不同泌乳期和地區(qū)母乳中表皮生長(zhǎng)因子和唾液酸水平分析

周雄，靳登鵬，卜玲玲，柯倩華，劉煥，柳春紅

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院；廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（廣州），廣州 510642）

0 引 言

母乳含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是嬰兒早期的主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，世界衛(wèi)生組織建議在嬰兒出生后的前六個(gè)月，嬰兒唯一的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源應(yīng)該是母乳，而母乳作為嬰兒營(yíng)養(yǎng)的主要來(lái)源應(yīng)該繼續(xù)持續(xù)一到兩年[1-3]。唾液酸(sialic acid，SA)，是一族神經(jīng)氨酸的氮或氧基取代的衍生物，是構(gòu)成糖蛋白、低聚糖和糖脂的重要成分[4]。母乳中唾液酸在嬰兒的生長(zhǎng)、發(fā)育、免疫、認(rèn)知具有重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)增加?jì)雰号浞侥谭壑型僖核岬暮靠梢蕴岣?～6個(gè)月健康嬰兒的認(rèn)知發(fā)育能力[5]。一些研究證明了唾液酸確實(shí)對(duì)嬰兒神經(jīng)系統(tǒng)和大腦的發(fā)育有益，因此，在嬰兒神經(jīng)系統(tǒng)和大腦發(fā)育的關(guān)鍵期應(yīng)多攝入唾液酸[6-8]。母乳中富含唾液酸修飾的人乳寡糖（Human milk oligosaccharides,HMOs），母乳喂養(yǎng)時(shí)，經(jīng)唾液酸修飾的HMOs能在嬰兒相應(yīng)的免疫系統(tǒng)完全建立前幫助嬰幼兒抑制寄生蟲(chóng)、細(xì)菌、病毒的生長(zhǎng)繁殖，抵制病原體的入侵，有助于降低腸道疾病、呼吸道感染的發(fā)病率[9-11]。EGF是一種促細(xì)胞分裂劑，同時(shí)EGF能刺激許多細(xì)胞DNA合成和有絲分裂，其在母乳中刺激DNA合成的效果顯著高于其在血清中效果[12]。EGF是一種刺激消化道細(xì)胞增值分化的一種重要生長(zhǎng)因子，有助于消化道的發(fā)育與成熟[13]。母乳是提供嬰幼兒腸道的EGF的來(lái)源。隨著泌乳期的增加，EGF的含量逐漸下降[14]。研究人員重新評(píng)估羊水和人乳中EGF對(duì)嬰兒小腸細(xì)胞（FHs）的作用，發(fā)現(xiàn)母乳中的EGF對(duì)腸黏膜的成熟和愈合至關(guān)重要[15]。EGF對(duì)低pH和消化酶具有抗性，所以其能夠通過(guò)胃進(jìn)入腸道，促進(jìn)腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)及蛋白質(zhì)的合成。除此之外，EGF還可以通過(guò)抑制胃酸的分泌來(lái)保護(hù)胃黏膜[16]。Khailova L等[18]發(fā)現(xiàn)EGF有多種保護(hù)嬰兒腸道的作用，包括抑制程序性細(xì)胞凋亡，糾正有促炎性TNF-誘導(dǎo)的腸和肝緊密連接蛋白的改變[18]。由此可見(jiàn)，SA和EFG對(duì)于保證嬰兒早期的正常生長(zhǎng)發(fā)育都至關(guān)重要。本研究通過(guò)分析不同泌乳期和地區(qū)母乳中SA和EGF的差異，以期能為嬰兒EGF和唾液酸的合理補(bǔ)充及嬰兒配方奶粉設(shè)計(jì)提供參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 樣本的采集和處理

選擇北京和蘇州兩座城市各7名產(chǎn)婦，收集健康產(chǎn)婦1、2、6月三個(gè)月的母乳，所有樣本采集時(shí)均獲知情同意。每名志愿者收集3 mL母乳分裝凍存于凍存管中，置于-80℃冰箱中凍存。待檢測(cè)時(shí)，樣本置于4℃，待解凍完全后，樣本在4℃，10 000 rpm/min，離心30 min，重復(fù)一次，吸取乳清部分作為待測(cè)樣本。

1.2 材料與試劑

甲醇、乙腈均為色譜純。三氯乙酸、三氟乙酸、硫酸、β-疏基乙醇、無(wú)水硫酸鈉、硫代硫酸鈉、冰乙酸均為分析純，4-5-亞基二氧基-1,2-鄰苯二胺鹽酸鹽為色譜級(jí)別。實(shí)驗(yàn)所用水均為一級(jí)水。

1.3 儀器與設(shè)備

美國(guó)Thermo Fisher公司多功能酶標(biāo)儀，海爾公司-80℃超低溫冰箱，德國(guó)Eppendorf公司超高速離心機(jī)，日本島津LC-20A液相色譜(配有熒光檢測(cè)器)。

1.4 母乳中EGF和SA的檢測(cè)

1.4.1 EGF測(cè)定采用ELISA試劑盒，試劑盒為武漢云克隆公司產(chǎn)品

1.4.2 高效液相色譜法測(cè)母乳中唾液酸的含量[19]

母乳中唾液酸是以游離、與低聚糖結(jié)合的、與蛋白質(zhì)結(jié)合的和以神經(jīng)節(jié)苷脂的形式存在，但是以神經(jīng)節(jié)苷脂的形式存在的唾液酸在母乳中所占比例(＜0.5%)，所以母乳中總唾液酸含量即為游離、與低聚糖結(jié)合和與蛋白結(jié)合的唾液酸含量之和。本研究先檢測(cè)游離和與低聚糖結(jié)合的唾液酸，再檢測(cè)與蛋白質(zhì)結(jié)合的唾液酸，兩者之和即為總唾液酸。

1.4.2.1 游離和與低聚糖結(jié)合唾液酸含量的測(cè)定

用移液槍移取100μL的乳汁溶液于無(wú)菌離心管中，加入400μL的超純水，然后再加入500μL的10%的三氯乙酸溶液沉淀蛋白，混勻后冰浴10 min，然后在3 000 rpm/min的條件下離心30 min,取出上清液至新的離心管中，向沉淀中加入500 uL冷的5%三氯乙酸洗滌，混勻后在4℃，3 000 r/min離心30 min，吸取上清液到第一次的上清中，即合并兩次上清液。合并的上清液加入等體積的0.1 mol/L三氟乙酸，樣品80℃水解30 min，取出后冷卻至室溫，精確吸取冷卻至室溫的溶液90 uL，加入10μL DMB衍生液，50℃避光衍生150 min,冷卻后的溶液經(jīng)過(guò)0.22μm的濾膜過(guò)濾，將過(guò)濾后的溶液進(jìn)行液相色譜分析，此中的唾液酸為母乳中游離和與低聚糖結(jié)合的唾液酸之和。

1.4.2.2 與蛋白結(jié)合唾液酸含量的測(cè)定

于處理后的沉淀中加入2 mL(0.05 mol/L)硫酸，80℃水解120 min，取出后冷卻至室溫，精確吸取上述溶液90μL，加入10μL DMB衍生液50℃避光衍生150 min，冷卻后的溶液經(jīng)過(guò)0.22μm的濾膜過(guò)濾，過(guò)濾后的溶液按液相色譜條件分析。

1.4.2.3 總唾液酸含量

將上述檢測(cè)的兩種含量相加，即為總唾液酸含量。

1.4.2.4 色譜檢測(cè)條件

色譜柱：C-18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)，配Security Guard TM保護(hù)柱；柱溫30℃；檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器，熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)373 nm，發(fā)射波長(zhǎng)448 nm；流動(dòng)相為甲醇-乙腈-超純水(7∶8∶85)；流速為0.9 mL/min；進(jìn)樣體積10μL。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel數(shù)據(jù)庫(kù)錄入，使用SPSSstatistics 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示的形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD），采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較。進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較，若方差齊時(shí)，采用LSD檢驗(yàn)；若方差不齊，采用Tamhane’s檢驗(yàn)，差異顯著水平為P＜0.05，極顯著水平為P＜0.01。

2 結(jié)果與討論

2.1 基本情況

本研究共募集14名產(chǎn)婦，共收集1、2、6月母乳各14份，其中表1是產(chǎn)婦基本信息表。提供樣本的志愿者年齡在21至40歲之間。北京地區(qū)志愿者的平均年齡在32歲左右，而蘇州地區(qū)志愿者的平均年齡在26歲左右，略高于蘇州地區(qū)志愿者的年齡。北京地區(qū)的志愿者的平均體重要略低于蘇州地區(qū)。而兩者的BMI指數(shù)在正常的指標(biāo)內(nèi)（18.5～24）。所有指標(biāo)并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 產(chǎn)婦基本信息統(tǒng)計(jì)表

2.2 EGF含量測(cè)定結(jié)果

不同泌乳期和地區(qū)因素對(duì)母乳中EGF含量的影響如圖1所示，隨著泌乳期的延長(zhǎng)，EGF的含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，北京和蘇州地區(qū)母乳中的EGF含量都是1月最高，分別達(dá)到1.73 ng/mL，1.70 ng/mL。在不同泌乳期的比較中，蘇州地區(qū)6月和1月相比，有顯著差異（P＜0.05）,其余泌乳期并未表現(xiàn)出顯著性（P＞0.05）；同時(shí)在不同地區(qū)比較中，EGF含量差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 不同泌乳期和地區(qū)對(duì)母乳中EGF的影響

母乳中的EGF對(duì)嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。但是隨著泌乳期的延長(zhǎng)，母乳中的EGF含量會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。在嬰幼兒時(shí)期，嬰兒的消化道發(fā)育并不成熟，需要攝入外源性的EGF促進(jìn)消化道的成熟，隨著嬰幼兒的成長(zhǎng)，消化道的發(fā)育逐漸完善，對(duì)外源性的EGF的需求逐漸降低，因此母乳中EGF含量也就出現(xiàn)逐漸下降。蔣嘉靖[20]研究發(fā)現(xiàn)母乳中的EGF隨著泌乳期的延長(zhǎng)，含量逐漸下降，其中第6周時(shí)候母乳中EGF含量為1.94 ng/mL。Power M L等[10]研究發(fā)現(xiàn)隨著泌乳期的增加，EGF的含量逐漸下降，本研究發(fā)現(xiàn)隨著泌乳期的延長(zhǎng)，母乳中的EGF含量逐漸下降，結(jié)果與前人研究一致。本研究中，在不同地區(qū)因素對(duì)母乳中EGF和唾液酸的影響并未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。因此，地區(qū)差異是否影響母乳中某些生物活性物質(zhì)含量還需進(jìn)一步探討。

2.3 唾液酸含量的測(cè)定

2.3.1 游離和低聚糖結(jié)合唾液酸的測(cè)定結(jié)果

不同泌乳期和地區(qū)因素對(duì)母乳游離和低聚糖結(jié)合的唾液酸含量的影響如圖2所示，隨著泌乳期的延長(zhǎng)，母乳中的游離和低聚糖結(jié)合唾液酸的含量呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(shì)，1月母乳中游離的唾液酸含量最高，北京和蘇州地區(qū)母乳中的含量分別達(dá)到467.85 mg/L，404.09 mg/L，在不同泌乳期的差異比較中，2月、6月的北京和蘇州地區(qū)的游離的唾液酸含量與1月的相比有顯著差異（P＜0.05），在不同地區(qū)的差異比較中，未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 不同泌乳期和地區(qū)對(duì)母乳中游離和低聚糖結(jié)合的唾液酸的影響

2.3.2 與蛋白質(zhì)結(jié)合的唾液酸的測(cè)定結(jié)果

不同泌乳期和地區(qū)因素對(duì)母乳中與蛋白質(zhì)結(jié)合的唾液酸含量的影響如圖3所示，隨著泌乳期的延長(zhǎng)，母乳中的與蛋白質(zhì)結(jié)合的唾液酸含量呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(shì)，1月母乳中與蛋白質(zhì)結(jié)合的唾液酸含量最高，北京和蘇州地區(qū)母乳中的含量分別達(dá)到94.99 mg/L，108 mg/L，在不同泌乳期的差異比較中，2月、6月的北京和蘇州地區(qū)的與蛋白質(zhì)結(jié)合的唾液酸含量與1月的相比有顯著差異（P＜0.05）；在不同地區(qū)的差異比較中，未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 不同泌乳期和地區(qū)對(duì)母乳中與蛋白質(zhì)結(jié)合的唾液酸的影響

2.3.3 總唾液酸含量的測(cè)定

不同泌乳期和地區(qū)因素對(duì)母乳中總唾液酸含量的影響如圖4所示，隨著泌乳期的延長(zhǎng)，母乳中的總唾液酸含量呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(shì)，兩個(gè)地區(qū)都是1月母乳中總唾液酸含量最高，北京和蘇州地區(qū)母乳中的含量分別達(dá)到562.85 mg/L，512.46 mg/L，在不同泌乳期的差異比較中，2月、6月的北京和蘇州地區(qū)的與蛋白質(zhì)結(jié)合的唾液酸含量與1月的相比有顯著差異（P＜0.05）；在不同地區(qū)的差異比較中，未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）。

圖4 不同泌乳期和地區(qū)對(duì)母乳中總唾液酸的影響

母乳中含有豐富的唾液酸，是嬰兒早期攝入唾液酸的唯一來(lái)源，但是隨著泌乳期的延長(zhǎng)，母乳中唾液酸的含量逐漸下降。母乳中的唾液酸，在嬰兒早期的成長(zhǎng)具有重要作用，但是其自身的合成能力比較弱，需要攝入比較多的外源性SA，以滿足自身的生長(zhǎng)發(fā)育所需，隨著嬰兒月齡的增長(zhǎng)，其自身合成唾液酸的能力加強(qiáng)，對(duì)外源性SA的需求逐漸降低，因此，母乳中SA的含量逐漸下降。喬陽(yáng)[21]研究發(fā)現(xiàn)母乳中唾液酸的含量隨著泌乳期的延長(zhǎng)，母乳中各種形式的唾液酸含量逐漸降低，第30日母乳中的總唾液酸含量為714.3±64.4 mg/L，同時(shí)隨著泌乳期的延長(zhǎng)，含量逐漸下降。Claumarchirant L等[22]研究發(fā)現(xiàn)馬德里地區(qū)1月的母乳含量為51.0±1.6 mg/100mL，同時(shí)隨著泌乳期的延長(zhǎng)，唾液酸含量逐漸下降，本研究與其報(bào)道結(jié)果一致。同時(shí)Claumarchirant L等[22]發(fā)現(xiàn)西班牙馬德里產(chǎn)婦母乳中的唾液酸含量低于瓦倫西亞（P＜0.05）。這種地域差異可能與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的有關(guān)，例如牛奶，雞蛋和奶酪等富含維生素A的物質(zhì)在瓦倫西亞的攝入比較多，而維生素A會(huì)增加Neu5Ac的合成[23]。

3 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，1、2、6月的母乳中EGF和唾液酸的含量豐富，隨著泌乳期的延長(zhǎng)，母乳中EGF和唾液酸的含量逐漸下降，地區(qū)之間的比較并無(wú)統(tǒng)計(jì)差異，為母乳喂養(yǎng)或者嬰幼兒配方奶粉的改進(jìn)提供了一定的理論依據(jù)，但是關(guān)于母乳中EGF和唾液酸含量隨泌乳期的延長(zhǎng)而下降的機(jī)制，目前尚不明確。