應控制，雄穗分枝數受基因的加性、部分顯性及超顯性遺傳效應控制。甚至，Zhao等[4]通過整合51種不同水旱環(huán)境下19套玉米F2、F2∶3、F3、RIL (recombinant inbred lines)及BC1S1(backcross-self cross population)群體中調控雄穗分枝數和雌穗個數的QTL信息，采用meta-QTL (mQTL)分析檢測到了20個mQTL，并挖掘到了34個調控玉米花序發(fā)育的候選基因。從這些研究不難看出，由于不同學者所采用試驗群體的遺傳背景、大小、類型、檢測環(huán)境及QTL定位方法不同，導致所檢測到的與這些抗旱相關的農藝性狀的QTL信息不僅在QTL數量與遺傳效應方面，而且在對環(huán)境的穩(wěn)定性方面均存在較大差異，其反映出了玉米這些性狀遺傳基礎的復雜性，如若獲得廣泛認可的結論尚需更深入的研究。

關聯分析也稱為連鎖不平衡作圖，它是利用分子標記對供試群體候選基因進行檢測或掃描，進而獲得豐富的基因位點及其等位基因信息，并在大量群體材料中鑒定出與目標性狀間存在正向貢獻的優(yōu)異等位基因的方法[14]。目前，Ducrocq等[15]在玉米、張娜等[16]在小麥(TriticumaestivumL.)、董俊杰等[17]在水稻(OryzasativaL.)及Sun等[18]在大麥(HordeumvulgareL.)等作物利用此方法對重要性狀基因進行挖掘。本研究擬在不同水旱環(huán)境處理下田間鑒定187份供試玉米自交系的株高、穗位高、穗位比、雄穗分枝數ASI及雌穗分枝數的變化，綜合評價其抗旱性強弱；采用SSR (simple sequence repeats)標記技術和GLM (general linear model)關聯分析尋找不同水旱環(huán)境下與玉米這些性狀緊密連鎖的SSR標記，以期為玉米抗旱MAS育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以甘肅省干旱生境作物學重點實驗室收集及自育的187份玉米自交系為試材。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米農藝性狀田間鑒定 于2017年4月中旬至9月下旬在甘肅省農業(yè)科學院黃羊鎮(zhèn)麥類作物育種試驗站(37.97°N, 102.63°E; 海拔1 508 m)進行試驗。玉米生育期4—9月試驗地的氣象數據見圖1。試驗參照Zhao等[5]和趙小強等[19]方法均設正常供水 (CK)及干旱脅迫處理(S)，其中CK處理為玉米全生育期內只要降水不足時就及時供水，而S處理在玉米大喇叭口前期至花期結束不供水，其他生育時期每隔20 d供水1次。每一處理均采用完全隨機區(qū)組設計，3次重復，相應供試材料為單行區(qū)，行長5 m，株距25 cm，行距40 cm。播前統(tǒng)一整地、施肥并采用平膜覆蓋試驗地，其他管理同一般大田。花后第10 d每一處理相應供試自交系中選擇長勢整體一致的植株10株，參照Zhao等[4]及趙小強等[13]方法測定其株高(PH)、穗位高(EH)、雄穗分枝數(TBN)、ASI和雌穗個數(EN)，并計算穗位比(EHPH)，即：

EHPH=EH/PH

(1)

干旱脅迫環(huán)境下單個性狀的變化率(RC)[9]按以下公式計算， 即：

RC=(1-Ts/Tw)×100%

(2)

式中，Ts和Tw分別為干旱脅迫和正常供水環(huán)境下相應性狀的測定值。相應性狀的抗旱系數(DRC)[1]按以下公式計算，即：

DRC=Ts/Tw

(3)

以每一性狀的DRC作為抗旱性評價指標，利用

模糊隸屬函數法對抗旱性綜合評價，即：

Uij=(DRCij-DRCjmin)/(DRCjmax-DRCjmin)

(4)

或Uij=1-(DRCij-DRCjmin)/(DRCjmax-DRCjmin)

(5)

式中，Uij為第i個材料第j個指標的抗旱性隸屬值，DRCij為第i個材料第j個指標的抗旱系數，DRCjmax為所有材料中第j個指標抗旱系數的最大值，DRCjmin為所有材料中第j個指標抗旱系數的最小值。若所測性狀與自交系的抗旱性正相關，用(4)式計算隸屬值，反之則用(5)式。累加各指標的隸屬值并計算均值后進行比較，均值越大則自交系的抗旱性越強。采用統(tǒng)計軟件IBM SPSS 19.0對不同水分處理下的所有性狀進行描述性統(tǒng)計分析、聯合方差分析及Pearson相關分析。參照Knapp等[21]的方法估算相應性狀的廣義遺傳力(H2)，即

H2=VG/(VG+VGE/n+Ve/nr)×100%

(6)

式中，VG為基因型方差，VGE為基因型與環(huán)境互作方差，Ve為誤差，n為環(huán)境個數，取值2，r為重復數，取值10。

1.2.2 SSR標記關聯分析 參照趙小強[20]方法提取187份供試自交系幼苗的全基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，紫外分光光度計檢測DNA濃度并稀釋至50 ng·μL-1，-20℃低溫保存?zhèn)湓囼炈琛腗aizeGDB (Maize Genome Database)數據庫網站(http://www.maizegdb.org/)中選取均勻分布于玉米10個連鎖群且多態(tài)性較好的SSR標記145個，參照趙小強[20]方法進行PCR擴增、聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染。采用Structure 2.3.1 (http://pritch.bsd.uchicago.edu/structure.html)軟件進行群體遺傳結構分析，估計最佳群體組群數K(K設為1～10)，將MCMC (markov chain monte carlo)開始的不作數迭代參數定為10 000次，再將不作數迭代后的burn-in period設為100 000次，number of iterations設為8，計算Q參數，將其作為協變量。采用Tassel 2.1 (https://sourceforge.net/projects/tassel/files/latest/download)軟件的GLM進行關聯分析。GLM分析中，以不同玉米自交系的對應Q值作為協變量，將SSR標記與不同水旱處理下的株高、穗位高、穗位比、雄穗分枝數、ASI及雌穗個數間進行回歸分析，檢測與其相關聯的標記，并計算解釋率。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對玉米自交系6個農藝性狀的影響

187份玉米自交系的株高、穗位高、穗位比、雄穗分枝數、ASI及雌穗個數均在基因型間差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)，不同處理下其變異系數介于7.31%～62.16%(表1和圖2)。說明不同玉米自交系的這6個農藝性狀間差異顯著，其在這些農藝性狀方面存在豐富的遺傳變異。187份玉米自交系的6個農藝性狀在水分環(huán)境間也在P<0.05或P<0.01水平達到了差異顯著，干旱脅迫下187份玉米自交系除ASI顯著增大外，其余5個性狀均明顯降低，且干旱脅迫下這些自交系的株高、穗位高、穗位比、雄穗分枝數及雌穗個數分別下降了4.68%、4.63%、10.87%、11.96%、11.91%，而其ASI升高了72.73%(表1和圖2)。表明玉米的這6個農藝性狀明顯受水分環(huán)境的影響，其可作為玉米抗旱性評價的重要參考指標。187份玉米自交系的這6個性狀還在基因型與水分環(huán)境互作間差異顯著或極顯著。說明玉米這6個農藝性狀的大小還明顯受其本身的遺傳基因型與水分環(huán)境互作的影響。此外，不同水分環(huán)境下187份玉米自交系的這6個農藝性狀的偏度和峰度基本介于-1.0～1.0之間，呈典型的數量遺傳特性，且這些性狀的廣義遺傳力均較大，介于60.57%～86.03%(表1和圖2)。

表1 不同水旱環(huán)境下供試玉米自交系的6個農藝性狀的表型鑒定

2.2 玉米自交系6個農藝性狀間的相關性分析

由表2可知，187份玉米自交系的株高與穗位高、ASI、雌穗個數均在P<0.01或P<0.05水平下顯著正相關，與穗位比、雄穗分枝數間極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)負相關；穗位高與穗位比、ASI、雌穗個數間呈極顯著或顯著正相關，與雄穗分枝數間呈顯著負相關；穗位比與雄穗分枝數、ASI及雌穗個數間均表現為顯著正相關；雄穗分枝數與ASI間極顯著負相關，與雌穗個數間顯著正相關；ASI與雌穗個數間極顯著正相關。說明玉米的這6個農藝性狀間彼此相互關聯，其相互作用共同構成不同玉米自交系間的差異。

表2 供試玉米自交系6個農藝性狀間的相關分析

2.3 玉米自交系群體的遺傳結構分析

利用Structure 2.3.1軟件對供試玉米自交系進行群體遺傳結構和模型聚類分析。結果表明，當K=1～10時，ΔK在K=5時出現明顯峰值(圖3)，因此可以判定187份玉米自交系可劃分為5大類群。5大類群的遺傳固定指數大于0.05。說明這5大類群均能獨立成群。對照代表性自交系可知，這5大類群分別為LRC(紅色)、TSPT(綠色)、Lan(粉色)、P(黃色)及Reid (藍色)類群等(圖3)。

2.4 玉米自交系抗旱性綜合評價

進一步采用187份玉米自交系株高、穗位高、穗位比、ASI、雄穗分枝數及雌穗個數等6個農藝性狀的抗旱系數作為不同玉米自交系抗旱性強弱評價指標，并采用隸屬函數法綜合評價這些供試玉米自交系的抗旱性強弱。結果表明，根據隸屬值的大小將187份玉米自交系劃分為強抗旱自交系(隸屬值>0.66)、中等抗旱自交系(隸屬值介于0.34～0.65)及旱敏感自交系(隸屬值<0.34)，其分別為45、74和68份(表3)。

表3 供試玉米自交系抗旱性綜合評價

2.5 不同水旱環(huán)境下玉米6個農藝性狀與SSR標記的關聯分析

采用一般線性模型(GLM)對145個SSR標記位點與不同水旱環(huán)境下玉米的6個農藝性狀進行了關聯分析。結果表明，總共檢測到了13個SSR標記與不同水旱環(huán)境下玉米的株高、穗位高、穗位比、雄穗分枝數、ASI及雌穗個數在P<0.01水平顯著關聯，表型變異的貢獻率介于2.15%～17.13%，其主要位于第1、2、3、4、5、7、8及9號染色體上(表4)。除umc2025 (Bin 1.05)、nc133 (Bin 2.05)及umc1378 (Bin 7.00)與雌穗分枝數、mmc0041 (Bin 1.08)和umc2363 (Bin 2.02)與ASI、umc1662 (Bin 4.05)和umc1194 (Bin 8.02)與穗位高相關聯外，其余6個SSR標記與3～5個農藝性狀間同時相關(表4)。

表4 不同水旱環(huán)境下與玉米6個農藝性狀的SSR標記及其對表型變異的解釋率 (P<0.01)

3 討論與結論

本研究對不同水旱環(huán)境下187份玉米自交系的株高、穗位高、穗位比、雄穗分枝數、ASI及雌穗個數等進行了比較分析發(fā)現，兩種水旱環(huán)境下所有供試玉米自交系的這6個農藝性狀間差異較大，其變異系數介于7.31%～62.16%。說明本研究供試玉米自交系在這6個農藝性狀間存在豐富的遺傳變異。本研究還表明，干旱脅迫環(huán)境下這些玉米自交系的ASI顯著增大，而其余5個性狀均顯著減小，干旱脅迫后這些性狀的變化程度依次為ASI (-72.73%)>雄穗分枝數(11.96%)>雌穗個數(11.91%)>穗位比(10.87%)>株高(4.68%)>穗位高(4.63%)，且這些性狀在不同水旱環(huán)境下的廣義遺傳力均高于60%。這與Zhao等[5]、Cai等[22]、Dong等[23]及Nikolic等[24]的研究相一致，表明干旱缺水會嚴重影響玉米植株的正常生長及生殖器官的發(fā)育并最終導致玉米嚴重減產，因此玉米的株高、穗位高、穗位比、雄穗分枝數、ASI及雌穗個數等可作為玉米抗旱性鑒定的重要參考指標，并可依據這些指標對玉米的抗旱性進行綜合評價。基于以上考慮，本研究還利用這6個農藝性狀進一步計算了其抗旱系數作為相應材料的抗旱性評價指標，借助隸屬函數法對本研究187份自交系的抗旱性進行了綜合評價，并在抗旱隸屬值在大于0.66時篩選出強抗旱自交系45份，這為玉米抗旱新品種培育提供了優(yōu)良的種質材料。

關聯分析是利用分子標記位點或基因間的LD關系來解析分子標記與目標群體表型性狀間的相關性，并最終鑒定出與表型變異緊密相關的基因位點[14]，因此利用此方法可對玉米有關重要數量遺傳性狀進行有效QTL定位。本研究采用GLM模型對兩種水旱環(huán)境下187份玉米自交系的6個農藝性狀進行了關聯分析，在株高(5個)、穗位高(6個)、穗位比(3個)、雄穗分枝數(4個)、ASI (5個)及雌穗個數(4個)間共檢測到了13個相關SSR位點，其主要位于第1、2、3、4、5、7、8及9號染色體上，且單個相關SSR位點的表型貢獻率為2.15%～17.13%。在這些找到的相關SSR位點中，大約85.19%的相關SSR位點可在干旱脅迫環(huán)境下被檢測到。因此，干旱環(huán)境下檢測到的與玉米這6個農藝性狀相關聯的SSR位點為今后玉米抗旱分子遺傳機理的解析及抗旱MAS育種奠定基礎。此外，Tuberosa等[25]認為由于不同性狀間存在共同的遺傳機制，因此“一因多效”或是控制不同性狀的基因普遍呈緊密連鎖的現象，同樣我們在本研究中也檢測到了6個SSR標記(bnlg149、phi053、umc1621a、umc1155、umc1072及umc1120)同時與多個玉米農藝性狀相關，且這與本研究中6個農藝性狀間的Pearson相關分析的結果高度一致，即單個農藝性狀與其余2～5個性狀間呈顯著或極顯著正/負相關。說明玉米染色體的這些SSR位點是共同調控玉米6個農藝性狀的重要區(qū)域，其附近可能存在一些重要調控基因。

其中，位于Bin 1.01處的bnlg149同時與兩種水旱環(huán)境下的穗位高、雌穗個數、正常供水環(huán)境下的株高及干旱環(huán)境下的穗位比間同時連鎖，解釋的表型變異為2.41%～9.07%。玉米的bnlg149-umc1292區(qū)間，Zhao等[5]采用mQTL分析在多種水旱環(huán)境下檢測到了1個同時調控株高、穗位高及穗長的mQTL1-1，并在該mQTL區(qū)間內預測到了SYP121 (syntaxin of plants 121)、MYB31及SPIRAL1等候選基因，且Eisenach等[26]研究指出SYP121調控擬南芥(Arabidopsis)細胞膜上K+通道的轉運及氣孔的開閉。Agarwal等[27]研究表明MYB31是參與玉米抗旱性應答的重要轉錄因子之一。Wang等[28]報道SPIRAL1在擬南芥耐鹽等抗逆性方面扮演重要角色。phi053 (Bin 3.05)位點處同時與兩種水旱環(huán)境下的株高、穗位高、穗位比、ASI及正常供水環(huán)境下的雌穗個數間同時相關，表型貢獻率為2.15%～6.22%。Guo等[29]以5003×P138構建了1套RILs群體，并采用CIM法在phi053位點附近檢測到了多個干旱脅迫環(huán)境下的株高QTL，解釋的表型變異為1.68%～1.97%，還找到了1個QTL位點與正常供水環(huán)境下的ASI相關，其表型貢獻率為3.02%。吳建偉等[30]利用A188×91黃15發(fā)展了1套F2∶3群體，還在Bin 3.04附近的phi265454位點處檢測到了1個主效QTL調控了兩年正常供水處理下的玉米株高，其表型貢獻率分別為7.3%和27.0%，且受基因的部分顯性及顯性遺傳效應的調控。劉忠祥等[31]發(fā)展了1套高代回交重組自交系在玉米的Bin 3.04～3.05/ Bin 3.05～3.06處的bnlg602-SSR5/SSR4-umc2266識別到了1個調控玉米株高的主效QTL，并進一步精細定位將該主效QTL定位到了C42-P17之間的20 Mb內，且該主效QTL是GA (gibberellin)途徑之外的新基因。umc1621a (Bin 4.06)位點處同時與兩種水旱環(huán)境下的雄穗分枝數和雌穗個數及干旱脅迫環(huán)境下的ASI間緊密連鎖，解釋的表型變異為3.62%～4.02%。Zhao等[4]以Langhuang×TS141構建了1套F2:3群體同樣在bnlg1621a-umc2027區(qū)間檢測到了1個與多種水旱環(huán)境調控玉米雌穗個數的QTL，能夠解釋4.73%～19.96%的表型變異，且受基因的加性和部分顯性遺傳效應調控。甚至，Zhao等[4]進一步通過整合51種水旱環(huán)境下構建的19套定位群體也在Bin 4.06處的bnlg1621a-bnlg1784區(qū)間的9.2 Mb內檢測到了1個同時調控玉米雄穗分枝數和雌穗個數的mQTL4-2，并在該mQTL區(qū)間挖掘到了ZAG3和LOXs等候選基因。Wu等[32]研究發(fā)現ZAG3是一種MADS-box基因，其調控玉米花序分生組織和籽粒脂肪原基的發(fā)育。Roychowdury等[33]報道水稻中抑制LOXs基因表達可顯著提高其稻米的品質。標記umc1072 (Bin 5.07)同時與2種水旱環(huán)境下的株高、雄穗分枝數及ASI間顯著關聯，其解釋了2.68%～15.79%的表型變異。Wei等[34]以Zong3×Xu178開展了1套SSSLs (single segment substitution lines)群體在Bin 5.06～5.08的umc1680-bnlg118區(qū)間檢測到了1個調控玉米株高的主效QTL，其受基因超顯性遺傳效應的調控。表明Bin1.01、Bin 3.05、Bin 4.06及Bin 5.07等附近是調控玉米株高、穗位高、穗位比、雄穗分枝數、ASI及雌穗個數的重要“一因多效”或富集位點，且這些區(qū)域存在一些重要調控基因，為不同水分環(huán)境下玉米這些農藝性狀的生長發(fā)育發(fā)揮重要的積極效應。另外，本研究還檢測到了2個新的SSR位點與不同供水環(huán)境下的玉米農藝性狀顯著關聯，分別是位于位點umc1155 (Bin 5.05)處同時與正常供水環(huán)境下的株高和穗位高相關聯，可解釋4.11%～13.25%的表型貢獻，及位于umc1120(Bin 9.04)位點同時與2種水旱環(huán)境下的株高、穗位高及穗位比間顯著連鎖，解釋的表型變異為3.10%～4.73%，這2個顯著連鎖的SSR可為不同水旱環(huán)境下調控玉米植株生長發(fā)育的QTL/基因挖掘提供新信息。