光合作用放氧反應(yīng)＊

張純喜

中國科學(xué)院化學(xué)研究所 光化學(xué)實驗室，北京 100190

光合作用放氧反應(yīng)是植物光系統(tǒng)II(PSII)的特有功能，它是地球上最重要的能量和物質(zhì)轉(zhuǎn)換過程之一[1-4]。通過光合放氧反應(yīng)，植物源源不斷地從水中獲取電子、質(zhì)子，同時釋放出氧氣。對光合放氧反應(yīng)微觀本質(zhì)的研究不僅具有重要的科學(xué)意義，同時也對探索人工高效利用太陽能，解決人類面臨的能源危機(jī)、環(huán)境污染和溫室效應(yīng)問題具有潛在的應(yīng)用價值[5-6]。

1 光系統(tǒng)II結(jié)構(gòu)和光能轉(zhuǎn)換

光合放氧的自然現(xiàn)象早在250年前就被英國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過生物學(xué)家、化學(xué)家和物理學(xué)家的長期努力，目前人們對光合放氧的認(rèn)識已經(jīng)從宏觀進(jìn)入到微觀分子-原子層次[7-8]。在21世紀(jì)初，得益于使用嗜熱藍(lán)藻的PSII生物樣品，人們在PSII放氧復(fù)合體的晶體學(xué)方面取得了突破[9-13]。2001年Zouni等人[9]首次報道了從嗜熱藍(lán)藻中分離的PSII放氧復(fù)合體的3.8 ?分辨率的晶體結(jié)構(gòu)；2004年Ferreira等人[10]報道了3.5 ?分辨率的PSII晶體結(jié)構(gòu)，解析出PSII中大部分蛋白和色素分子的空間結(jié)構(gòu)，并辨別出光合作用放氧中心(OEC)是一個Mn4CaO4簇合物。2011年Umena等人[11]報道了1.9 ?高分辨率的PSII晶體結(jié)構(gòu)(圖1(a))，首次揭示出OEC的詳細(xì)結(jié)構(gòu)，該工作是半個世紀(jì)以來光合放氧研究領(lǐng)域中最重要的進(jìn)展。

PSII通常以二聚體形式存在，每個單體擁有20多個蛋白質(zhì)亞基(如D1、D2、CP43、CP47、PsbO等)，其整體結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示[11,14]。PSII核心含有4個葉綠素分子、2個去鎂葉綠素分子、2個質(zhì)體醌分子(QA、QB)、1個非血紅素Fe離子(與4個組氨酸的咪唑環(huán)和1個HCO3-/CO32-配位)，它們排布成近似左右對稱的兩條電子轉(zhuǎn)移鏈(圖1(b))。PSII核心色素分子被光激發(fā)后，發(fā)生原初電荷分離，產(chǎn)生正離子自由基(P680＋?)和負(fù)離子自由基 (Pheo-?)[15-16]。其中：Pheo-?具有很強(qiáng)的還原性(還原電位為－0.42 V)，它推動受體側(cè)非血紅素Fe催化質(zhì)體醌QB的還原反應(yīng)；P680＋?具有很高的氧化性(氧化電位可達(dá)+1.25 V)，它驅(qū)動放氧中心(OEC)催化水氧化反應(yīng)[2]。

圖1 PSII整體結(jié)構(gòu)(a)和核心輔基空間排布(b)

TyrZ和QA是PSII中擔(dān)負(fù)調(diào)控快速原初光化學(xué)反應(yīng)(單電子反應(yīng))和緩慢催化反應(yīng)(包括給體側(cè)四電子、四質(zhì)子的水催化氧化反應(yīng)和受體側(cè)兩電子、兩質(zhì)子的醌催化還原反應(yīng))的兩個關(guān)鍵樞紐[17-18]。前期我們借助于液氦溫度電子順磁共振(EPR)技術(shù)，通過原位誘導(dǎo)、原位探測的方法在具有放氧活性的PSII樣品中同時成功探測到TyrZ和QA中間體(TyrZ?和QA-?)EPR信號[19-21](圖2)，并提出它們通過兩種氫鍵調(diào)控光系統(tǒng)II兩側(cè)電子轉(zhuǎn)移和催化反應(yīng)的機(jī)理模型[6,18,22](圖3)。

圖2 活性PSII中 TyrZ?和QA-?的EPR信號

如圖3所示，給體側(cè)(左側(cè))TyrZ與His190之間氫鍵強(qiáng)度經(jīng)歷“強(qiáng)→弱→強(qiáng)”變化[22]，受體側(cè)(右側(cè))QA與His214之間氫鍵強(qiáng)度經(jīng)歷“弱→強(qiáng)→弱”變化[23]。由于強(qiáng)氫鍵向弱氫鍵轉(zhuǎn)變過程中可產(chǎn)生10～20 kcal/mol的能量變化[24-25]，這種氫鍵強(qiáng)度的可逆變化可以有效穩(wěn)定高活性電子轉(zhuǎn)移中間體。PSII兩側(cè)的氫鍵強(qiáng)度可逆變化能保證電子源源不斷地從給體側(cè)向受體側(cè)傳遞，避免電子逆向傳遞，從而防止電荷復(fù)合的發(fā)生，維持PSII高效的光能轉(zhuǎn)換[6]。

圖3 PSII中氫鍵調(diào)控光反應(yīng)和催化反應(yīng)的機(jī)理模型

2 光合作用放氧催化中心

OEC是PSII最關(guān)鍵的組分，它也是自然界唯一能高效、安全地將水裂解，釋放出電子、質(zhì)子和氧氣的生物催化劑[14,26-27]。OEC結(jié)構(gòu)和催化原理一直是光合作用領(lǐng)域最受關(guān)注的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。早在40多年前人們就知道OEC的核心由4個Mn離子和1個Ca離子組成[28-29]。20世紀(jì)末，人們依據(jù)EPR、EXAFS(擴(kuò)展X射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu))等光譜測定和理論計算提出了多種OEC的結(jié)構(gòu)模型[30-33]。1999年我們團(tuán)隊提出了如圖4(a)所示的OEC結(jié)構(gòu)模型[34]，首次提出關(guān)鍵輔基Ca離子位于OEC的中心，它通過3個氧橋(μ-O)、2個羧基與4個Mn離子結(jié)合。

圖4 OEC的結(jié)構(gòu)模型(a)和晶體結(jié)構(gòu)示意圖(b)

2011年Umena等人[11]報道了1.9 ?分辨率的PSII晶體結(jié)構(gòu)，首次揭示出OEC核心骨架及其配體環(huán)境的詳細(xì)結(jié)構(gòu)信息(圖4(b))。OEC的核心骨架中4個Mn離子和1個Ca離子通過5個μ-O連接成1個不對稱的Mn4CaO5簇。OEC的外圍配體由6個羧基、1個咪唑環(huán)和4個水分子提供。在此結(jié)構(gòu)中，Ca離子通過3個μ-O橋、2個羧基與4個Mn離子結(jié)合，這一結(jié)構(gòu)特征證實了我們1999年提出的OEC結(jié)構(gòu)模型[34]。

OEC在催化放氧過程中經(jīng)歷5種不同的狀態(tài)(S0、S1、S2、S3、S4態(tài))[26,35-36](圖5)。其中：S0態(tài)是起始態(tài)；S1態(tài)是黑暗穩(wěn)定態(tài)；S2和S3態(tài)為高氧化態(tài)；S4態(tài)是一個瞬態(tài)，它能夠結(jié)合水分子并很快釋放氧氣恢復(fù)到S0態(tài)。在此催化循環(huán)過程中，伴隨著電子、質(zhì)子的轉(zhuǎn)移和釋放，4個Mn離子的價態(tài)和OEC自身空間結(jié)構(gòu)都會發(fā)生變化。OEC中4個Mn離子的價態(tài)[26,37]分別是S0(＋3、＋3、＋3、＋4)或(＋2、＋3、＋4、＋4)、S1(＋3、＋3、＋4、＋4)、S2(＋3、＋4、＋4、＋4)、S3(＋4、＋4、＋4、＋4)。由于在實驗中難以捕捉S4，目前S4態(tài)中錳離子的價態(tài)仍然未知。圖4(b)給出的是S1態(tài)OEC的結(jié)構(gòu)。近幾年，S0、S2、S3態(tài)的OEC結(jié)構(gòu)也陸續(xù)有報道[38-41]，但實際測試樣品中混有多種不同狀態(tài)的OEC，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)分析和指認(rèn)困難，同時在結(jié)構(gòu)測試過程中X射線對OEC結(jié)構(gòu)有破壞作用，導(dǎo)致這些結(jié)構(gòu)仍然存在不確定性[8,42-43]。最近人們依據(jù)S1態(tài)OEC的結(jié)構(gòu)和理論計算提出了多種光合放氧機(jī)理模型[7,38,44-50]，但尚無一種被廣泛認(rèn)可[8]。目前光合放氧機(jī)理方面有許多重要的科學(xué)問題仍有待研究。例如：①O-O鍵如何形成？②Ca離子如何發(fā)揮作用？③底物水分子的結(jié)合位點(diǎn)在哪？④OEC的構(gòu)型如何變化？對于這些問題的回答將是今后光合放氧研究的重點(diǎn)。

圖5 OEC催化放氧反應(yīng)過程中錳離子的價態(tài)變化及電子、質(zhì)子釋放示意圖

3 光合放氧中心的生物合成

OEC的催化功能與其自身特殊結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，也與PSII的蛋白環(huán)境密切相關(guān)。在PSII中，OEC主要結(jié)合在D1蛋白亞基上。大量研究顯示，在日照條件下D1蛋白會發(fā)生光破壞而喪失功能，而光合生物為維持有效安全的光能利用，受到破壞的D1蛋白會不斷地被新合成的D1蛋白所替代[51-53]。通常在日照條件下D1蛋白的壽命只有約30 min[54]。伴隨著舊的D1蛋白降解和新的D1蛋白重組，OEC也經(jīng)歷著降解和再合成[51](圖6)。PSII的外周蛋白(藍(lán)藻中為PsbO、PsbV、PsbU；高等植物及真核藻類為PsbO、PsbQ、PsbP)在穩(wěn)定OEC方面發(fā)揮重要作用[55]。特別是PsbO蛋白，其解離會使OEC暴露于水相環(huán)境，導(dǎo)致OEC很快解離成游離Ca2+和Mn2+。光系統(tǒng)II核心蛋白和OEC的降解和修復(fù)過程如圖6所示。

圖6 PSII核心蛋白和OEC的降解與組裝原理圖

因為OEC的組裝需要光的參與，所以O(shè)EC的組裝過程又被稱為光組裝(photo-assemble)或光活化(photo-activation)過程[56]。OEC能進(jìn)行組裝的前提條件是PSII蛋白框架(主要包括D1、D2、CP43、CP47、Cytb559、PsbO等)能夠提供一個可接納OEC的微環(huán)境 (如圖7所示)。得益于分子生物學(xué)[57-58]和不同PSII樣品(包括具有放氧活性的PSII、OEC缺失的PSII、OEC組裝前PSII樣品)的結(jié)構(gòu)解析[11,59-61]，人們發(fā)現(xiàn)OEC的微環(huán)境存在6～7個羧基、2～3個咪唑環(huán)殘基和水分子，呈弱酸性(pH為5～6)。組裝前的PSII被稱為Apo-PSII。Apo-PSII結(jié)合游離Mn2+和Ca2+，在光驅(qū)動下，Mn2+被逐步氧化為高價錳離子(Mn3+/Mn4+)，最終形成Mn4CaO5簇合物。由于難以獲得OEC組裝中間體的確切結(jié)構(gòu)信息，目前人們對OEC組裝機(jī)理的認(rèn)識還非常有限，遠(yuǎn)未達(dá)到在分子-原子層次闡明OEC的組裝規(guī)律[54,62-63]。此外，需要說明的是，通常OEC的組裝研究都是在體外進(jìn)行，而體外組裝所得PSII放氧活性均顯著低于正常生理條件下PSII的放氧活性[62]，因此體外OEC組裝實驗?zāi)芊駵?zhǔn)確反映光合生物體內(nèi)OEC的組裝規(guī)律仍然是個懸而未決的問題。

圖7 光合生物中OEC所處的蛋白微環(huán)境

在生理條件下，OEC的降解和組裝時刻都在發(fā)生，因此OEC核心骨架和配體環(huán)境除了要滿足高效、安全地催化水氧化的功能外，還必須滿足OEC降解和組裝兩個過程都能有效和安全地進(jìn)行。這就要求OEC自身的結(jié)構(gòu)不能太穩(wěn)定，否則無法有效降解；同時OEC的合成條件不能太苛刻，過程不能太復(fù)雜，否則無法快速合成。由此可見，在探討OEC各組分的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系時，不僅要考慮它們在水氧化過程中的作用，同時也需要考慮其在OEC降解和組裝過程中所發(fā)揮的作用。

4 光合放氧中心的人工合成

人工合成光合作用OEC，以取之不竭的太陽能驅(qū)動水裂解來獲取清潔能源(氫能或電能)，被認(rèn)為是解決人類社會面臨的能源危機(jī)、環(huán)境污染和溫室效應(yīng)問題的理想途徑。這方面的研究具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值，同時也是廣受關(guān)注的重要科學(xué)前沿[3,5,14,64]。

光合作用OEC的空間結(jié)構(gòu)解析為人工合成OEC提供了重要的依據(jù)，但如何實現(xiàn)OEC的人工合成卻是一個極具挑戰(zhàn)性的科學(xué)難題，有一系列合成問題需要解決[65-66]。例如：①如何將Ca2+鑲嵌在Mn簇中？②如何模擬生物配體環(huán)境？③如何合成不對稱Mn4CaO5核心骨架？④如何穩(wěn)定高氧化性的催化中心？

自20世紀(jì)末以來，國際上很多研究小組嘗試人工合成OEC，并報道了大量含錳簇合物[67-72]。2015年之前人們基本上都局限在對OEC的局部結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行模擬，如何實現(xiàn)對OEC整體結(jié)構(gòu)的模擬則是一個巨大的挑戰(zhàn)[65]。我們團(tuán)隊基于對生物OEC的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理的長期研究，2014年以來開展了一系列OEC的仿生模擬研究[73-76]，并先后解決了Ca/Sr離子難與Mn簇結(jié)合和難以在高價Mn簇中引入生物配體的合成難題。2015年受生物OEC組裝的啟示，我們首次成功合成出不對稱的仿生Mn4CaO4簇合物[77](圖8)。

圖8 OEC(左)和仿生OEC(右)的結(jié)構(gòu)比較[77]

在仿生Mn4CaO4簇合物中，4個Mn離子和1個Ca離子通過4個μ-O橋構(gòu)成1個不對稱的Mn4CaO4核心骨架，其外圍由8個羧酸根陰離子、2個羧酸分子和1個吡啶分子提供配位。仿生Mn4CaO4簇合物中4個Mn離子的價態(tài)(+3、+3、+4、+4)與生物OEC(S1態(tài))完全一樣(圖8)。該化合物被單電子氧化后能夠觀察到類似于OEC(S2態(tài))樣品所擁有的g=2和g=4兩種EPR信號[77]。這些結(jié)果顯示仿生Mn4CaO4簇合物與OEC不僅空間結(jié)構(gòu)上非常類似，而且電子結(jié)構(gòu)也類似。仿生Mn4CaO4簇合物的電化學(xué)測定(圖9)揭示它也能夠進(jìn)行4個電子的氧化-還原反應(yīng)，其中S1→S2轉(zhuǎn)變的中電位為+0.8 V，它與OEC對應(yīng)S1→S2的中電位基本一致。此外，我們還觀察到仿生Mn4CaO4簇合物在有少量水(＜1.0%)存在時，能夠在電極表面催化水裂解，給出顯著的催化電流[77]。這些研究揭示仿生Mn4CaO4簇合物不僅在結(jié)構(gòu)上與OEC類似，而且在理化性能上也與OEC類似。這類仿生Mn4CaO4簇合物的獲得為今后研究OEC的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理提供了理想的化學(xué)模型，同時為今后制備廉價、高效的人工水裂解催化劑奠定了重要的基礎(chǔ)[78]。

圖9 Mn4CaO4簇合物的氧化還原特性[77]

2019年通過對上述仿生Mn4CaO4簇合物中鈣離子上配體的替換，我們成功制備出能夠在極性有機(jī)溶劑(包括CH3CN、DMF)中可以穩(wěn)定4～6周的新型Mn4CaO4簇合物[43](圖10)。這類新型化合物除鈣離子的配體外，其他部分與圖8的仿生Mn4CaO4簇合物完全一樣，其錳離子的價態(tài)也與前期Mn4CaO4簇合物一樣。鈣離子上2個溶劑分子(如DMF)的引入使仿生Mn4CaO4簇合物與生物OEC的結(jié)構(gòu)更加接近。

圖10 兩種含溶劑分子的新型仿生Mn4CaO4簇合物[43]

圖8和圖10仿生Mn4CaO4簇合物的制備、結(jié)構(gòu)和理化性能均說明Mn4CaO4核心是個熱力學(xué)非常穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)單元，這可能是大自然為什么選擇類似簇合物作為光合放氧中心的一個重要原因[79]。但需要特別指出的是，目前我們制備的所有仿生Mn4CaO4簇合物均缺少與OEC中類似的一個μ2-O橋(在仿生簇合物中對應(yīng)位置被一個羧基橋替代)[80-81]。能否在仿生Mn4CaO4簇合物的Mn3和Mn4之間引入這一μ2-O氧橋?qū)⑹墙窈笕斯ず铣蒓EC研究中令人期待的一個研究方向。此外，能否突破生物OEC對Mn離子、Ca離子的依賴性，人工合成更穩(wěn)定、更高效的仿生OEC同樣非常令人期待。這些方面的深入研究不僅能加深我們對自然光合放氧微觀本質(zhì)的認(rèn)識，同時也會推動人工光合作用的研究進(jìn)程。

5 結(jié)論與展望

綜上所述，近年來光合生物的PSII晶體結(jié)構(gòu)研究取得了突破性進(jìn)展，光合放氧中心Mn4CaO5簇合物的詳細(xì)結(jié)構(gòu)已被揭示。光合生物的OEC具備三個重要特點(diǎn)：一、正常條件下，OEC能高效、安全地催化放氧反應(yīng)；二、在PSII的D1蛋白發(fā)生破壞時，OEC能被快速降解；三、在PSII的D1蛋白被修復(fù)時，OEC能被快速合成。最近我們借鑒OEC的生物組裝條件成功合成出結(jié)構(gòu)和理化性能均與OEC類似的系列仿生Mn4Ca-簇合物，為研究OEC的微觀原理提供了理想的化學(xué)模型。但目前無論自然光合放氧研究，還是人工光合放氧研究都還有許多科學(xué)問題亟待解答，它們包括：①生理條件下OEC的組裝規(guī)律；②OEC催化放氧的機(jī)理；③能否借鑒OEC的結(jié)構(gòu)，發(fā)展穩(wěn)定、高效、廉價的仿生水裂解催化劑？④能否構(gòu)建高效人工光驅(qū)動水裂解體系，獲取清潔能源(氫能或電能)？對這些問題的深入研究將會有助于人們對自然光合放氧反應(yīng)微觀本質(zhì)的認(rèn)識，同時也會推動人工光合作用利用太陽能裂解水來獲得清潔能源(電能或氫能)的研究進(jìn)程。

致謝 研究工作受到國家自然科學(xué)基金(31770258、91961203)的資助；感謝陳長輝博士和姚若青同學(xué)在稿件準(zhǔn)備中提供的幫助。